酞菁-RGD多肽-氧化石墨烯复合纳米材料及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯复合纳米材料及其制备方法与应用，该种复合纳米材料可用于癌症靶向荧光成像，同时具有光动力治疗和光热治疗协同作用，属于功能材料领域。

背景技术：

在现代肿瘤的治疗方法中，靶向治疗技术正在突飞猛进的发展。利用光动力治疗和光热治疗联合疗法加以靶向探针的方法可以明显的增加癌症治疗效果。与正常细胞相比,癌细胞很重要的一个特点就是整合素ανβ3在其表面的过度表达，尤其是在乳腺癌、前列腺癌细胞中。研究表明，具有rgd特殊序列的多肽可以特异的与癌细胞或肿瘤血管表面的ανβ3整合素特异性结合，是一类非常有价值的靶向因子。其中，rgd是一种已证实的能够与ανβ3整合素进行特异性结合的稳定小分子多肽,作为靶向因子广泛应用于多种探针材料。光动力治疗是一种非常有潜力的无创且无副作用的治疗癌症的方法，在特定光源的照射下能够产生单线态氧，能够有效杀死癌细胞和引起组织损伤。光热治疗也是一种新兴的低毒性的治疗方法，它利用在肿瘤处特异性聚集的光热剂，经激光照射而吸收的光能使得温度极具升高从而杀死肿瘤细胞。利用两种治疗方式的协同作用，可以有效地进行癌症治疗。

硅酞菁是中心配位原子为硅的酞菁，与其他金属离子酞菁配合物相比，硅酞菁的生物相容性更好，同时酞菁具有易修饰且修饰位点多、吸收波长长、消光系数高等优点。氧化石墨烯作为二维材料的代表被广泛应用，因其具有大的表面积和通用的表面特性，同时表面丰富的基团(如羧基、环氧化物和羟基等)，使其具有优异的水溶性，可以与光敏剂特异性的结合之后增加其光热效果。由于硅酞菁可以在轴向上接入基团进行修饰，增加了酞菁的空间位阻，降低了酞菁分子之间的π-π聚集，使酞菁能够更好的分散在溶剂中，从而更好的发挥光动力治疗的作用，又可以同时通过接入亲水性的基团和靶向性的分子来改善酞菁的溶解性和特异性。迄今为止，尚未见有关于能用于光动力治疗和光热治疗协同作用的靶向性硅酞菁类药物的报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，为了在光动力治疗和光热治疗的基础上进一步增加癌症治疗的靶向性和效率，本发明提供一种酞菁-多肽-氧化石墨烯复合纳米材料及其制备方法。

本发明还提供酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯复合纳米材料作为光动力治疗和光热治疗协同作用抗癌药物的应用。

术语说明：

氧化石墨烯,简称go；

胺基硅酞菁,简称pc；

rgd多肽:由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成,存在于多种细胞外基质中,可与多种整合素特异性结合,能有效地促进细胞对生物材料的粘附；

crgdyk:序列为cyclo(arg-gly-asp-d-tyr-lys)；

酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯，简称rpg；

常温，具有本领域公知的含义，一般是指25℃±2℃。

本发明的技术方案如下：

一种酞菁-多肽-氧化石墨烯复合纳米材料，是将胺基硅酞菁和rgd多肽通过共价键键合到氧化石墨烯上而形成的复合物。

根据本发明，优选的，所述的胺基硅酞菁具有式i所示的结构，所述的rgd多肽具有式ⅱ所示的结构：

结构式i中，n＝0～10。

根据本发明，优选的，所述的酞菁-多肽-氧化石墨烯复合纳米材料中，胺基硅酞菁、rgd多肽与氧化石墨烯的质量比为0.1～8:1～6:2～9.9，进一步优选的质量比为1.5～3:1.5～2:1。

