无细胞脂肪提取液对脂肪肝及其并发症的治疗作用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及无细胞脂肪提取液对脂肪肝及其并发症的治疗作用。


背景技术：

2.脂肪性肝病是常见的慢性肝脏疾病之一，随病程进展可发展成肝炎(nash)、肝硬化、肝癌等，其已成为近十年来影响公众健康的全球广泛分布性疾病，但目前尚缺乏理想的治疗方法和药物，寻找安全有效的生物制剂成为亟待解决的问题。
3.因此，本领域亟需开发一种能够安全、有效治疗脂肪肝的药物。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种安全且有效治疗脂肪肝和/或其并发症的无细胞脂肪提取液。
5.本发明的第一方面，提供一种无细胞脂肪提取物的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症。
6.在另一优选例中，所述的脂肪肝为酒精性或非酒精性脂肪肝。
7.在另一优选例中，所述的脂肪肝为高脂饮食或肥胖引起的脂肪肝。
8.在另一优选例中，所述脂肪肝为肥胖型脂肪肝。
9.在另一优选例中，所述的脂肪肝为脂质代谢紊乱引起的脂肪肝。
10.在另一优选例中，所述的脂质代谢紊乱为血液中的脂代谢紊乱和/或肝脏中的脂代谢紊乱。
11.在另一优选例中，所述的脂质代谢紊乱为高血脂。
12.在另一优选例中，所述的脂质代谢紊乱选自下组：高甘油三酯、高胆固醇、高低密度脂蛋白偏低、低密度脂蛋白偏高，或其组合。
13.在另一优选例中，所述的高血脂选自下组：高甘油三酯、高胆固醇、高低密度脂蛋白偏低、低密度脂蛋白偏高，或其组合。
14.在另一优选例中，所述的预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症包括：
15.(i)抑制、缓解和/或逆转脂肪肝生长；
16.(ii)降低脂肪肝的重量；
17.(iii)改善肝脏组织的脂肪变性；和/或
18.(iv)抑制和/改善肝脏脂肪炎症。
19.在另一优选例中，所述的预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症包括(i)抑制、缓解和/或逆转脂肪肝生长。
20.在另一优选例中，所述的预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症包括(ii)降低脂肪肝的重量。
21.在另一优选例中，所述的预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症包括(iii)改善肝
脏组织的脂肪变性。
22.在另一优选例中，所述的预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症包括(iv)抑制和/改善肝脏脂肪炎症。
23.在另一优选例中，所述的改善肝脏组织的脂肪变性包括：
24.(a)抑制和/或降低肝脏脂肪空泡。
25.在另一优选例中，所述的并发症选自下组：肝纤维化、肝硬化、肝癌、糖尿病、心血管疾病、肾脏疾病、结直肠癌、内分泌疾病
26.在另一优选例中，所述的糖尿病为2-型糖尿病。
27.在另一优选例中，所述的组合物或制剂还包括其它预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症的药物。
28.在另一优选例中，所述的其它预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症的药物选自下组：护肝药、胰岛素增敏剂、降脂药、减肥药，或其组合。
29.在另一优选例中，所述的护肝药选自下组：多烯磷脂酰胆碱、谷胱苷肽(gsh)、水飞蓟素(宾)、s-腺苷甲硫氨酸(蛋氨酸)、双环醇、甘草酸二铵、熊去氧胆酸(udca)，或其组合。
30.在另一优选例中，所述的胰岛素增敏剂选自下组：二甲双胍、过氧化物酶体增殖因子激活受体(ppars)激动剂、pparγ激动剂噻唑烷二酮类(tzds)、pparα/δ激动剂、胰高血糖素样肽-1(glp-1)类似物，或其组合。
31.在另一优选例中，所述的降脂药选自下组：他汀类(如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀)、贝特类(如氯贝特、利贝特、苯扎贝特、氯贝丁酸铝及双贝特)，或其组合。
32.在另一优选例中，所述的降脂药选自下组：奥利司他、氯卡色林、芬特明-托吡酯复方制剂、纳曲酮、安非他酮、利拉鲁肽，或其组合。
33.在另一优选例中，所述的组合物或制剂包括药物组合物或制剂、食品组合物或制剂、保健品组合物或制剂或膳食补充剂。
