负载抗癌药物的载药体系及其制备和应用的制作方法

本发明涉及涉及纳米医药技术领域，具体涉及一种用介孔二氧化硅纳米球支撑的蛋白脂质体抗肿瘤药物靶向载体及这种载体与抗肿瘤药物的偶联，以及所形成的载药体系及其制备和应用。

背景技术：

癌症被世界卫生组织认为是21世纪人类的“第一杀手”，严重威胁人类的生存，确诊难度大死亡率高，恶性肿瘤的治疗主要采用手术切除、放射疗法、免疫治疗和化学疗法进行的治疗。癌症的控制已成为全球性的卫生战略重点。目前，中国现已成为世界第一癌症大国，癌症不仅严重威胁着人们的生命与健康。化学治疗方法依然是治疗恶性肿瘤的主要手段之一，传统的化学治疗方法主要是使用化学药物，通过抑制肿瘤细胞的增殖并杀死肿瘤细胞，但大多数的化疗药物都没有专一性，会在抑制肿瘤组织的同时也损伤正常组织，所以，具有不可忽视的毒副作用，如造成免疫功能下降、骨髓抑制、心脏和肝脏毒性等。

为了克服化学药物治疗方面存在的不足，提高化学治疗药物的靶向性，使得增药物能够在肿瘤组织中持续积累，降低药物对正常组织的危害，是提高抗肿瘤效果的有效途径之一。目前比较好的方法是将抗肿瘤药物和不同的药物载体相结合，通过对药物载体进行改造，使药物载体具有靶向运输的能力，从而达到靶向治疗的目的。

中国专利申请cn109364267a公开了一种肿瘤组织和细胞双重靶向的介孔二氧化硅纳米载药颗粒及其制备方法，该载药颗粒由表面被聚丙烯酸和聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒和药物组成，通过载药颗粒对肠道内酸碱度的适应性响应、粒径相容性和在血液中循环时间的延长性来使该载药颗粒“被动靶向”在肿瘤部位富集，从而达到治疗效果。但是该技术仍无法避免由于身体器官和体液的个体差异或动态变化对该载药颗粒可能产生错误判断的几率，对机体组织细胞的伤害也就难以避免。其他公开的技术中，抗癌药物载药体系的靶向性能也都不够理想，无法减轻或避免化疗对正常机体细胞的伤害。

技术实现要素：

为此，需要提供一种负载抗癌药物的载药体系及其制备和应用，来解决现有技术中抗癌药物或含有抗癌药物的载药体系由于靶向性能弱，在化疗过程中给患者正常机体组织细胞造成伤害的问题。本发明所述负载抗癌药物的载药体系需具备靶向性强，生物相容性好，在机体内的分布可测等特点。

为了实现上述目的，在本发明的第一方面，发明人提供了负载抗癌药物的载药体系，包括内核层和外壳层，所述外壳层包覆在所述内核层的外表面，所述内核层包括载体和小分子配合物，所述载体为介孔二氧化硅纳米球，所述外壳层包含靶向蛋白和脂质体膜，所述靶向蛋白融合于脂质体膜。

进一步地，所述靶向蛋白包括由h1299.2靶肽、egfp和mscl融合构建所表达出的蛋白。

进一步地，所述介孔二氧化硅纳米球的粒径为：85.6-99.2nm，孔径为：7.2-10.0nm。与其他范围的孔径相比，此范围孔径的介孔二氧化硅纳米球有利于药物的大量负载。

进一步地，所述脂质体膜与靶向蛋白的质量比为(19-22)：(1-2)，优选20：(1-2)。在此质量比范围内制备的靶向蛋白-脂质体膜融合膜较为稳定。

进一步地，所述小分子配合物为具有抗癌效果的钌金属配合物，分子量为662g/mol。

介孔二氧化硅纳米球/颗粒(msn)具有生物相容性、水溶性好、孔隙体积大、表面积大等优点。本发明通过设计合成一种新型靶向蛋白质脂质体(lip)系统，通过与介孔二氧化硅纳米球/颗粒(msn)结合，使得其能够稳定的靶向到达肿瘤部位，实现药物在肿瘤部位的有效积累，从而提供了一种用硅介孔支撑的蛋白脂质体抗肿瘤药物靶向载体的制备方法。

