肿瘤自靶向多级响应型介孔硅递药系统及其制备方法与流程

本发明涉及肿瘤靶向药物研发和药物控释领域，具体涉及一种肿瘤自靶向多级响应型介孔硅递药系统及其制备方法。

背景技术：

近年来，恶性肿瘤仍是困扰现代人类的重大威胁，而化学治疗依旧是对抗恶性肿瘤的有力手段。在化疗应用中，纳米颗粒因其出色的组织渗透能力与载药能力已被广泛开发作为药物载体以实现更高效的药物输送。其中，介孔硅纳米颗粒因其具有载荷效率大，生物相容性好，表面可修饰等优点，为功能化药物载体的设计提供了理想的基质。

然而，单纯的纳米颗粒通常难以响应体内物理、化学和生理环境的变化以实现精准的药物释放。因此，通过对纳米颗粒进行合理的表面化学改性和生物学修饰，便可以根据已知的条件智能调控药物释放。基于此，多种“守门员”分子已被开发用于修饰纳米颗粒表面充当“门控”分子以响应ph值、温度、光照等刺激条件。

在实际应用中，单一刺激响应的药物载体往往会发生药物的过早释放，导致抗肿瘤治疗效果大打折扣，甚至由于药物泄露危害到正常组织。因此，应引入简便有多效的响应刺激模式可以进一步实现精准的药物释放。

由于肿瘤细胞的过度代谢往往会引起糖酵解上调，进而导致局部肿瘤病变组织呈现较高的温度和偏酸性的介质环境，这为可控药物释放提供了潜在的触发“开关”。基于多刺激模式的构想，ph值和温度双响应药物载体可以更好地契合肿瘤微环境，从而实现智能药物释放。

在“门控”分子的选择上，n-异丙基丙烯酰胺是一种对温度敏感的聚合物，它倾向于在临界温度(32℃)以上拉伸，同时在临界温度下维持紧密构象且难以溶解。此外，甲基丙烯酸(maa)是另一种对ph值敏感的化合物。当maa处于中性和碱性环境中时构象紧实，而在较低ph值下会质子化并使构象松散。这两种化合物的组合可以作为控制药物释放的双重“开关”，在肿瘤治疗应用中显示出一定应用前景。

作为恶性癌症之一的乳腺癌对于仍然是一项不可忽视的健康问题。其中，人表皮生长因子受体2(her2)是典型的致癌基因，而其过表达被认为是疾病进展的主要原因。在乳腺癌患者中，her2阳性乳腺癌患者约占整体患者的20％-30％，且常伴有疾病转移风险。而近年来，基因导向策略已渐渐被应用于应对这种重症情况以增强普通化疗。将特异性抗体与纳米载体进行缀合修饰后，可以借助抗原-抗体特异性识别，高效地将纳米载体运输至肿瘤部位并释放其中的药物以增强抗癌治疗效果，同时避免纳米载体在正常组织中脱靶从而降低非特异性组织损伤。在抗体介导的肿瘤靶向策略中，人源化的单链抗体具有低成本易生产、易化学修饰、低免疫原性和高生物活性等特点，可进一步在实际应用中保持较强的受体识别能力，同时降低其对正常机体的副作用，达到“减量增效”的肿瘤靶向效果。因此，采用her2单链抗体修饰的基因导向策略对于精确治疗her2阳性乳腺癌具有一定潜力和应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的是克服了上述现有技术的缺点，提供了一种肿瘤自靶向多级响应型介孔硅递药系统的制备方法，具有高生物相容性、特异靶向性与多重响应性的特点，提高纳米载体输送化疗药物的精准性和可控性，提高载体的生物安全性，克服传统单响应释药的局限性。

为了实现上述目的，本发明提供了一种肿瘤自靶向多级响应型介孔硅递药系统，具体如下：

所述的递药系统包括介孔硅纳米颗粒，所述的介孔硅纳米颗粒负载有抗肿瘤药，且所述的介孔硅纳米颗粒的表面修饰有聚合物层和低毒性的肿瘤靶向单链抗体，使得所述的递药系统具有乳腺癌细胞靶向性、温度响应性和ph响应性。