34.在另一优选例中，所述的组合物或制剂还包括药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体。
35.在另一优选例中，所述的组合物或制剂的剂型为口服制剂、外用制剂或注射制剂。
36.在另一优选例中，所述的组合物或制剂通过外用、局部、或皮下注射方式施用。
37.在另一优选例中，所述无细胞脂肪提取物不含有细胞且不含有脂滴。
38.在另一优选例中，所述脂滴为脂肪细胞破碎后释放的油滴。
39.在另一优选例中，所述“不含有脂滴”指所述无细胞脂肪提取物中，油滴体积占总液体百分比小于1％，优选地小于0.5％，更优选地小于0.1％。
40.在另一优选例中，所述细胞选自下组：内皮细胞、脂肪干细胞、巨噬血细胞、基质细胞。
41.在另一优选例中，所述“无细胞”指1ml无细胞脂肪提取物中的细胞平均数量≤1个，优选地≤0.5个，更佳地≤0.1个，或为0个。
42.在另一优选例中，所述无细胞脂肪提取物为天然获得的无添加成分的纳米脂肪提取物。
43.在另一优选例中，所述“无添加成分的”指除漂洗步骤外，在所述脂肪提取物的制备过程中未添加任何溶液、溶剂、小分子、化学制剂、和生物添加剂。
44.在另一优选例中，所述脂肪提取物是通过将脂肪组织经过乳化后离心制备获得。
45.在另一优选例中，所述的脂肪提取物含有但不限于一种或多种选自下组的组分：生长因子igf-1、bdnf、gdnf、tgf-β、hgf、bfgf、vegf、pdgf、egf、nt-3、gh、g-csf、或其组合。
46.在另一优选例中，所述的无细胞脂肪提取物通过以下方法制备：
47.(1)提供一脂肪组织原料，将所述脂肪组织原料剪碎，并进行漂洗(如用生理盐水)，从而获得经漂洗的脂肪组织；
48.(2)对所述经漂洗后的脂肪组织进行离心，获得分层的混合物；
49.(3)对所述分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层(即含脂肪细胞的脂肪层)；
50.(4)对所述中间层进行乳化，获得乳化的脂肪混合物(也称为纳米脂肪)；
51.(5)将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理，从而获得中间液体层，即为脂肪初提物；和
52.(6)对所述脂肪初提物进行过滤和除菌，从而获得无细胞的脂肪提取物。
53.本发明第二方面，提供一种制备无细胞脂肪提取物的方法，所述的方法包括步骤：
54.(1)提供一脂肪组织原料，将所述脂肪组织原料剪碎，并进行漂洗(如用生理盐水)，从而获得经漂洗的脂肪组织；
55.(2)对所述经漂洗后的脂肪组织进行离心，获得分层的混合物；
56.(3)对所述分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层(即含脂肪细胞的脂肪层)；
57.(4)对所述中间层进行乳化，获得乳化的脂肪混合物(也称为纳米脂肪)；
58.(5)将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理，从而获得中间液体层，即为脂肪初提物；和
59.(6)对所述脂肪初提物进行过滤和除菌，从而获得无细胞的脂肪提取物。
60.在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心在800-2500g下离心，较佳地800-2000g，更佳地1000-1500g，最佳地1100-1300g。
61.在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心的时间为1-15min，较佳地1-10min，更佳地1-8min，最佳地1-5min。
62.在另一优选例中，所述的步骤(4)中，所述的乳化为机械乳化。
63.在另一优选例中，所述机械乳化为经注射器反复吹打(如吹打20-200次，较佳地20-150次，更佳地20-100次，更佳地30-50次)进行机械乳化。
64.在另一优选例中，所述的吹打的方式为2个10ml注射针筒连接三通管反复匀速推打。
65.在另一优选例中，，所述的步骤(4)中，所述乳化为通过组织匀浆机打碎的方法。
66.在另一优选例中，所述的步骤(5)中，在将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理前，还包括对所述乳化的脂肪混合物冷冻后解冻处理。
67.在另一优选例中，冷冻后解冻处理后，将解冻后的混合物用于离心。
68.在另一优选例中，所述的冷冻的温度为-50℃至-120℃，较佳地-60℃至-100℃，更佳地-70℃至-90℃。
69.在另一优选例中，所述的解冻的温度为20-40℃，较佳地25-40℃，更佳地37℃。
70.在另一优选例中，所述的冷冻后解冻的循环次数为1-5次(优选为1、2、3或4次)。