本发明所述抗癌药物为dna靶向药物。药物在靶向蛋白的作用下富集于肿瘤细胞h1299并插入和破坏细胞核dna，导致肿瘤细胞凋亡。根据测定得到的紫外吸光度值，通过标准曲线换算得到释放出来的钌配合物抗癌药物rudpni的量。

本发明的第二方面，发明人提供了负载抗癌药物的载药体系制备方法，包括以下步骤：

制备介孔二氧化硅球载药颗粒，

将介孔二氧化硅纳米球分散于小分子配合物乳液中，通过第一自组装制得介孔二氧化硅载药颗粒；和

制备负载抗癌药物的载药体系，

往三氯甲烷溶液中加入dspe、胆固醇和dspe-peg2000，蒸发溶剂，得到脂质体膜，加入靶向蛋白进行水化反应，使脂质体膜与靶向蛋白相结合，得到含有靶向蛋白的脂质体层，将所述脂质体层与所述介孔二氧化硅球载药颗粒溶液混合，通过第二自组装作用得到所述负载抗癌药物的载药体系；

所述负载抗药药物的载药体系包含：内核层和外壳层，所述内核层为介孔二氧化硅纳米球和小分子配合物构成的介孔二氧化硅载药颗粒，所述外壳层由靶向蛋白和脂质体膜构成，包覆在所述内核层外表面。

在上述制备负载抗癌药物的载药体系步骤中，优选地，使用40℃缓慢减压蒸发去除溶剂。还优选地采用0.1μm滤膜的脂质体挤压器挤压形成靶向脂质体(lip)。

作为本发明优选的技术方案，所述介孔二氧化硅纳米球与小分子配合物的质量配比关系为10:3-1:1。

作为本发明优选的技术方案，所述dspe、胆固醇和dspe-peg2000与三氯甲烷的配比关系为10:2:0.63:10。

作为本发明优选的技术方案，所述靶向蛋白的加入量为0.5mg，所述脂质体层与所述介孔二氧化硅球载药颗粒溶液的配比关系为800μl:100μl。

在本发明的第三方面，发明人提供了如本发明第一方面所述载药体系在运载口服抗癌类药物的应用。

由于介孔二氧化硅纳米球/颗粒(msn)具有生物相容性、水溶性好、孔隙体积大、表面积大等优点，已经有大量文献报道利用msn输送药物。本发明通过设计合成一种新型靶向蛋白质脂质体(lip)系统，通过与介孔二氧化硅纳米球/颗粒(msn)结合，使得其能够稳定的靶向到达肿瘤部位，实现药物在肿瘤部位的有效积累，从而提供了一种用硅介孔支撑的蛋白脂质体抗肿瘤药物靶向载体的制备方法。

区别于现有技术，上述技术方案具有如下优点：

采用生物相容性好、比表面积大的介孔二氧化硅纳米球与小分子配合物所构成的载药颗粒作为内核层，在其外表面包覆含有特定靶蛋白和脂质体膜构成的脂质体层，由于特定靶蛋白(由h1299.2靶肽，egfp和mscl的融合构建、表达)与脂质体膜融合而成，在作为抗癌化疗药物口服进入机体后，在无靶蛋白结合位点的正常组织内不积累，在有靶位的肿瘤细胞上结合定点释放药物。由于特定靶蛋白上含有荧光蛋白egfp，可以通过测定e-gfp的荧光值来测定其在体内的分布，从而可以更加精确地指导化疗用药。

