本发明属于生物制药领域，涉及一种联合疫苗，该疫苗由无细胞百白破、b型流感嗜血杆菌多糖蛋白结合、a群c群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物等组成。
背景技术：
百白破疫苗是由百日咳疫苗组分、白喉疫苗组分、破伤风疫苗组分混合而成，用以预防百日咳、白喉、破伤风三种细菌感染的多联疫苗。无细胞百白破疫苗的抗原组份(百日咳组份)由共沉淀法生产。由于百日咳杆菌的特殊培养特性，其在生长过程中产生的主要抗原成份比例有明显差异，使得共沉淀法生产的百日咳抗原组份批间差异明显，疫苗成品质量控制难度大，疫苗效力不稳定。因此，通过单独提纯百日咳抗原成份的方法，将百日咳主要抗原成份分别提取纯化后按一定比例混合所生产的疫苗能够有效地控制疫苗批间差异，降低疫苗质量控制难度，降低疫苗质量控制成本；还能够有效地去除疫苗中能够引起不良反应的成份，减少免疫接种后不良反应发生率及不良反应程度。
脑膜炎奈瑟氏菌是引起流行性脑脊髓膜炎(以下简称流脑)的病原菌，根据其荚膜多糖的特异性可将脑膜炎奈瑟氏球菌分成13个血清群，所有血清群的细菌均可致病，其中a、b、c、y和w1355个血清群占发生病例的95％以上，以a、c群传染性最强，是引起流脑流行最常见的菌株。在高度流行的国家(非洲、亚洲和南美)流脑的平均发病率是10/10万，流行期间发病率高达500/10万。国内各血清群流脑发病从11月开始增加，次年2-4月达高峰，至7月病例降至最低。2006-2014年冬春季流脑高发期(1-4月)，全国共报告a群、b群、c群和w135群流脑分别为150例、27例、181例和15例，分别占各群流脑发总数的82.52％、51.22％、66.10％和71.43％。由于a群c群流脑疫苗的使用，国内自2010年起，a群、c群流脑报告发病数持续下降。
流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae，hi)是一种革兰氏阴性小杆菌，是引起小儿呼吸系统原发性感染和病毒性疾病继发感染的重要致病菌，通常有荚膜型和非荚膜型两大类。按其荚膜多糖抗原的特异性分为a～f六个血清型和不可分的流感嗜血杆菌(non-typhiablehi，nthi)，其中b型流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzaetypeb，hib)的致病性最强，可引起多器官、组织的侵袭性感染，如化脓性脑膜炎、关节炎、会厌炎、肺炎、败血症、骨髓炎等，其中危害最大、病死率最高的是化脓性脑膜炎和肺炎。b型流感嗜血杆菌疾病是一种儿童疾病，主要发生在6个月至7岁，其中8～9月龄婴幼儿发病率最高，1岁以下婴幼儿发病率约占40％，18月龄以下婴幼儿发病率约占60～70％，5岁以下儿童发病率达到90％，而7岁以后发病率显著降低。发达国家的流行病学资料显示，北美和欧洲国家的5岁以下儿童仅脑膜炎的发病率高达30～60/10万，病死率为5％，致残率达30～40％；其中hib引起的化脓性脑膜炎占小儿化脓性脑膜炎约50％，且具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点。而hib引起的肺炎也是不容忽视的问题，国内外已有的资料表明，b型流感嗜血杆菌肺炎占小儿肺炎约30％。发展中国家估计每年约有482，000例肺炎，导致5岁以下儿童死亡，占全部肺炎发病率的16％(不包括风疹和麻疹)，其中67％发生在婴儿期，但在2个月之前只有5％。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种联合疫苗，该疫苗由无细胞百白破、b型流感嗜血杆菌多糖蛋白结合、a群c群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物等组成的六价联合疫苗。
该疫苗可以一针预防多种疾病，并且安全有效，质量均一，适宜于大规模工业化生产降低使用成本，便于推广。
具体而言，本发明的联合疫苗，由a组分和b组分组成，
其中，a组分为现有产品，可以在市场上购买到，药品通用名称为:ac群脑膜炎球菌(结合)b型流感嗜血杆菌(结合)联合疫苗。
具体的，a组分由a群脑膜炎球菌多糖－破伤风类毒素结合物原液、c群脑膜炎球菌多糖－破伤风类毒素结合物原液、b型流感嗜血杆菌多糖－破伤风类毒素结合物原液组成；
其中，b组分由百日咳类毒素(pt)、百日咳丝状凝血素(fha)、百日咳粘附素(prn)、白喉类毒素(dt)、破伤风类毒素(tt)组成。
其中，每1ml的a组分中，含有：
a群脑膜炎球菌多糖－破伤风类毒素结合物原液(按多糖含量计算)10-40μg，优选为23μg；
c群脑膜炎球菌多糖－破伤风类毒素结合物原液(按多糖含量计算)10-40μg，优选为23μg；
b型流感嗜血杆菌多糖－破伤风类毒素结合物原液(按多糖含量计算)10-40μg，优选为23μg。
其中，a群脑膜炎球菌多糖－破伤风类毒素结合物原液的制备：
将纯化后的a群脑膜炎球菌多糖溶解后，使用溴化氰、乙二酰肼衍生多糖，制备多糖衍生物；多糖衍生物与破伤风类毒素原液混合后，加入edac反应，制备多糖－破伤风类毒素结合物；随后将多糖－破伤风类毒素结合物经s－400hr分子筛纯化后除菌过滤，即得。
其中，b组分由氢氧化铝佐剂吸附后的百日咳类毒素(pt)、百日咳丝状凝血素(fha)、百日咳粘附素(prn)、白喉类毒素(dt)、破伤风类毒素(tt)组成。