71.在另一优选例中，所述的步骤(5)中，离心后，所述乳化的脂肪混合物分层4层，第一层为油层，第二层为残余脂肪组织层，第三层为液体层(即为中间液体层)，第四层为细胞/组织碎片沉淀层。
72.在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述离心在800-2500g下离心，较佳地800-2000g，更佳地1000-1500g，最佳地1100-1300g。
73.在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述离心的时间为1-15min，较佳地1-10min，更佳地2-8min，最佳地3-7min。
74.在另一优选例中，所述的步骤(5)中，第一层、第二层、第三层和第四层从上到下依次排列。
75.在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述的中间液体层为透明或基本透明层。
76.在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述的过滤包能够将脂肪初提物中的脂肪细胞除去。
77.在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述的过滤和除菌是通过滤器(如0.22μm微孔滤膜)进行。
78.在另一优选例中，所述的过滤器为微孔滤膜过滤器。
79.在另一优选例中，所述的微孔滤膜的孔径大小为0.05-0.8μm，较佳地0.1-0.5μm，更佳地0.1-0.4μm，更佳地0.15-0.3μm，更佳地0.2-0.25μm，最佳地0.22μm。
80.在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述的过滤和除菌是先通过可滤去细胞的第一过滤器，然后再通过可滤去病原体(如细菌)的第二滤器(如0.22μm的滤器)进行的。
81.在另一优选例中，所述的步骤(6)中，还包括对所述脂肪提取物进行分装，形成分装的产品。(所述分装后的提取物可于-20℃保存待用；可低温(如-4℃)或常温解冻后直接使用，或解冻后置于低温(如4℃)保存一段时间，然后使用)。
82.本发明第三方面，提供一种组合物或制剂，包含(a)本发明第二方面所述的无细胞脂肪提取物；和/或(b)药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体或赋形剂。
83.在另一优选例中，所述组合物或制剂的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、片剂或含片。
84.在另一优选例中，所述的注射剂为静脉注射剂或肌肉注射剂。
85.在另一优选例中，所述组合物或制剂的剂型为固体剂型、半固体剂型、或液体剂型，如溶液、凝胶、膏霜、乳液、膏剂、霜剂、糊剂、饼、粉剂、贴剂等。
86.在另一优选例中，在所述组合物或制剂中，无细胞脂肪提取物的质量百分比为5wt％，较佳地1-20wt％，以化妆品组合物的总重量计。
87.本发明第四方面，提供一种制备组合物或制剂的方法，所述的方法包括步骤：将本发明第二方面所述的无细胞脂肪提取物与药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体或赋形剂混合，从而形成组合物或制剂。
88.本发明第五方面，提供一种预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症的方法，所述方法包括步骤：对需要的对象施用本发明第二方面的所述的无细胞脂肪提取物。
89.在另一优选例中，所述的对象为人或非人哺乳动物。
90.在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物，如大鼠、小鼠。
91.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
92.图1为显示chow组、pbs缓冲液组和ceffe治疗组小鼠的肝脏湿重。
93.图2为显示chow组、pbs缓冲液组和ceffe治疗组小鼠肝脏的组织学染色。
94.图3为显示chow组、pbs缓冲液组和ceffe治疗组小鼠肝脏中的空泡面积。
具体实施方式
95.本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种能够有效治疗脂肪肝和/或其并发症的无细胞脂肪提取物。在本发明中，通过动物实验证实本发明的无细胞脂肪提取液能够有效预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症。在此基础上完成了本发明。
96.术语