根据本发明，优选的，结构式i中，n＝1～4；

优选的，结构式ⅱ中，rgd多肽为crgdyk。

根据本发明，优选的，所述胺基硅酞菁-多肽-氧化石墨烯复合纳米材料的平均粒径为20～300nm；进一步优选的，该复合纳米材料的平均粒径为20～100nm。

本发明中所述胺基硅酞菁原料可以市购，或按现有技术制备。本发明优选的，所述胺基硅酞菁是按以下方法制备的：

(a)按比例取二氯硅酞菁、胺基长链化合物碳酸钾(k2co3)与吡啶溶于适量甲苯中，加热到130℃，氮气保护下回流12-24h；

(b)将步骤(a)中混合溶液旋蒸后，用氯仿溶解固体产物并过滤，滤液用去离子水洗涤，然后将液体旋转蒸干得固体产物；

(c)将步骤(b)中固体产物用氯仿/正己烷重结晶提纯，得胺基硅酞菁(ⅰ)。

步骤(a)所述的胺基长链化合物结构式为其中n＝0～10，优选的，n＝1～4；进一步优选的胺基长链化合物选自2-(2-胺基乙氧基)乙醇。

上述胺基硅酞菁的制备方法中，优选的，步骤(a)中所述二氯硅酞菁与胺基长链的质量比为1：2～20，优选的，1：6～10；所述二氯硅酞菁与k2co3的质量比为1：2～20，优选的，1：6～10。

根据本发明，一种酞菁-多肽-氧化石墨烯复合纳米材料的制备方法，包括步骤如下：

(1)氧化石墨烯加入到n,n-二甲基甲酰胺中，超声分散，得悬浮液；

(2)向悬浮液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺，反应一段时间之后加入n,n-二异丙基乙胺、胺基硅酞菁(i)和rgd多肽(ⅱ)，之后在氮气氛围下常温搅拌反应；

(3)将反应产物分离提纯，然后将所得固体产物冻干。

根据本发明，优选的，上述步骤(1)中，所用氧化石墨烯的质量与n,n-二异丙基乙胺的质量比为1:0.5～8，优选为1:1～4。所述超声分散3～5小时；使氧化石墨烯分散均匀。

根据本发明，优选的，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为2:1；所述n,n-二异丙基乙胺与n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1～10:1；优选5～10:1；所述n,n-二异丙基乙胺与酞菁、多肽的质量比为1～10:2～4:1，优选为5～10:1～3:1；所述氧化石墨烯和胺基硅酞菁、rgd多肽原料质量比为0.1～8:1～6:2～9.9,优选质量比为1.5～3:1.5～2:1。

根据本发明，优选的，上述步骤(2)中，搅拌反应时间为3-8天。

根据本发明，优选的，上述步骤(3)中，所述的分离提纯是：将反应产物放入透析袋中先用n,n-二甲基甲酰胺透析至透析液变为无色，然后用超纯水透析1～3天。优选的，所述冻干是将分离提纯的固体产物分散在超纯水中进行冻干。

本发明如未特殊说明的，均按本领域常规操作。

以氧化石墨烯键合1个胺基硅酞菁与1个crgdyk为例，酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯复合纳米材料结构如下所示：

本发明的发明人前期研究中，将有机胺基硅酞菁连接氧化石墨烯复合得到复合纳米材料，尽管也具有较高的单线态氧产率，同时在808nm的激光照射时具有良好的光热响应，但是并未对具有ανβ3整合素过表达的乳腺癌和前列腺癌细胞显示出特异性。经过实验证明，有机靶向因子-环状多肽crgdyk是一种已证实的能够与ανβ3整合素进行特异性结合的稳定小分子多肤，作为靶向因子广泛应用于多种探针材料之中。

因此，本发明将有机胺基硅酞菁、有机靶向因子rgd多肽和无机材料氧化石墨烯通过共价键键合得到酞菁-多肽-氧化石墨烯复合纳米材料，从而进一步提高了抗癌药物的靶向性和材料的光热转换效率。不仅具有较高的单线态氧产率，在808nm的激光照射时具有良好的光热响应，同时由于连接了有机靶向因子rgd多肽，可以特异性的在肿瘤处聚集，大大提高了癌症靶向作用，是一种在肿瘤治疗中同时具有光动力治疗和光热治疗协同作用的新型复合纳米材料。细胞实验证明，rgd多肽对具有ανβ3整合素特异性的mda-mb-231乳腺癌细胞具有特异性的作用，同时实验也证明，该复合物的光热转换效率也有了一定程度的提高。