较佳地，所述的抗肿瘤药为疏水性抗肿瘤药物。

较佳地，所述的聚合物层中的聚合物为n-异丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸共聚物。该nipam/maa聚合物为本发明的介孔硅智能递药系统的温度和ph双响应层。

较佳地，所述的低毒性的肿瘤靶向单链抗体为抗her2单链抗体。本发明提供的介孔硅智能递药系统的表面嫁接了抗her2单链抗体，具有良好的生物相容性，可特异性结合her2阳性乳腺癌细胞表面高表达的受体蛋白her2，从而实现肿瘤定向靶向。

本发明还提供了一种所述的肿瘤自靶向多级响应型介孔硅递药系统的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：

(1)合成单分散介孔硅纳米颗粒msn；

(2)制备甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的复合颗粒dox@msn-mps；

(3)制备聚合物层修饰的复合颗粒dox@msn-pnipam/maa；

(4)制备肿瘤靶向单链抗体修饰的复合颗粒dox@msn-pnipam/maa-her2。

较佳地，所述的步骤(1)具体为：

使用溶胶-凝胶法制备合成，在离心收集后反复洗涤，得到单分散的msn。

较佳地，所述的步骤(2)具体为：

将msn分散于乙醇，加入甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷mps，反应后离心收集得到mps修饰的msn；

将msn-mps分散于乙醇，加入盐酸溶液，反应后得到去除模板的硅基化msn-mps；

将去除模板的硅基化msn-mps和抗肿瘤药分散于水中，反应后收集得到负载抗肿瘤药并去除模板的复合颗粒dox@msn-mps。

较佳地，所述的步骤(3)具体为：

将n-异丙基丙烯酰胺nipam和甲基丙烯酸maa共聚物溶解于水，加入dox@msn-mps和过硫酸钾，在氮气保护下反应得到修饰有聚合物层的复合颗粒dox@msn-pnipam/maa。

较佳地，所述的步骤(4)具体为：

在her2单链抗体溶液中，加入n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，对her2单链抗体上的羧基活化，例如1h，再将dox@msn-pnipam/maa超声分散于混合液中，反应得到肿瘤靶向单链抗体修饰的复合颗粒dox@msn-pnipam/maa-her2。

本发明的有益效果为：

1、本发明依托肿瘤细胞内酸性高温环境，实现双重药物控释，大大减少药物的提前泄露，降低对正常细胞的损伤，实现稳定可控的药物释放，提升治疗效果；

2、本发明通过纳米颗粒对肿瘤her2受体的定点靶向性，提高乳腺癌细胞对纳米载体的内吞，增强药物传递与抗肿瘤治疗效果；

3、本发明通过层层组装的策略进行构建，可扩展用于其他的纳米材料载药系统。

附图说明

图1a为负载阿霉素的复合介孔硅纳米颗粒的制备流程图片。

图1b为负载阿霉素的复合介孔硅纳米颗粒在人体的作用图。

图2a和2b分别为介孔硅纳米颗粒修饰前后的透射电镜(tem)图片。

图3a和3b分别为介孔硅纳米颗粒的细胞相容性和血液相容性。

图4为负载阿霉素的复合介孔硅纳米颗粒在不同温度与ph值条件下的累积药物释放曲线。

图5a和5b分别为肿瘤细胞和正常细胞对复合介孔硅纳米颗粒的摄取能力图片。

图6a和6b分别为负载阿霉素的复合介孔硅纳米颗粒对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤能力图片。

图7a和7b分别为负载阿霉素的复合介孔硅纳米颗粒对小鼠体内肿瘤细胞的杀伤能力图片。

具体实施方式

为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进一步的描述。

实施例1：温度和ph双响应和肿瘤靶向性的介孔硅递药系统的制备和表征

如图1a所示，本发明提供了一种高生物相容性肿瘤靶向智能多响应介孔硅递药系统及其制备方法，包括：合成制备介孔硅纳米颗粒，硅基化后负载抗肿瘤药物，随后共价修饰n-异丙基丙烯酰胺(nipam)和甲基丙烯酸(maa)共聚物，并嫁接抗her2单链抗体，从而得到具有肿瘤靶向性以及温度与ph双响应性的纳米颗粒。