其中，b组分中各种成分的含量分别为：
百日咳类毒素(pt)，50μg/ml；
百日咳丝状凝血素(fha)，50μg/ml；
百日咳粘附素(prn)，16μg/ml；
白喉类毒素(dt)，25lf/ml；
破伤风类毒素(tt)，7lf/ml；
氢氧化铝佐剂，1.0～1.5mg/ml。
本发明的联合疫苗，a组分，b组分，二者分别独立包装。
a组分，b组分，可以制备成任何常规规格，优选为：0.6ml/支。
本发明的另一个目的在于提供联合疫苗的制备方法。
其中，a组分为现有市售产品。
a组分由a群流行性脑膜炎球菌多糖结合物、c群流行性脑膜炎球菌多糖结合物、b型流感副嗜血杆菌多糖结合物组成。a成分按以下方法制备：
(1)菌种库制备：
a群脑膜炎球菌菌种库建立：将购自于中国食品药品检定研究院的a群脑膜炎球菌cmcc29201(a4)菌株，接种于适宜的培养基，在适宜的温度下培养后，按照《中国药典》相关要求，建立主代及工作代种子库。
c群脑膜炎球菌菌种库建立：将购自于中国食品药品检定研究院的c群脑膜炎球菌cmcc29205(c11)菌株，接种于适宜的培养基，在适宜的温度下培养后，按照《中国药典》相关要求，建立主代及工作代种子库。
b型流感嗜血杆菌菌种库建立：将购自于中国食品药品检定研究院的b型流感嗜血杆菌cmcc58534菌株，接种于适宜的培养基，在适宜的温度下培养后，按照《中国药典》相关要求，建立主代及工作代种子库。
(2)多糖抗原纯化：
a群脑膜炎球菌多糖抗原纯化：已杀菌的发酵产物离心，收集上清，使用10％十六烷基三甲基溴化铵溶液除核酸；再用75～80％乙醇沉淀粗制多糖。粗制多糖经酚抽提、超滤、乙醇沉淀等步骤后即得纯化多糖。纯化多糖可以真空干燥后置于-20℃以下保存。
c群脑膜炎球菌多糖抗原纯化：操作同a群脑膜炎球菌多糖抗原纯化步骤。
b型流感嗜血杆菌多糖抗原纯化：已杀菌的发酵产物离心，收集上清，使用10％十六烷基三甲基溴化铵溶液除核酸；再用75～80％乙醇沉淀粗制多糖。粗制多糖经酚抽提、超滤、乙醇沉淀等步骤后即得纯化多糖。纯化多糖可以真空干燥后置于-20℃以下保存。
(3)多糖抗原蛋白结合物制备：
a群脑膜炎球菌多糖－破伤风类毒素结合物原液制备：纯化后的a群脑膜炎球菌多糖溶解后，使用溴化氰、乙二酰肼衍生多糖，制备多糖衍生物；多糖衍生物与破伤风类毒素原液混合后，加入edac反应，制备多糖－破伤风类毒素结合物；多糖结合物经s－400hr分子筛纯化后除菌过滤，即为结合物原液。
c群脑膜炎球菌多糖－破伤风类毒素结合物原液制备：操作同a群脑膜炎球菌多糖－破伤风类毒素结合物原液制备步骤。
b型流感嗜血杆菌多糖－破伤风类毒素结合物原液制备：操作同a群脑膜炎球菌多糖－破伤风类毒素结合物原液制备步骤。
(4)a成分制剂配方：
按照每1ml半成品中含：
a群脑膜炎球菌多糖－破伤风类毒素结合物(按多糖含量计算)23μg；
c群脑膜炎球菌多糖－破伤风类毒素结合物(按多糖含量计算)23μg；
b型流感嗜血杆菌多糖－破伤风类毒素结合物(按多糖含量计算)23μg；
铝离子0.8mg；
氯化钠8.5mg；
进行配制。
配制完成后，分装、冻干、压盖后，即为a组分。
其中，b组分，按以下方法制备：
(1)菌种库制备(可以按照常规方法建立)：
百日咳杆菌菌种库的建立：将购自于中国食品药品检定研究院的百日咳原始菌种(编号58003)接种于适宜的培养基，在适宜的温度下培养后，按照《中国药典》相关要求，建立主代及工作代种子库。
白喉棒状杆菌菌种库的建立：将购自于中国食品药品检定研究院的白喉棒状杆菌原始菌种(编号38007)接种于适宜的培养基，在适宜的温度下培养后，按照《中国药典》相关要求，建立主代及工作代种子库。
破伤风芽孢杆菌菌种库的建立：将购自于中国食品药品检定研究院的破伤风厌氧芽孢杆菌(编号64008)接种于适宜的培养基，在适宜的温度下培养后，按照《中国药典》相关要求，建立主代及工作代种子库。
(2)抗原纯化：
百日咳类毒素(pt)和百日咳丝状凝血素(fha)纯化：
取离心发酵产物，分离菌体与发酵上清。发酵上清使用硫酸铵分级沉淀法粗纯化百日咳抗原。粗制抗原，使用离子交换层析法进一步纯化，得到高纯度pt和含有少量pt的fha。离子交换得到的fha及pt混合物经过s-200分子筛凝胶分离后得到高纯度fha。
百日咳粘附素(prn)纯化：
菌体匀化后，抽提液抽提。使用硫酸铵分级沉淀粗纯化prn。prn粗提抗原经过离子交换层析，得到纯化的prn尚残余极少量pt，使用分子筛凝胶层析做进一步纯化。
白喉类毒素(dt)纯化
发酵液离心，取上清，硫酸铵分级沉淀抗原蛋白。白喉粗提抗原使用离子交换层析纯化，得到高纯度dt毒素，
破伤风类毒素(tt)纯化
发酵液离心，取上清，硫酸铵分级沉淀抗原蛋白。破伤风粗提抗原使用离子交换层析纯化，得到高纯度tt毒素，
(3)抗原脱毒：
百日咳类毒素(pt)脱毒：
使用缓冲溶液等将pt浓度控制在400μg/ml以下，搅拌均匀。使用浓度为0.05～1％的戊二醛脱毒。脱毒后加入终浓度为0.05～0.5％的丙氨酸溶液，于室温再反应2～4h，脱毒完成。
百日咳丝状凝血素(fha)脱毒：
使用缓冲溶液等控制fha浓度不高于800μg/ml，搅拌均匀。参照适当程序加入甲醛，至终浓度为0.1～1％。加入甲醛溶液后继续放置35～37℃环境1～5h。加入β-丙氨酸溶液，持续脱毒至结束。
白喉类毒素(dt)脱毒：