97.除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
98.如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由
…
构成”、或“由
…
构成”。
99.如本文所用，术语“脂肪肝和/或其并发症”与“脂肪肝和/或脂肪肝并发症”可互换使用。
100.无细胞脂肪提取物及其制备方法
101.如本文所用，术语“本发明的无细胞脂肪提取物”、“本发明提取物”、“本发明的脂肪提取物”等可互换使用，指在脂肪提取物制备过程中(除漂洗步骤外)未添加任何溶液、溶剂、小分子、化学制剂、和生物添加剂所制备的源自脂肪组织的提取物(或提取液)。一种典型的制备本发明提取物的方法如上本发明第二方面中所述。此外，应理解，虽然本发明提取物在制备过程中不必添加任何添加剂(或添加成分)，但是也可以添加一些或少量的对本发明提取物的活性无负面或不利影响的安全的物质(如少量水)。
102.脂肪肝和/或其并发症
103.脂肪肝(fatty liver)是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变，是一种常见的肝脏病理改变。通常，正常人肝组织中含有少量的脂肪，如甘油三酯、磷脂、糖脂和胆固醇等，其重量约为肝重量的3％～5％，如果肝内脂肪蓄积太多，超过肝重量的5％或在组织学上肝细胞50％以上有脂肪变性时，就可称为脂肪肝。
104.脂肪肝的形成通常与肥胖、高脂饮食、饮酒等因素有关，这些因素导致肝细胞内脂肪堆积过多，从而引起脂肪肝。根据病因分类，脂肪性肝病可分为酒精性脂肪性肝病(alcoholic fatty liver disease)和非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，nafld)。其中，非酒精性脂肪性肝病是一种无过量饮酒史，而以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性为特征的临床病理综合征，随病程进展可发展成非酒精性肝炎(nash)、肝硬化、肝癌等。
105.代表性的，本发明所述的脂肪肝包括(但不限于)下组的一种或多种脂肪肝：酒精
性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、高脂饮食或肥胖引起的脂肪肝、脂质代谢紊乱引起的脂肪肝。
106.在一个优选例中，脂质代谢紊乱引起的脂肪肝为血液中的脂代谢紊乱和/或肝脏中的脂代谢紊乱。
107.典型地，所述的脂质代谢紊乱包括(但不限于)：高甘油三酯、高胆固醇、高低密度脂蛋白偏低、低密度脂蛋白偏高，或其组合。
108.在本发明的另一优选例中，所述的脂肪肝并发症包括(但不限于)：肝纤维化、肝硬化、肝癌、糖尿病、心血管疾病、肾脏疾病、结直肠癌、内分泌疾病
109.在另一优选例中，所述的糖尿病为2-型糖尿病。
110.用途
111.本发明所述的无细胞脂肪提取能够用于预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症。
112.如本文所用，术语“预防”表示预防疾病和/或它的附随症状的发作或者保护对象免于获得疾病的方法。本文中使用的"预防"还包括延迟疾病和/或它的附随症状的发作和降低对象的得病的风险。
113.如本文所用，术语“治疗”包括延缓和终止疾病的进展，或消除疾病，并不需要100％抑制、消灭和逆转。在一些实施方案中，与不存在本发明所述的无细胞脂肪提取时观察到的水平相比，本发明所述无细胞脂肪提取或组合物将脂肪肝和/或其并发症减轻、抑制和/或逆转了例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％。
114.代表性地，本发明所述的无细胞脂肪提取通过包括(但不限于)下组的一种或多种方式预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症：
115.(i)抑制、缓解和/或逆转脂肪肝生长；
116.(ii)降低脂肪肝的重量；
117.(iii)改善肝脏组织的脂肪变性；和/或
118.(iv)抑制和/改善肝脏脂肪炎症。
119.如本文所用，术语“逆转”包括对已经出现的疾病进行消除，并不需要100％消除和逆转。在一些实施方案中，与不存在本发明所述的无细胞脂肪提取时观察到的水平相比，本发明所述无细胞脂肪提取或组合物将脂肪肝逆转了例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％。
120.如本文所用，术语“缓解”包括降低疾病的发展，缓解疾病的症状等。
121.在本发明的一个优选例中，可以通过抑制和/或降低肝脏脂肪空泡来改善肝脏组织的脂肪变性。