其中，通过在合成的介孔硅纳米颗粒表面修饰硅烷偶联剂mps，在介孔硅纳米颗粒的孔道内负载抗肿瘤药物；通过高分子沉淀聚合作用修饰温度与ph双响应层；通过缩合反应在修饰后的纳米颗粒表面嫁接抗her2单链抗体，制得复合纳米颗粒。

如图1b所示，本发明提供的高生物相容性肿瘤靶向智能多响应介孔硅递药系统，具有良好的生物相容性、her2高表达乳腺癌细胞的特异靶向性与温度和ph双响应的药物控释性，可以在提升肿瘤特异性识别的同时实现安全可控的药物释放。

本发明提供的一种高生物相容性肿瘤靶向智能多响应介孔硅递药系统的制备方法，包括如下合成步骤：

称取0.75g十六烷基三甲基溴化铵(ctab)加入360ml去离子水，随后滴加2.625ml的2mol/l氢氧化钠溶液；将该混合溶液加热至80℃，反应2小时后在12100rpm条件下离心15分钟后收集；弃去所收集溶液的上清液，分别使用去离子水与乙醇各洗涤3次沉淀，所得产物在40℃下真空干燥，得到单分散的介孔硅纳米颗粒(msn)；

称取1.5g的msn，超声分散于360ml乙醇；随后，在分散液中加入0.6mlmps，在80℃下反应12小时，在12100rpm条件下离心15分钟收集产物，使用去离子水与乙醇各洗涤3次沉淀，所得产物在40℃下真空干燥，得到硅基化msn(msn-mps-ctab)；

将1.5g的msn-mps分散于360ml乙醇中，加入40ml的2mol/l盐酸溶液，在80℃下反应24小时，以去除模板ctab，离心收集并使用去离子水与乙醇反复洗涤沉淀，所得产物在40℃下真空干燥，得到去除模板的硅基化msn(msn-mps)；最后，将msn-mps与阿霉素超声分散于去离子水中，避光反应24小时，离心收集已负载阿霉素的纳米颗粒(dox@msn-mps)，使用紫外可见光分光光度计测定上层清液，确定阿霉素的吸附量；

称取250mgdox@msn-mps，625mgnipam，11.5mg十二烷基磺酸钠(sds)和30mgn,n-亚甲基双丙烯酰胺(mba)，量取38μlmaa，溶解于200ml去离子水；随后，加入45mg过硫酸钾，在氮气保护与70℃条件下反应4小时，离心收集产物并使用去离子水和乙醇反复洗涤，40℃真空干燥后得到复合纳米颗粒dox@msn-pnipam/maa；

挑选含有抗her2单链抗体转化子的毕赤酵母，接种到bmgy培养基中，利用甲醇诱导蛋白表达，测定蛋白含量后收集备用。称取80mgmsn-pnipam/maa，182.5mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和125mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)，加入100ml去离子水中。随后加入100ml，91μg/ml的her2单链抗体溶液，室温反应24小时后离心收集并用去离子水和乙醇反复洗涤，40℃真空干燥后得到抗体化纳米颗粒(dox@msn-pnipam/maa-her2)。

透射电镜检查结果表明，单分散的介孔硅纳米颗粒大小均一，孔道清晰可见(图2a)；而修饰了nipam/maa层后，可在介孔硅纳米颗粒外层看到明显的壳层结构(图2b)。

实施例2：细胞相容性和血液相容性

实验步骤如下：

将her2受体高表达的人乳腺癌细胞(sk-br-3)传代培养，按5千/孔铺于96孔板，培育24小时后，分别加入msn或msn-pnipam/maa-her2，使颗粒终浓度为0，5，10，50，100，200，500μg/ml，继续孵育24小时；