白喉毒素的脱毒采用传统的甲醛法。向毒素溶液中加入使用赖氨酸，使其终浓度为0.1～0.5m，充分混匀。最后加入甲醛溶液，使其终浓度为0.1～0.5％，充分混匀。室温(18～22℃)放置3～4周。脱毒完全后，则转入30～32℃继续放置以加深脱毒。
破伤风类毒素(tt)脱毒
适当稀释的破伤风毒素，加适量40％甲醛溶液。混匀后置于25～37℃条件下孵育，再加入适量赖氨酸溶液，适宜温度下反应，直至脱毒完全。
(4)取上步所得百日咳类毒素(pt)，百日咳丝状凝血素(fha)，白喉类毒素(dt)，破伤风类毒素(tt)和百日咳粘附素(prn)，经过氢氧化铝佐剂吸附后，原液蛋白浓度按照pt50μg/ml、fha50μg/ml、prn16μg/ml、dt25lf/ml、tt7lf/ml计算，准确称量所需体积，即得。其中，氢氧化铝佐剂，1.0～1.5mg/ml。
其中，b组分，按以下方法制备：
b组分由氢氧化铝佐剂吸附后的百日咳类毒素(pt)、百日咳丝状凝血素(fha)、百日咳粘附素(prn)、白喉类毒素(dt)、破伤风类毒素(tt)用按一定比例组成。
上述b组分按以下方法制备：
2.1、菌种库制备：
百日咳杆菌菌种库的建立：将购自于中国食品药品检定研究院的百日咳原始菌种(编号58003)接种于适宜的培养基，在适宜的温度下培养后，按照《中国药典》相关要求，建立主代及工作代种子库。
白喉棒状杆菌菌种库的建立：将购自于中国食品药品检定研究院的白喉棒状杆菌原始菌种(编号38007)接种于适宜的培养基，在适宜的温度下培养后，按照《中国药典》相关要求，建立主代及工作代种子库。
破伤风芽孢杆菌菌种库的建立：将购自于中国食品药品检定研究院的破伤风厌氧芽孢杆菌(编号64008)接种于适宜的培养基，在适宜的温度下培养后，按照《中国药典》相关要求，建立主代及工作代种子库。
2.2、抗原纯化：
2.2.1、pt及fha纯化
离心发酵产物，分离菌体与发酵上清。发酵上清使用硫酸铵分级沉淀法粗纯化百日咳抗原。粗制抗原，使用离子交换层析法进一步纯化，得到高纯度pt和含有少量pt的fha。离子交换得到的fha及pt混合物经过s-200分子筛凝胶分离后得到高纯度fha。
2.2.2、prn纯化
菌体匀化后，抽提液抽提。使用硫酸铵分级沉淀粗纯化prn。prn粗提抗原经过离子交换层析，得到纯化的prn尚残余极少量pt，因此，使用分子筛凝胶层析做进一步纯化。
2.2.3、dt纯化
发酵液离心，取上清，硫酸铵分级沉淀抗原蛋白。白喉粗提抗原使用离子交换层析纯化，得到高纯度dt毒素。所得产物纯度不低于1500lf/mgpn。
2.2.4、tt纯化
发酵液离心，取上清，硫酸铵分级沉淀抗原蛋白。破伤风粗提抗原使用离子交换层析纯化，得到高纯度tt毒素。所得产物纯度不低于1500lf/mgpn。
2.3、抗原脱毒：
2.3.1、pt脱毒
使用缓冲溶液等将pt浓度控制在400μg/ml以下，搅拌均匀。使用浓度为0.05～1％的戊二醛脱毒。脱毒后加入终浓度为0.05～0.5％的丙氨酸溶液，于室温再反应2～4h，脱毒完成。
2.3.2、fha脱毒
使用缓冲溶液等控制fha浓度不高于800μg/ml，搅拌均匀。参照适当程序加入甲醛，至终浓度为0.1～1％。加入甲醛溶液后继续放置37℃环境1～5h。加入β-丙氨酸溶液，持续脱毒至结束。
2.3.3、dt脱毒
白喉毒素的脱毒采用传统的甲醛法。向毒素溶液中加入使用赖氨酸，使其终浓度为0.1～0.5m，充分混匀。最后加入甲醛溶液，使其终浓度为0.1～0.5％，充分混匀。室温(18～22℃)放置3～4周。脱毒完全后，则转入30～32℃继续放置以加深脱毒。
2.3.4、tt脱毒
适当稀释的破伤风毒素，加适量40％甲醛溶液。混匀后置于25～37℃条件下孵育，再加入适量赖氨酸溶液，适宜温度下反应，直至脱毒完全。
2.4、b成分制剂配方：
b成分包含百日咳抗原组分pt、fha、prn、dt、tt及氢氧化铝佐剂。含量分别为：pt，50μg/ml；fha，50μg/ml；prn，16μg/ml；dt，25lf/ml；tt，7lf/ml；氢氧化铝佐剂，1.0～1.5mg/ml。
3、本发明的联合疫苗的制备
本发明由a、b两个组分组成，其中a为固态冻干制剂形式，b为液态制剂形式，使用前混合即可。使用前，将液态的b组分充分混匀，通过预填充注射器或一次性注射器与固态a组分充分混合，完全溶解a组分后抽入注射器注射。
本发明通过优化制备工艺和制剂配方，将两种可以单独使用的多联多价疫苗(a组分和b组分)联合使用，达到一次免疫预防多种疫病的目的，减少接种次数，减少使用成本，节省社会医疗资源。a组分已经上市销售，b组分已经进放临床试验阶段。
b组分的五种组成抗原(pt、fha、prn、dt、tt)经过传统的盐析沉淀后再使用离子交换或分子筛层析等工艺进一步分离纯化，得到纯度非常高的抗原组分。单组分抗原纯度可达到95％以上，有利于减小产品不良反应发生率。优于目前市售的同类国产疫苗(全细胞及共纯化百白破产品)。
prn抗原组分在经过盐析和两步层析纯化后，prn组分中残留的百日咳毒素pt非常少。将prn浓高增大至4～8倍，prn组分中残留的pt依然不能在小鼠组胺致敏实验中致死小鼠。prn组分可以不经过脱毒剂处理直接制备成疫苗原液。因为prn保持了天然蛋白性质，所以有非常好的抗原性和免疫原性。
五种抗原经过脱毒、超滤等相应处理后，再以一定的比例混合，制成b组分。该工艺有利于产品质量控制，减小批间差异性。优于目前市售的同类国产疫苗(全细胞及共纯化百白破产品)。
具体实施方法