附图说明

图1为本发明具体实施例负载rudpni前后介孔二氧化硅纳米的n2吸脱附图；

图2为本发明具体实施例负载rudpni前后介孔二氧化硅纳米的孔径、孔体积及比表面积表；

图3为本发明具体实施例靶向硅介孔脂质体纳米药物(ru-msn-lip)的透射电镜图；

图4为本发明具体实施例ru-msn-lip药物在ph5.0(a)和ph7.4(b)的pbs条件下的rudpni释放曲线图；

图5为本发明具体实施例mtt法检测ru-msn-lip对helf、h1299、hepg2及hela细胞的毒性表；

图6为本发明具体实施例不同浓度ru-msn-lip对helf、h1299、hepg2及hela细胞的毒性图。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容和所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

本发明所用药物、规格、性能及其来源说明如下：

ctatos，十六烷基三甲基对甲基苯磺酸铵盐：5g，国药集团化学试剂有限公司；

tea，三乙醇胺：500ml,国药集团化学试剂有限公司，国药集团化学试剂有限公司；

teos，正硅酸乙酯：500ml,国药集团化学试剂有限公司，国药集团化学试剂有限公司；

dspe-peg2000，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇：500mg,上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

pbs，磷酸缓冲液：500ml,生工生物工程(上海)股份有限公司；

培养基dmem，dulbecco'smodifiedeaglemedium：500ml,赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

mtt，溴化噻唑蓝四氮唑：1g,生工生物工程(上海)股份有限公司；

rudpni：本实验室自制，具体制备方法可参照中国发明专利申请201910375826.9中的相关内容。

本发明所用到的仪器设备规格、来源说明如下：

脂质体挤压器：liposoeasyle-1，默格机械(上海)有限公司；

tem透射电子显微镜：tecnaif20fetem，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

透析袋：14kd，生工生物工程(上海)股份有限公司；

紫外分光光度计：lambda950，珀金埃尔默仪器(上海)有限公司；

微孔板检测仪：synergy2，美国伯腾biotek仪器有限公司；

电感耦合等离子体光学发射仪：ultima2，法国horibajobinyvon公司，用于测定rudpni的负载量；

实施例1介孔二氧化硅纳米球msn的制备

0.9614gctatos和0.14mltea加入50ml去离子水中，加热至60-80℃，搅拌1h。加入teos(2-2.5ml)持续搅拌2h。之后静置冷却至室温，离心收集介孔二氧化硅纳米球即msn。采用无水乙醇离心洗涤数次。沉淀分散在100ml的0.6％wt的硝酸铵乙醇溶液中，60℃萃取24h去除模板。11500rpm离心，沉淀用水和无水乙醇交替洗涤数次，重复3次萃取，得到msn保存在无水乙醇中。

实施例2一种介孔二氧化硅纳米球msn/药物纳米颗粒的制备

取30mg/ml的rudpni二甲亚砜溶液，加入采用实施例1的方法制备的msn，所加入的msn与小分子配合物rudpni的质量比为1:1，搅拌72h，5000rpm离心3min，然后用25ml水重新分散后再离心，得到载药硅介孔纳米颗粒(ru-msn)。

实施例3一种介孔二氧化硅纳米球msn/药物纳米颗粒的制备

与实施例2不同之处在于，加入的msn与小分子配合物rudpni的质量比为1.5:1。

实施例4一种介孔二氧化硅纳米球msn/药物纳米颗粒的制备

与实施例2不同之处在于，加入的msn与小分子配合物rudpni的质量比为1.75:1。

实施例5一种介孔二氧化硅纳米球msn/药物纳米颗粒的制备

与实施例2不同之处在于，加入的msn与小分子配合物rudpni的质量比为2:1。

实施例6一种介孔二氧化硅纳米球msn/药物纳米颗粒的制备

与实施例2不同之处在于，加入的msn与小分子配合物rudpni的质量比为2.5:1。

实施例7一种介孔二氧化硅纳米球msn/药物纳米颗粒的制备

与实施例2不同之处在于，加入的msn与小分子配合物rudpni的质量比为3:1。

实施例8一种介孔二氧化硅纳米球msn/药物纳米颗粒的制备

与实施例2不同之处在于，加入的msn与小分子配合物rudpni的质量比为10:3。

将实施例2-8制备得到的介孔二氧化硅纳米球msn及其载药(小分子配合物rudpni)纳米颗粒进行孔径、孔体积及比表面积并进行n2吸脱附实验，实验结果见图1和图2。