随后，取出孔板并在每孔加入四甲基偶氮唑兰(mtt)，再放入37℃、5％co2培养箱中培养4小时；

最后，取出孔板吸去上清液，加入二甲基亚砜(dmso)，振荡10分钟后于酶标仪测定每孔的吸光度，记浓度为0μg/ml时的相对细胞活力为100％。

实验结果，如图3a所示，在同颗粒浓度下，msn-pnipam/maa-her2处理后的细胞活力均高于msn颗粒处理后；而对于msn-pnipam/maa-her2颗粒处理组，在500μg/ml的高浓度下sk-br-3细胞存活率仍保持80％以上。

以上结果表明所制备的复合纳米颗粒由于共聚物的保护以及所修饰her2单链条抗体的低毒性，因而具有良好的细胞相容性。

此外，收集一定量的红细胞重悬浮至生理盐水中，并调节浓度至2％。将合成所得的纳米颗粒msn和msn-pnipam/maa-her2)添加其中，使终浓度为0，5，10，25，50，100，200，500μg/ml。同时，将去离子水作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照，分别配制2％的红细胞溶液。

溶血情况以溶血百分比表示，计算方式如下：溶血百分比(％)＝(as-a-)/(a+-a-)×100，其中as代表样品的吸光度，a+代表阳性对照的吸光度，a-代表阴性对照的吸光度。

实验结果，如图3b所示，随着颗粒浓度的增加，msn颗粒处理后的组别产生严重的溶血；而对于msn-pnipam/maa-her2颗粒处理组，在500μg/ml的高浓度下溶血百分比仍低于5％。

以上结果表明所制备的复合纳米颗粒上的共聚物层可防止纯msn颗粒与红细胞直接接触而使之产生溶血，因而相对于纯msn颗粒，具有更佳的血液相容性。

实施例3：温度和ph双重响应药物释放

实验步骤：

配制ph7.4的磷酸盐缓冲液(模拟人体血液ph值)和ph5.0的磷酸盐缓冲液(模拟人体肿瘤组织胞内ph值)；

将2mg的dox@msn-pnipam/maa-her2分散于磷酸盐缓冲液中，在37℃和25℃的温度下进行反应；

在一定的时间间隔内取上清液，使用紫外可见光分光光度计检测，根据各个时间点累积释放的药物量与总负载药物量的比值绘制累积释放曲线。

如图4所示，当使用高温(41℃)和酸性(ph5.0)两种刺激共同触发药物释放时，得到的药物释放更快且释放量高于仅设置单一刺激条件的情形，表明修饰后的介孔硅纳米颗粒具有温度和ph双重响应的药物释放行为，且具有比单一响应更佳的药物释放效率，有望响应肿瘤微环境的高温与酸性环境。同时，在25℃，ph7.4条件下，24小时的累积释放率低于10％，表明修饰后的介孔硅纳米颗粒可以有效包封药物，减少药物提前泄露。

实施例4：细胞摄取能力实验

实验步骤：

将her2受体高表达的人乳腺癌细胞(sk-br-3)与her2受体不表达的人正常肝细胞细胞(l-02)分别传代培养，按1万/孔铺于96孔板，分别加入fitc标记后的复合介孔硅纳米颗粒(msn-pnipam/maa-her2或msn-pnipam/maa)，继续培养4小时；

随后，使用hoechst33258进行细胞核染色，并用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察细胞内纳米颗粒含量。

hoechst33258是蓝色荧光染料，fitc是绿色荧光染料，而阿霉素在紫外光下显自发的红色荧光。

如图5a所示，实验结果显示dox@msn-pnipam/maa-her2进入sk-br-3细胞的量呈时间依赖性增大。

如图5b所示，在同等条件下内吞4小时后，dox@msn-pnipam/maa-her2进入sk-br-3细胞的量高于其进入l-02细胞的量，表明修饰后的介孔硅纳米颗粒可以特异性地识别her2受体，从而增强her2高表达的乳腺癌细胞的内吞能力。