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1：
a组分：ac群脑膜炎球菌多糖结合物、b型流感嗜血杆菌多糖结合物制备
ac群脑膜炎球菌(结合)b型流感嗜血杆菌(结合)联合疫苗是我公司已上市销售的品种，现将其制造工艺描述如下：
1、各组分抗原制备(a、c群脑膜炎球菌多糖；hib多糖)
1.1、a群脑膜炎球菌多糖制备
将购自于中国食品药品检定研究院的a群脑膜炎球菌cmcc29201(a4)菌株，接种于含10％羊血的普通琼脂培养基上，于36±1℃二氧化碳环境培养16～20小时，长出光滑、湿润、灰白色的菌落，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中呈现均匀混悬液。原始种子批视为0代，主代种子批为第2代，工作种子批为第4代。取生长良好的细菌培养物，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，作为菌种库。按照《中国药典》相关要求，建立主代及工作代种子库。
开启a群脑膜炎球菌工作种子批菌种2支，转接到脑膜炎球菌改良半综合固体培养基中，共接种1～4支。置培养箱内于36±1℃、5～10％二氧化碳条件下培养，培养时间不超过24小时。培养结束后取样，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
经过复苏的菌种分别接种于30l、100l、1000l脑膜炎球菌改良半综合液体培养基中，采用发酵罐进行培养。培养过程中控制温度36±1℃，罐内压力0.01～0.02mpa，ph值7.0±0.2，培养时间不超过10小时。培养结束后取样，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
于对数生长后期或静止期前期收获，取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，镜检合格后在收获的培养液中加入甲酸溶液，至甲酸溶液终浓度为1％(w/w)，搅拌30～60分钟后静置4小时以上。
将已杀菌的单一收获物(或合并收获物)高速离心(8000rpm以上)去菌体。收集上清液或将上清液超滤浓缩后，加入10～20％十六炕基三甲基溴化铵溶液，加量为0.5～1.5％(具体加社通过十六烧基三甲基溴化铵加批试验确定)。添加后，充分混匀，静置3小时以上，形成沉淀物。高速离心(8000rpm以上)收集沉淀物，加入终浓度为1mol/l氯化钙溶液，在均质罐中均质，使多糖与十六烧基三甲基溴化铵解离；加入乙醇至终浓度为25％，2～8℃静置3小时以上。离心收集澄清的上清液，离心条件：4200rpm、10±2℃、40～60分钟。
于上述上清液中加入冷乙醇至终浓度为75～80％，充分混匀，静置3小时以上。离心收集沉淀多糖，离心条件：4200rpm、10±2℃、9～11分钟。将沉淀物研碎，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，洗涤后离心收集沉淀物。将沉淀物移入旋转蒸发器瓶内，真空干燥，收集多糖粗制品。多糖粗制品保存在－20℃以下，待纯化。
将多糖粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10～20mg/ml；按1:1～1:2比例用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和中性醋酸钠溶液)提取数次。离心收集上清液，离心条件为：4200rpm、10±2℃、55～65分钟。上清液称重，用9倍重量0.1mol/l氯化钙溶液或其他适宜溶液稀释后，用100kd超滤膜浓缩至原体积，然后用4倍重量的0.1mol/l氯化钙溶液超滤3次。采用100kd超滤膜包超滤5次去除内毒素。再加乙醇至终浓度为75～80％，搅拌均匀，静置3小时以上。离心收集沉淀，离心条件：4200rpm、10±2℃、9～11分钟。将沉淀物研碎，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，洗涤后离心收集沉淀物。将沉淀物移入旋转蒸发器瓶内，真空干燥，收集精制多糖，密封后置-20℃以下保存。纯化过程应尽械在15℃以下进行。
1.2、c群脑膜炎球菌多糖制备
将购自于中国食品药品检定研究院的c群脑膜炎球菌cmcc29205(c11)菌株，接种于含10％羊血的普通琼脂培养基上，于36±1℃二氧化碳环境培养16～20小时，长出光滑、湿润、灰白色的菌落，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中呈现均匀混悬液。原始种子批视为0代，主代种子批为第2代，工作种子批为第4代。取生长良好的细菌培养物，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，作为菌种库。按照《中国药典》相关要求，建立主代及工作代种子库。
开启c群脑膜炎球菌工作种子批菌种2支，转接到脑膜炎球菌改良半综合固体培养基中，共接种1～4支。置培养箱内于36±1℃、5～10％二氧化碳条件下培养，培养时间不超过24小时。培养结束后取样，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