122.本发明还提供一种预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症的方法，所述方法包括步骤：对所需对象施用本发明所述的无细胞脂肪提取物，从而治疗脂肪肝。
123.在一个优选例中，所述的对象为人或非人动物。
124.在另一优选例中，所述非人动物如大鼠、小鼠、狗、猫、牛、鸡、鸭等。
125.组合物和施用
126.本发明所述的组合物包括(但并不限于)：药物组合物、食品组合物、保健组合物、膳食补充剂等。
127.代表性地，可将本发明的无细胞脂肪取物制备成药物组合物，诸如片剂、胶囊、粉剂、微粒剂、溶液剂、锭剂、胶冻、乳膏制剂、醑剂、悬液、酊、泥敷剂、搽剂、洗剂、和气雾剂之
类的剂型。药物组合物能够由通常已知的制备技术来制备，并且合适的药物添加剂能够被添加到该药物中。
128.本发明的组合物还可以包括药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体。“药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上、食品上、保健品或膳食上可接受的载体可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
129.本发明的组合物还可以所述的组合物或制剂还包括其它预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症的药物。优选地，所述的其它预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症的药物选自下组：护肝药、胰岛素增敏剂、降脂药、减肥药，或其组合。
130.代表性地，所述的护肝包括(但并不限于)：多烯磷脂酰胆碱、谷胱苷肽(gsh)、水飞蓟素(宾)、s-腺苷甲硫氨酸(蛋氨酸)、双环醇、甘草酸二铵、熊去氧胆酸(udca)，或其组合。
131.代表性地，所述的胰岛素增敏剂选自下组：二甲双胍、过氧化物酶体增殖因子激活受体(ppars)激动剂、pparγ激动剂噻唑烷二酮类(tzds)、pparα/δ激动剂、胰高血糖素样肽-1(glp-1)类似物，或其组合。
132.代表性地，所述的降脂包括(但并不限于)：他汀类(如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀)、贝特类(如氯贝特、利贝特、苯扎贝特、氯贝丁酸铝及双贝特)，或其组合。
133.代表性地，所述的降脂包括(但并不限于)：奥利司他、氯卡色林、芬特明-托吡酯复方制剂、纳曲酮、安非他酮、利拉鲁肽，或其组合。
134.本发明组合物施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内)、局部施用，优选的施用方式为口服施用和注射施用。
135.用于口服施用或给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
136.固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，。
137.用于口服施用或给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基
甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
138.除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、娇味剂和香料。
139.除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
140.用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
141.用于局部施用或给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
142.本发明无细胞脂肪提取物可以单独施用或给药，或者与其它预防和/或治疗脂肪肝和/或其并发症的药物联合施用或给药。
143.施用组合物时，是将安全有效量的本发明无细胞脂肪提取物适用于需要治疗的人或非人动物(如大鼠、小鼠、狗、猫、牛、鸡、鸭等)，其中施用时剂量为药学上、食品上或保健品上可接受认为的有效给药剂量。如本文所用，术语“安全有效量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“安全有效量”可随着药物组合物的形式、给药途径、所用药物的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。例如，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为0.1～1000mg，优选1～600mg，更优选为2-300mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