请参阅图1和图2，从图2实验结果可知负载rudpni后介孔二氧化硅纳米的孔径、比表面积均有减小，孔径和比表面积分别由8.565nm和1.156m³/g减小到6.435nm和0.660m³/g，说明介孔二氧化硅纳米msn负载了药物rudpni；通过电感耦合等离子体光学发射光谱法测出rudpni的负载量为14.0％。

实施例9靶向脂质体(lip)的合成

在洁净的50ml圆底烧瓶中加10ml三氯甲烷，溶解10mgdspc，2mg胆固醇，0.63mgdspe-peg2000。在40℃缓慢减压蒸发去除溶剂，在瓶壁上形成一层薄的、均匀的白色脂质体膜，真空干燥过夜。10mlph7.4的磷酸缓冲盐溶液pbs中加入脂质体膜，并加入0.5-1.0mg靶向蛋白及9.5-22mg的脂质体膜，脂质体膜与靶向蛋白的质量比为(19-22)：(1-2)。35℃再水化30min，缓慢的洗下脂质体膜。冰水浴，间歇超声30min。迅速用0.1μm滤膜的脂质体挤压器反复挤压约20次得到靶向脂质体(lip)。

实施例10靶向脂质体-msn-药物联合体系的制备

取100μl(16mg/ml)的实施例2-8制备得到的介孔二氧化硅纳米球msn/药物纳米颗粒，再加入800μl的实施例9，间歇震荡1h时硅介孔和脂质体膜融合，得到靶向介孔脂质体纳米颗粒通过6000rpm离心2min，去除多余的lip，得到靶向硅介孔脂质体纳米颗粒(ru-msn-lip)，分散在10ml的0.5xpbs中。通过tem表征形貌、大小，详细结果见图3所示。

实施例11载体缓释效果测定

取0.5-10μg/ml的rudpni，测定紫外吸光度(abs＝264nm)，根据吸收值，拟合出标准曲线。

将5ml的ru-msn-lip(含有2.8mgrudpni)加入透析袋中，分别置于100mlph7.4和ph5.0的pbs中。

37℃条件下搅拌，不同时间点取透析外液，测定紫外吸光度，通过标准曲线定量释放出来的rudpni的量，详见图4所示。

实施例12lip/msn/药物体系的细胞毒性测试

采用国际通用的mtt法对材料毒性进行分析。受试对象helf、h1299、hela、hepg2细胞。

helf、h1299、hela、hepg2细胞与上述实施例3中由不同前体配比制备得到的ru-msn-lip共培养48h，培养基为dmem。之后于各孔分别加入mtt(5mg/ml,20μl)，37℃下共培养4h。小心除去上清液，加入150μldmso，37℃下于摇床上轻摇10min。取50μl样品上清液置于微孔板检测仪(bio-rad550)于波长570nm下读数测定od值。细胞存活率用如下公式计算：

细胞存活率＝(od处理-od空白)/(od对照-od空白)x100％

其中od处理是由材料处理的细胞获得，od空白是从培养基经相同mtt处理步骤获得，od对照是从未经材料处理的细胞获得。

请参阅图5、图6，实验结果表明，靶蛋白标记的lip包裹ru-msn对h1299肿瘤的靶向明显，对的细胞毒性随浓度增大明显增加，对h1299细胞的抗肿瘤活性是正常细胞毒性(helf细胞)的4.18倍，具有靶向肿瘤效果，可减少副作用。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。