经过复苏的菌种分别接种于30l、100l、1000l脑膜炎球菌改良半综合液体培养基中，采用发酵罐进行培养。培养过程中控制温度36±1℃，罐内压力0.01～0.02mpa，ph值7.0±0.2，培养时间不超过10小时。培养结束后取样，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
于对数生长后期或静止期前期收获，取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，镜检合格后在收获的培养液中加入甲酸溶液，至甲酸溶液终浓度为1％(w/w)，搅拌30～60分钟后静置4小时以上。
将已杀菌的单一收获物(或合并收获物)高速离心(8000rpm以上)去菌体。收集上清液或将上清液超滤浓缩后，加入10％十六炕基三甲基溴化铵溶液，加量为0.5～1.5％(具体加社通过十六烧基三甲基溴化铵加批试验确定)。添加后，充分混匀，静置3小时以上，形成沉淀物。高速离心(8000rpm以上)收集沉淀物，加入终浓度为1mol/l氯化钙溶液，在均质罐中均质，使多糖与十六烧基三甲基溴化铵解离；加入乙醇至终浓度为25％，2～8℃静置3小时以上。离心收集澄清的上清液，离心条件：4200rpm、10±2℃、40～60分钟。
于上述上清液中加入冷乙醇至终浓度为75～80％，充分混匀，静置3小时以上。离心收集沉淀多糖，离心条件：4200rpm、10±2℃、9～11分钟。将沉淀物研碎，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，洗涤后离心收集沉淀物。将沉淀物移入旋转蒸发器瓶内，真空干燥，收集多糖粗制品。多糖粗制品保存在－20℃以下，待纯化。
将多糖粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10～20mg/ml；按1:1～1:2比例用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和中性醋酸钠溶液)提取数次。离心收集上清液，离心条件为：4200rpm、10±2℃、55～65分钟。上清液称重，用9倍重量0.1mol/l氯化钙溶液或其他适宜溶液稀释后，用100kd超滤膜浓缩至原体积，然后用4倍重量的0.1mol/l氯化钙溶液超滤3次。采用100kd超滤膜包超滤5次去除内毒素。再加乙醇至终浓度为75～80％，搅拌均匀，静置3小时以上。离心收集沉淀，离心条件：4200rpm、10±2℃、9～11分钟。将沉淀物研碎，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，洗涤后离心收集沉淀物。将沉淀物移入旋转蒸发器瓶内，真空干燥，收集精制多糖，密封后置-20℃以下保存。纯化过程应尽械在15℃以下进行。
1.3、b型流感嗜血杆菌多糖制备
将购自于中国食品药品检定研究院的b型流感嗜血杆菌cmcc58534菌株，接种于hib综合固体培养基上，于36±1℃培养不超过18小时，刮取菌苔，在生理氯化钠溶液中呈现均匀混悬液。原始种子批视为0代，主代种子批为第2代，工作种子批为第4代。取生长良好的细菌培养物，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，作为菌种库。按照《中国药典》相关要求，建立主代及工作代种子库。
开启b型流感嗜血杆菌工作种子批菌种2支，转接到hib固体培养基中，共接种1～4支。置培养箱内于36±1℃、培养时间不超过24小时。培养结束后取样，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
经过复苏的菌种分别接种于30l、100l、1000l脑膜炎球菌改良半综合液体培养基中，采用发酵罐进行培养。培养过程中控制温度36±1℃，罐内压力0.01～0.02mpa，ph值7.0±0.2，培养时间不超过10小时。培养结束后取样，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
于对数生长后期或静止期前期收获，取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，镜检合格后在收获的培养液中加入甲酸溶液，至甲酸溶液终浓度为1％(w/w)，搅拌30～60分钟后静置4小时以上。
将已杀菌的单一收获物(或合并收获物)高速离心(8000rpm以上)去菌体。收集上清液或将上清液超滤浓缩后，加入10％十六炕基三甲基溴化铵溶液，加量为0.5～1.5％(具体加社通过十六烧基三甲基溴化铵加批试验确定)。添加后，充分混匀，静置4小时以上，形成沉淀物。高速离心(8000rpm以上)收集沉淀物，加入终浓度为1mol/l氯化钙溶液，在均质罐中均质，使多糖与十六烧基三甲基溴化铵解离；加入乙醇至终浓度为25％，2～8℃静置3小时以上。离心收集澄清的上清液，离心条件：4200rpm、10±2℃、40～60分钟。
于上述上清液中加入冷乙醇至终浓度为75～80％，充分混匀，静置3小时以上。离心收集沉淀多糖，离心条件：4200rpm、10±2℃、9～11分钟。将沉淀物研碎，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，洗涤后离心收集沉淀物。将沉淀物移入旋转蒸发器瓶内，真空干燥，收集多糖粗制品。多糖粗制品保存在－20℃以下，待纯化。