基于此，本发明提供所述的胺基硅酞菁-多肽-氧化石墨烯复合纳米材料的应用：

本发明所述的胺基硅酞菁-多肽-氧化石墨烯复合纳米材料在癌症靶向以及在协同光动力治疗和光热治疗中的应用。

一种药物组合物，包括本发明的胺基硅酞菁-多肽-氧化石墨烯复合纳米材料，以及药学上可接受的辅料和/或载体。

本发明的有益效果如下：

1、本发明提供了一种新的复合纳米材料，所述的酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯复合纳米材料作为结合光动力治疗和光热疗法的新型抗癌药物。本发明的硅酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯复合纳米材料有较高的单线态氧产率，同时在808nm的激光照射具有良好的光热响应，说明该类复合纳米材料同时具有较好的光动力治疗和光热效果。更重要的是，由于连接了有机靶向因子rgd多肽，可以特异性的在肿瘤处聚集，大大提高了癌症靶向作用。

2、本发明的酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯复合纳米材料在体外细胞实验表现出了很好的癌细胞抑制作用，在治疗时细胞存活率大大降低，说明本发明的复合纳米材料能有效杀死癌细胞，具有良好的应用前景，是一类优良的多功效抗癌药物。

3、本发明通过在二氯硅酞菁上进行轴向反应，接入胺基长链，制备出不同链长度的胺基硅酞菁(ii)。引入氧化石墨烯之后可以大大提高在近红外处的吸收，有利于提高组织穿透能力，具备良好的光动力治疗和光热治疗协同效果。

附图说明

图1是实施例2所制备的酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯复合纳米材料的原子力显微镜(afm)照片；

图2是实施例2所制备的酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯复合纳米材料(20μg/ml)分散在n,n-二甲基甲酰胺中，以1,3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)为淬灭剂测得的单线态氧测试紫外可见光谱；横坐标是波长(nm),纵坐标是吸收(任意单位)；

图3是实施例2所制备的酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯复合纳米材料(20μg/ml)分散在h2o中，以dpbf为淬灭剂测得的单线态氧测试紫外可见光谱；横坐标是波长(nm),纵坐标是吸收(任意单位)；

图4是对比例1所制备的酞菁-氧化石墨烯复合纳米材料(20μg/ml)分散在h2o中，以dpbf为淬灭剂测得的单线态氧测试紫外可见光谱；横坐标是波长(nm),纵坐标是吸收(任意单位)；

图5是实施例2所制备的不同浓度的酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯复合纳米材料在808nm(7.5w/cm^2,,功率为1.5w)激光照射下不同时间的温度变化曲线图；

图6是对比例1所制备的不同浓度的酞菁-氧化石墨烯复合纳米材料在808nm(7.5w/cm^2,,功率为1.5w)激光照射下不同时间的温度变化曲线图；

图7是实施例2所制备的胺基硅酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯对特异性mda-mb-231乳腺癌细胞的光毒性；横坐标是浓度(μg/ml)，纵坐标是细胞存活率(％)；

图8是对比例1所制备的胺基硅酞菁-氧化石墨烯对特异性mda-mb-231乳腺癌细胞的光毒性；横坐标是浓度(μg/ml)，纵坐标是细胞存活率(％)。

具体实施方式

下面具体实施例并结合附图对本发明进一步说明，但不限于此。

本发明所用原料均采用市售分析纯试剂。

实施例1：胺基硅酞菁(n＝1)的制备

原料及试剂：二氯硅酞菁、2-(2-胺基乙氧基)乙醇、碳酸钾质量比为1:6:6，吡啶的用量为9毫升/每克二氯硅酞菁，甲苯的用量为120毫升/每克二氯硅酞菁。

按比例，取二氯硅酞菁、2-(2-胺基乙氧基)乙醇、碳酸钾(k2co3)与吡啶溶于甲苯中，加热到130℃，氮气保护下回流18h。将反应溶液真空蒸除溶剂后，所得固体物用氯仿全部溶解并过滤，超纯水洗涤3次。滤液减压蒸干后，用氯仿/正己烷重结晶4次得到胺基硅酞菁(式i，n＝1)。

实施例2：以酞菁中n＝1为例，酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯(rpg)的制备方法，步骤如下：