实施例5：体外肿瘤细胞杀伤能力实验

实验步骤：

将her2受体高表达的人乳腺癌细胞(sk-br-3)与her2受体不表达的正常人肝细胞(l-02)分别传代培养，按1万/孔的密度铺于96孔板，分为游离阿霉素，dox@msn-pnipam/maa和dox@msn-pnipam/maa-her2共3个组别，每组设置阿霉素浓度为0.5，1，2，4和8μg/ml共5个浓度梯度；

将各浓度的游离阿霉素，dox@msn-pnipam/maa和dox@msn-pnipam/maa-her2粒子分散液加入各细胞孔，于37℃、5％co2培养箱中孵育4h；

随后，取出孔板并在每孔加入四甲基偶氮唑兰(mtt)，再放入37℃、5％co2培养箱中培养4小时；

最后，取出孔板吸去上清液，加入二甲基亚砜(dmso)，振荡10分钟后于酶标仪测定每孔的吸光度。

如图6a所示，随着浓度的递增，3种粒子处理后的sk-br-3细胞活性均随着粒子浓度的增大而降低，说明高浓度的药物和使用载体的药物都可以对肿瘤细胞起到杀伤作用。此外，dox@msn-pnipam/maa-her2作用后细胞的存活率要低于仅受dox作用或受dox@msn-pnipam/maa作用后细胞的存活率，说明修饰有her2单链抗体的粒子比起未修饰抗体的粒子更易被her2受体高表达的肿瘤细胞摄取，同时伴随着肿瘤细胞内的偏高温和偏酸性环境，可以促进内载药物的大量释放，治疗效果优于单纯游离药物。

另外，如图6b所示，3种粒子处理后的l-02细胞活性在各阿霉素浓度下无显著差异，说明所合成的复合介孔硅纳米颗粒对her2不表达的正常细胞不会产生额外靶向伤害。

以上结果表明，修饰有her2单链抗体和nipam/maa层的介孔硅纳米颗粒负载阿霉素后的肿瘤细胞杀伤能力强于未加修饰的介孔硅纳米颗粒，且不会对正常细胞产生误伤。

实施例6：体内肿瘤细胞杀伤能力实验

实验步骤：

选用和sk-br-3细胞构建乳腺癌动物模型，选取4～5周龄的健康balb/c裸鼠，分为磷酸缓冲液(control)，msn-pnipam/maa，游离dox，dox@msn-pnipam/maa和dox@msn-pnipam/maa-her2共5个组别，每组有4只裸鼠；

将sk-br-3细胞传代并培养24h后用于构建乳腺癌动物模型；

调整sk-br-3细胞密度为50万/ml，用胰岛素注射器将0.2mlsk-br-3细胞注射入裸鼠右后腿部，使每只裸鼠接种细胞量为10万；

当肿瘤生长至约150mm³后，静脉注射0.1ml实验药物或载药粒子；

14天后，对裸鼠实行安乐死，并对肿瘤组织进行病理组织学检查。

如图7a和7b所示，dox@msn-pnipam/maa-her2组的肿瘤杀伤能力高于磷酸缓冲液空白组，且高于dox@msn-pnipam/maa组，说明相较于不含抗体的复合纳米颗粒，含有her2单链抗体的复合纳米颗粒因其对her2高表达sk-br-3细胞的高靶向性而具有更强的治疗效果。同时，dox@msn-pnipam/maa-her2组的肿瘤杀伤能力优于游离阿霉素治疗组，进一步说明相较于单阿霉素治疗，复合介孔硅纳米颗粒负载阿霉素后具有her2受体高靶向性和肿瘤微环境双响应性，进而对her2高表达的乳腺癌细胞产生更强的杀伤效果。

上述结果表明，温度和ph双响应和肿瘤靶向性的介孔硅递药系统具有良好的温度和ph双响应药物释放行为。进一步地，其对her2高表达的乳腺癌细胞具有优异的体内外杀伤效果，有望实现靶向且可控的抗恶性乳腺癌治疗。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施方式作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。