将多糖粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10～20mg/ml；按1:1～1:2比例用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和中性醋酸钠溶液)提取数次。离心收集上清液，离心条件为：4200rpm、10±2℃、55～65分钟。上清液称重，加入9倍重量纯化水稀释后，经50kd超滤膜浓缩至原体积，用9倍重批纯化水超滤1次，然后用4倍重量的0.1mol/l氯化钙溶液超滤3次。再加乙醇至终浓度为75～80％，搅拌均匀，静置3小时以上。离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，离心收集沉淀物移入旋转蒸发器瓶内，真空干燥。收集精制多糖，密封后置-20℃以下保存。纯化过程应尽量在15℃以下进行。
2、各组分多糖结合物制备(a、c群脑膜炎球菌多糖结合物；hib多糖结合物)
2.1、a群脑膜炎球菌多糖结合物制备
用注射用水溶解多糖至5～10mg/ml，每1mg多糖加入0.8mg溴化氢，室温反应1～2小时；调ph值至7.5±0.2；随后，每1mg多糖加入已二酰阱(adh)5.0mg，控制ph值为7.5±0.2，室温反应30分钟，2～8℃放置过夜，超滤去除过量的浪化氮、已二酰阱，制成多糖衍生物。
多糖衍生物中按1:1比例加入纯化破伤风类毒素原液(以蛋白含量计算)，混匀后调ph值至7.5±0.2，每1000mg反应液加20mg碳二亚胺(edac)，控制ph值在7.5±0.2范围内，反应2小时，反应结束后用0.5mol/lnacl溶液超滤去除过量的edac，制成多糖－破伤风类毒素结合物。
多糖－破伤风类毒素结合物经sephacryls-400hr层析纯化，收集相应洗脱峰，作适当稀释后经0.22μm无菌滤膜过滤后，即为结合物原液。
2.2、c群脑膜炎球菌多糖结合物制备
用注射用水溶解多糖至5～10mg/ml，每1mg多糖加入0.8mg溴化氢，室温反应1～2小时；调ph值至7.5±0.2；随后，每1mg多糖加入已二酰阱(adh)5.0mg，控制ph值为7.5±0.2，室温反应30分钟，2～8℃放置过夜，超滤去除过量的浪化氮、已二酰阱，制成多糖衍生物。
多糖衍生物中按1:1比例加入纯化破伤风类毒素原液(以蛋白含量计算)，混匀后调ph值至7.5±0.2，每1000mg反应液加20mg碳二亚胺(edac)，控制ph值在7.5±0.2范围内，反应2小时，反应结束后用0.5mol/lnacl溶液超滤去除过量的edac，制成多糖－破伤风类毒素结合物。
多糖－破伤风类毒素结合物经sephacryls-400hr层析纯化，收集相应洗脱峰，作适当稀释后经0.22μm无菌滤膜过滤后，即为结合物原液。
2.3、b群流感嗜血杆菌多糖结合物制备
用注射用水溶解多糖至5～10mg/ml，每1mg多糖加入0.8mg溴化氢，室温反应1～2小时；调ph值至7.5±0.2；随后，每1mg多糖加入已二酰阱(adh)5.0mg，控制ph值为7.5±0.2，室温反应30分钟，2～8℃放置过夜，超滤去除过量的浪化氮、已二酰阱，制成多糖衍生物。
多糖衍生物中按1:1比例加入纯化破伤风类毒素原液(以蛋白含量计算)，混匀后调ph值至7.5±0.2，每1000mg反应液加20mg碳二亚胺(edac)，控制ph值在7.5±0.2范围内，反应2小时，反应结束后用0.5mol/lnacl溶液超滤去除过量的edac，制成多糖－破伤风类毒素结合物。
多糖－破伤风类毒素结合物经sephacryls-400hr层析纯化，收集相应洗脱峰，作适当稀释后经0.22μm无菌滤膜过滤后，即为结合物原液。
3、半成品配制
按计算量向氯化铝浴液中加入氢氧化钠溶液，搅拌均匀，调节ph至6.0～7.0，备用。
按照每1ml半成品中含：
a群脑膜炎球菌多糖－破伤风类毒素结合物(按多糖含量计算)23μg；
c群脑膜炎球菌多糖－破伤风类毒素结合物(按多糖含量计算)23μg；
b型流感嗜血杆菌多糖－破伤风类毒素结合物(按多糖含量计算)23μg；
铝离子0.8mg；
氯化钠8.5mg；
进行配制。
半成品配制完成后，标明品名、批号、重量等，2～8℃密封存放，吸附8小时以上即为半成品。
4、a成分冻干
将灭菌后的灌装机配件依次安装，设定分装参数。将半成品放置在磁力搅拌器上，搅拌约5分钟后。将分装用管路插入半成品中，开启灌装机开始分装，装量为0.6ml/支。
分装后冻干封盖即为a成分。
二、b成分：无细胞百白破(组分)联合疫苗制备
1、各组分抗原制备(pt、fha、prn、dt、tt)
1.1、百日咳毒素(pt)、丝状血凝素(fha)的制备
将购自于中国食品药品检定研究院的百日咳原始菌种(编号58003)接种于包-姜氏培养基上，于35±1℃培养，第一代培养不超过72小时，之后各代不超过48小时。从培养基上刮取生长良好的菌苔，用脱脂牛奶混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，作为菌种库。按照《中国药典》相关要求，建立主代及工作代种子库。
离心发酵产物，分离菌体与发酵上清。发酵上清使用硫酸铵分级沉淀法粗纯化百日咳抗原。离心，收集沉淀，并用缓冲溶液复溶后透析，除去缓冲液中的nh4+。
透析后的pt、fha混合抗原超声波匀化后，使用离子交换介质(cm)层析柱吸附。介质淋洗后，使用合适的缓冲液洗脱液冲洗层析柱，并收集洗脱峰(高纯度pt)。更换合适洗脱液洗脱，收集洗脱峰，此峰为fha及少量pt的混合物。离子交换得到的fha及pt混合物经过s-200分子筛凝胶分离后得到高纯度fha。1.2、百日咳粘附素(prn)的制备