将10.3g氧化石墨烯(go)加入到20l蒸馏后的n,n-二甲基甲酰胺中，超声3h。在超声后的悬浮液中加入76.7g(0.4m)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、46g(0.4m)、n-羟基琥珀酰亚胺、523ml(3m)n,n-二异丙基乙胺和40.5g(0.5m)胺基硅酞菁(n＝1)，18.6g多肽(0.25m)，常温搅拌，在氮气氛下反应5天。将产物进行透析，最后将固体产物分散在超纯水中，冻干得产物rpg共21.3g，产物中胺基硅酞菁6.2g，氧化石墨烯10.3g,rgd多肽4.8g。

所得产物rpg的平均粒径为100～200nm。所得胺基硅酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯复合纳米材料的afm照片如图1所示。

本实施例的反应路线如下：

实施例3、以胺基硅酞菁n＝2为例

如实施例2所述，不同之处在于步骤(2)中的胺基硅酞菁(n＝1)分别替换为等摩尔量的n＝2的胺基硅酞菁，所得产物胺基硅酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯复合纳米材料经单线态氧测试在n,n-二甲基甲酰胺和h2o中的单线态氧产率都较高。且具有很好的热疗效果，5分钟内升高到了50℃左右。

对比例1

如实施例2所述，在所有条件相同的情况下，不同的是：

不加入rgd多肽，得到酞菁--氧化石墨烯复合纳米材料。

试验例

测试实施例2所得的胺基硅酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯复合纳米材料和对比例1的复合纳米材料的相关性能：

1、单线态氧(ros)测试

用1,3-二苯基异苯并呋喃作为猝灭剂测试样品产生单线态氧的能力。光源使用配有610nm截止型滤波片(λ>610nm)的150w卤素灯。

首先将1,3-二苯基异苯并呋喃配制成浓度为40μm的n,n-二甲基甲酰胺溶液，然后取3ml该溶液转移至石英比色皿中，再加入用n,n-二甲基甲酰胺/h2o配成的样品母液，使样品的浓度为20μg/ml，以5s为一个时间间隔使用光源进行照射，并测试溶液的紫外可见光谱。

测试实施例2的样品，结果如图2、图3所示。测试对比例1的样品，结果如图4所示。

结果发现，实施例2中的胺基硅酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯复合纳米材料在n,n-二甲基甲酰胺和h2o中的单线态氧产率都较高。

对比例1中，样品在去离子水的单线态氧产率有着一些降低。

2、热疗效果测试

将复合纳米材料用h2o分别配成浓度为20μg/ml的分散液，取1ml分散液置于3ml的比色皿中，用808nm激光器(3w)照射5min。用红外热成像仪每30s记录一次温度。

测试实施例2的样品，结果如图5所示。测试对比例1的样品，结果如6所示。

结果发现，实施例2中的胺基硅酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯复合纳米材料有很好的热疗效果，5分钟内升高到了60℃左右。

对比例1中，相同浓度的胺基硅酞菁-氧化石墨烯复合纳米材料的温度同样也是有所上升，但温度只是升高到50℃左右。

3、细胞特异性实验

将人乳腺癌细胞(mda-mb-231)在96孔板中培养至贴壁，吸出培养基，分别加入100μl配好的含有不同浓度样品的培养基，放入恒温培养箱培养24h后，分为四组，第一组用660nmled灯照射；第二组用808nm激光(7.5w/cm²，5min)照射；第三组用660nmled灯(5min)和808nm激光(7.5w/cm²，5min)照射；第四组为避光组，不进行任何光照。然后将所有细胞都放入恒温培养箱中培养24h，最后用cck-8测细胞成活率。

测试实施例2的样品，实验结果如图7所示。测试对比例1的样品，结果如图8所示。

结果发现，实施例2中的胺基硅酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯复合纳米材料对人乳腺癌细胞有着明显的抑制作用，当使用光动力治疗和光热治疗的联合作用之后，癌细胞的存活率降低到10％左右。

对比例1中，虽然对癌细胞的生长也有着抑制作用，但是在光动力治疗和光热治疗的联合作用下，癌细胞的存活率也高达45％，这表明胺基硅酞菁-rgd多肽-氧化石墨烯有着明显的靶向识别作用。

显然，本领域的技术人员可以对本发明的复合物及制备方法进行胺基硅酞菁中长链的替换、合成条件及过程等各种改动和变型而不脱离本发明的本质和范围。这样，都应该在本发明的保护范围之内。