144.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
145.实施例1
146.1.实验方法
147.1.1无细胞脂肪提取液(cell free fat extract,ceffe)的制备
148.脂肪由自愿者在获得知情同意的条件下获得。无细胞脂肪组织提取液的制备方法如下：
149.(1)取抽吸或手术切除得到的脂肪，剪碎后用生理盐水漂洗3遍。
150.(2)取经漂洗后的脂肪组织，置于离心管中，放入离心机中以1200g离心3分钟后，获得分层的混合物。
151.(3)对所述分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层(即含脂肪细胞的脂肪层)。
152.(4)对所述中间层，用2个10ml注射针筒连接三通管反复匀速推打30次，从而进行机械乳化，并获得经机械乳化的脂肪混合物(也称为纳米脂肪)。
153.(5)将所述经机械乳化的脂肪混合物置入-80℃冰箱冷冻，再进行37℃水浴解冻，单次冻融循环后，将解冻后的脂肪混合物以1200g离心5分钟，获得分层的混合物，分层的混
合物共分为4层，第一层为油层，第二层为残余脂肪组织层，第三层为液体层，第四层为细胞/组织碎片沉淀层，去除油层和残余脂肪组织层，吸取液体层，吸取过程中避免细胞/组织碎片沉淀层污染，从而得到脂肪初提取液。
154.(6)将得到的脂肪初提取液经0.22μm滤器过滤除菌，从而灭菌并去除可能混有的活细胞，从而获得无细胞脂肪提取液，分装冻存于-20℃保存，使用时4℃解冻。
155.1.2小鼠脂肪肝模型建立、分组及给药
156.6周龄c57小鼠购自上海实验动物中心，小鼠脂肪肝模型通过连续4周高脂饮食诱导，获得脂肪肝模型小鼠。选取10只脂肪肝模型小鼠随机分为两组，pbs缓冲液组和ceffe治疗组，每组5只，此外，将未经过高脂饮食诱导的5只正常健康小鼠作为正常饲养组(chow组)。ceffe治疗组的脂肪肝模型小鼠采用尾静脉注射ceffe治疗，注射剂量为250μl，pbs缓冲液组的脂肪肝模型小鼠采用尾静脉注射pbs缓冲液，治疗周期为30日，每四日给药一次，共给药7次，给药期间pbs缓冲液组和ceffe治疗组小鼠继续给予高脂饮食，此外，正常饲养组(chow组)小鼠正常健康饮食，作为空白对照。
157.其中，以注射pbs缓冲液组作为阴性对照，以chow组作为空白对照。
158.1.3统计学分析
159.数据采用spss软件进行单因素anova检验，对数据差异显著性进行统计分析，结果以平均数
±
标准差表示。
160.2.实验结果
161.2.1小鼠肝脏重量测定
162.治疗第30日处死每组小鼠后，剥离肝脏，称量肝脏湿重，结果如表1和图1所示。
163.表1不同实验组小鼠肝脏湿重(mean
±
sd，n＝5)
164.实验组组chow组pbs缓冲液组ceffe治疗组mean
±
sd(g)1.35
±
0.102.28
±
0.271.80
±
0.33
165.备注：chow vs.pbs，p值＝0.0002**(＜0.01)；chow vs.ceffe，p值＝0.0474*(＜0.5)；pbs vs.ceffe，p值＝0.0318*(＜0.5)。
166.从表1和图1中可以看出，脂肪肝小鼠肝脏湿重明显增加。与pbs缓冲液组相比，ceffe治疗组肝脏湿重显著下降，表明ceffe对脂肪肝具有显著的治疗作用。
167.2.2组织学评价
168.治疗第30日处死小鼠，剥离肝脏，取部分肝脏组织，浸于4％多聚甲醛，固定24h后石蜡包埋，常规做石蜡切片，h&e染色，光学显微镜下拍照(3个随机视野/标本)，image j软件计算空泡区域面积，结果如表2和图2-3所示。
169.表2不同实验组小鼠肝脏中的空泡面积(mean
±
sd，n＝3)
[0170][0171][0172]
chow vs.pbs，p<0.001**；chow vs.ceffe，p<<0.001*；pbs vs.ceffe<0.001**。
[0173]
从表2、图2和图3中可以看出，与chow相比，pbs缓冲液组可见大面积脂肪空泡伴局部炎症，而ceffe治疗组肝脏脂肪空泡明显减少，炎症反应减轻，表明ceffe能够改善脂肪肝
小鼠肝脏脂肪变性，用于治疗脂肪肝。
[0174]
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