百日咳菌体匀化后，60℃水浴浸提1～2h，离心取上清。使用硫酸铵分级沉淀粗纯化prn。盐析物离心，收集上清，并透析粗制抗原，除去nh4+。
prn粗提抗原经过deae层析吸附，使用洗脱液洗脱，收集洗脱峰。经过离子交换纯化的prn尚残余极少量pt，因此，使用s-200凝胶层析做进一步纯化。1.3、白喉毒素(dt)的制备
将购自于中国食品药品检定研究院的白喉棒状杆菌原始菌种(编号38007)接种于适宜培养基上，于35±1℃培养24～48小时。刮取培养基生长良好的菌苔，用脱脂牛奶混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，作为菌种库。按照《中国药典》相关要求，建立主代及工作代种子库。
白喉杆菌发酵采用消化牛肉为主要成份。培养基配置时，还需要用氨水配置20％谷氨酸溶液，按比例添加消化牛肉液后添加生长因子。发酵过程，维持溶氧量在20％；罐压0.01～0.02mpa；初始搅拌速度300rpm，发酵中后期以不产生大量泡沫为准，控制搅拌速度与通气量。发酵过程中及时补充麦芽糖，以调整ph值在合适范围。发酵后期(发酵约36h后)，发酵液溶氧快速上升，则说明细菌生长代谢已进入平台期可以杀菌收获发酵液。杀菌使用终浓度为0.4％的甲醛，维持发酵液温度在20℃，作用30～60min。
使用na2co3调整并保持发酵液ph值在初纯化过程中偏向弱碱性，在20～30％硫酸铵存在的情况下沉淀并吸附一部分免疫原性较差的dt活性蛋白及大量无关蛋白或杂质，离心与过滤方式并用，除去纯化混合物中的沉淀和不溶物，收集上清液。再添加10～20％硫酸铵，沉淀大量纯度达标的dt活性物质。盐析获得的dt纯化物，用0.02～0.05mpb，ph6.0～7.0(a液)平衡deae层析柱，平衡后上样，上样结束用a液冲洗未掉结合蛋白，用5～10％b液(含nacl的0.02mpb)冲洗并收获目标蛋白，为精制白喉毒素。
1.4、破伤风毒素(tt)的制备
将购自于中国食品药品检定研究院的破伤风厌氧芽孢杆菌(编号64008)原始菌株接种于半固体碎肉培养基中管，放置于34±1℃孵箱内培养48小时。取生长良好的细菌培养物，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存，作为菌种库。按照《中国药典》相关要求，建立主代及工作代种子库。
在发酵罐中配制发酵培养基，调节转速到100～200rpm，搅拌10～20分种，调节ph值到7.59后，培养基灭菌。补加生长因子后，将二代菌种接种于发酵罐。毒素制造过程中应严格控制杂菌污染，经显微镜或纯菌试验发现污染者应废弃。产毒培养温度控制在35℃左右，随着温度的升高或降低产毒水平皆下降。如有需要可用naoh调节培养基ph值，将其控制在7.20～7.60之间。产毒培养时间控制在3-8天，一般为6天左右。发酵48小时后，每隔8-14小时搅拌一次，搅拌速度100rpm，搅拌20分种后静置。选择适当时机收获毒素，毒素除菌过滤后效价应不低于40lf/ml。
将收获的发酵液在离心，弃菌体，收集上清液。再经合适孔径超滤膜超滤浓缩约10倍。在2～8℃条件下，向浓缩后的离心上清中加入固体硫酸铵，至终浓度为25％，搅拌1h，使硫酸铵完全溶解后静置3～20小时。将静置过夜的盐析液在2～8℃，7000rpm条件离心20min，收集上清液，量出发酵上清体积。向离心上清液中加入固体硫酸铵，至终浓度为15％，，待硫酸铵完全溶解后静置3～20小时。将盐析液在2～8℃，8000rpm条件下离心30min，弃去上清液收集沉淀并称重。将离心所得沉淀用20倍其重量的0.02mpbph6.9溶液溶解，在2～8℃下搅拌1h，之后选用2～8℃，8000rpm条件离心20min，弃去沉淀杂质并收集上清液。
用0.02mpbph6.9缓冲液，30kda的膜包对上述上清液进行超滤，收集白喉抗原粗提液，于2～8℃暂存。
2、各组分类毒素原液制备(pt、fha、prn、dt、tt)
2.1、pt类毒素原液制备
纯化百日咳毒素根据测定的蛋白浓度，用缓冲溶液和甘油将蛋白浓度稀释至100～400μg/ml，最终甘油浓度为10～50％；加入氯化钠，使氯化钠终浓度为0.3m，搅拌均匀，将样品放入水浴锅内水浴至25～27℃，开始脱毒，在搅拌状态下向待脱毒样品中缓慢加入25％戊二醛溶液，至戊二醛终浓度为0.05～1％，25～27℃条件下作用20～60min后；搅拌缓慢加入30％丙氨酸溶液，使丙氨酸终浓度为0.05～0.3％，25～27℃条件下作用2～4h，脱毒结束。
脱毒后的pt超滤更换缓冲体系后与佐剂吸附即为pt类毒素原液。
2.2、fha原液制备
纯化百日咳丝状血凝素根据测定的蛋白浓度，用缓冲溶液稀释到800μg/ml；加入甘油溶液，使甘油终浓度为10～50％，搅拌均匀，分三次加入40％甲醛溶液，每次间隔30min，至终浓度为0.3～0.6％，自第一次加入甲醛溶液后放置35～37℃升温4h，室温放置4h后，2～8℃放置16～18小时；将样品从2～8℃取出后，加入30％β-丙氨酸溶液，至β-丙氨酸终浓度为0.3～0.8％，35～37℃放置7～14天，脱毒结束。
脱毒后的fha超滤更换缓冲体系后与佐剂吸附即为fha原液。
2.3、prn原液制备
纯化后的prn与佐剂吸附即为fha原液。
2.4、dt类毒素原液制备
白喉毒素的脱毒采用传统的甲醛法。纯化后的白喉毒素测定其絮状单位值(lf值)，使用a液，将毒素絮状单位值稀释到500～1000lf/ml。向毒素溶液中加入使用a液溶解的赖氨酸，使其终浓度为0.1～0.3m，充分混匀。最后加入甲醛溶液，充分混匀。使用冰醋酸调节脱毒体系ph后，置室温放置3～4周后，使用家兔检查脱毒是否完全，如果脱毒不完全，可再加入少量甲醛溶液继续脱毒。如果脱毒完全，则转入30～37℃继续放置2～3周以加深脱毒。脱毒完成后，类毒素用0.85％nacl溶液，截留分子量为30kda的膜包超滤。超滤后的类毒素使用0.22μm滤膜除菌过滤，测定lf值后2～8℃保存备用。
脱毒后的dt超滤更换缓冲体系后与佐剂吸附即为dt类毒素原液。
2.5、tt类毒素原液制备
用0.005mpb缓冲液将纯化破伤风毒素稀释至终浓度500～1000lf/ml；加入甲醛溶液至终浓度为0.06％(v/v)，37℃条件下孵育30min。加入3.4m赖氨酸溶液至终浓度为0.05～0.1m，调ph至6.5～7.5，置37℃±2孵育3～4周，脱毒结束。
脱毒后的tt超滤更换缓冲体系后与佐剂吸附即为tt类毒素原液。
3、半成品配制
根据吸附后原液蛋白浓度按照pt50μg/ml、fha50μg/ml、prn16μg/ml、dt25lf/ml、tt7lf/ml计算各批次组分原液加入体积。按照prn→dt→tt→fha→pt的次序，准确称量所需体积，依次加入持续搅拌的容器中。混合好的dtap半成品取样测ph，根据测定的ph，用0.1mhcl溶液或0.1mnaoh溶液调节半成品ph至5.8～7.2。
配置完成的半成品取样检测各项理化指标，并留足够样品做无菌检测。
4、b组分分装
按相关文件，将灭菌后的灌装机配件依次安装，设定分装参数。将半成品放置在磁力搅拌器上，搅拌约5分钟后。将分装用管路插入半成品中，开启灌装机开始分装，装量为0.6ml/支。
分装后即为组分b，也即是吸附无细胞百白破(组分)联合疫苗成品。
实施例2、
本发明中的b组分，为吸附无细胞百白破(组分)联合疫苗，目前国际上除了共沉淀白百破联合疫苗，还有多种配方的组分百白破联合疫苗。而国内上市的无细胞百白破联合疫苗主要以共沉淀方法生产，没有与我公司发明的组分百白破配方完全相同的产品在售。因此，我们选择国内在售的吸附无细胞百白破联合疫苗和未在国内销售的gsk产品infanrix作比较。
一、主要制造工艺对比
国内公司生产的吸附无细胞百白破联合疫苗为共沉淀工艺生产，与我公司产品主要差别在于百日咳抗原的获取和纯化方式。共沉淀方式将百日咳主要抗原pt(百日咳毒素)及fha(丝状凝血素)用沉淀方式同时获得，不能保证疫苗中pt及fha含量比例的批间一致性。而我公司的吸附无细胞百白破(组分)联合疫苗是将百日咳主要抗原pt、fha、rpn(粘附素)分别纯化，最终以固定的比例配成疫苗，能够有效地保证主要抗原的批间一致性。
gsk的infanrix为组分百白破疫苗，与我公司的无细胞百白破(组分)联合疫苗中百日咳抗原获取和处置方式近似，配方近似。
同类产品主要工艺和主要成分处方对比表
二、豚鼠全身过敏性试验对比
1、研究目的
观察吸附无细胞百白破(组分)联合疫苗经全身给药后对动物引起的过敏反应。
2、试验动物
健康普通级豚鼠，全白色毛，56只。
3、供试品和对照品
3.1、供试品
3.1.1、吸附无细胞百白破(组分)联合疫苗，北京智飞绿竹生物制药有限公司生产，选用实施例1疫苗。
3.2、对照品
3.2.1、吸附无细胞百白破联合疫苗(上市品)，批号为2013xxxx。
3.2.2、0.9％氯化钠注射液，无色澄明溶液，浙江国镜药业有限公司生产。
3.2.3、牛血清白蛋白，杭州捷程生物科技有限公司。
4、试验方法
根据国家食品药品监督管理局《药物非临床研究质量管理规范》、《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》和安全性评价机构制订的“主动全身过敏试验标准操作规程”的方法要求进行。
5、试验结论
在试验设定条件下，吸附无细胞百白破(组分)联合疫苗高剂量组对豚鼠过敏反应为阳性，反应率为50％，低剂量组对豚鼠无过敏反应。与批号为2013xxxx的国内上市品反应一致。
三、疫苗效价对比
1、研究目的
对比我公司吸附无细胞百白破(组分)联合疫苗与国内外已上市同类型产品在效力方面的差异。
2、试验动物
nih小鼠，参照2015版《中国药典》相关规定，不同试验选择合适日龄或体重动物。
3、供试品和对照品
吸附无细胞百白破(组分)联合疫苗，北京智飞绿竹生物制药有限公司生产，批号：批号1、批号2、批号3、批号4、批号5、批号6。
吸附无细胞百白破联合疫苗，国内公司生产，批号：2014xxxx。
infanrix，gsk生产，批号：hn2xx4、试验方法
效价检测，依照《吸附无细胞百白破(组分)联合疫苗制造及检定规程》效价测定方法进行。
对比试验通常在实验动物数量充裕的情况下择机进行，因此对比试验数据源自多次对比实验。
5、试验结果
*：同批次样品不同时间的检测结果。
6、试验结论
从试验结果看，我公司生产的吸附无细胞百白破(组分)联合疫苗，其百日咳、白喉、破伤风效力均达到《中国药典》2015版三部及我公司《吸附无细胞百白破(组分)联合疫苗制造及检定规程》要求，并且各组分效力均不低于国内外特定批次对照品。
由于受到篇幅的限制，上述实施例中仅列举实施例1的疫苗，实际上本发明的疫苗都能取得相同或者类似的效果。