CH5138303在制备抗轮状病毒药物中的应用的制作方法

本发明属于抗轮状病毒药物技术领域，涉及ch5138303在制备抗轮状病毒药物中的应用。

背景技术：

轮状病毒(rotavirus，rv)感染是导致婴幼儿腹泻的主要病因，每年引起约1.25亿例儿童胃肠炎，导致352,000-592,000例5岁以下儿童因轮状病毒感染死亡，主要发生在发展中国家。

轮状病毒属于呼肠弧病毒科，为无胞膜双链rna(dsrna)病毒，11条dsrna各缠绕1分子的rna依赖rna多聚酶(vp1)和1分子的鸟苷酸及甲基转移酶(vp3)位于病毒颗粒的核心，编码12种蛋白质，包括6种结构蛋白(vp1～4、6～7)与6种非结构蛋白(nsp1～6)。vp2构成轮状病毒的内层衣壳包裹病毒基因组；vp6构成的中层衣壳包绕vp2形成轮状病毒双层衣壳颗粒(dlp)；vp4和vp7构成的外层衣壳再包绕dlp形成完整的轮状病毒三层衣壳颗粒(tlp)。轮状病毒在受体的介导下穿过细胞膜进入细胞，脱掉外层衣壳形成dlp开始复制过程，新生成的病毒dsrna与蛋白在胞浆中聚集形成病毒质粒，并在其中组装生成dlp，dlp不具有感染能力，其随后进入内质网，与新合成的vp4和vp7装配成具有感染能力的tlp并分泌出宿主细胞，完成病毒的复制过程。

迄今为止，人们对轮状病毒感染机制研究还很不充分，临床上主要是对症治疗，缺乏直接针对病毒的安全有效的药物。传统的抗病毒药物γ干扰素及代谢类抗病毒药物由于毒副作用或效果不佳等原因较少用于抗轮状病毒感染。为降低感染率和死亡率，临床上对能够抗轮状病毒的特效药物有着十分紧迫的需求。

ch5138303(mw:415.9)是一种高口服生物利用度的hsp90抑制剂，其结构与目前常见的hsp90抑制剂如格尔德霉素(geldanamycin，ga，mw:560.64)及其衍生物tanespimycin(17-aag，mw:585.69)不同(如图1a～图1c所示)。ch5138303kd为0.48nm。ch5138303主要作用于hsp90α亚基，其对n-末端hsp90α具有高度的结合亲和力(kd＝0.52nm)。体外ch5138303对人癌细胞株hct116及nci-n87具有较强的抑制能力，ic50分别为0.098μm、0.066μm。ch5138303在小鼠体内具有较高的口服生物利用度(f＝44.0％)，在人nci-n87胃癌异种移植模型中具有较强的抗肿瘤作用(肿瘤生长抑制率＝136％)。然而迄今为止，国内外尚未见ch5138303在抗轮状病毒方面的相关报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供ch5138303在制备抗轮状病毒药物中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、ch5138303在制备抗轮状病毒药物中的应用。

优选的，所述抗轮状病毒药物为抗轮状病毒感染或预防重症致死性轮状病毒感染药物。

优选的，所述抗轮状病毒药物为适用于婴幼儿的抗轮状病毒药物。

2、一种抗轮状病毒药物，其有效成分包含ch5138303。

优选的，所述药物为ch5138303的单方或复方制剂。

优选的，所述药物的制剂形式选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液或注射液中的任一种。

本发明的有益效果在于：

本发明使用人肠上皮细胞caco-2感染轮状病毒wa株模型评价ch5138303对轮状病毒感染的作用，流式细胞术发现ch5138303显著抑制轮状病毒wa株感染肠上皮细胞caco-2，使其感染效率下降超过50％；同时通过检测新生病毒的滴度发现，ch5138303能强烈抑制活性轮状病毒的生成，不同浓度(10μm、1μm)ch5138303抑制效率分别为90％及80％；进一步，在乳鼠体内实验中，口服ch5138303能显著抑制轮状病毒感染导致的腹泻发生，并显著降低重症致死性轮状病毒感染的死亡率。上述实验结果说明，ch5138303能够通过抑制轮状病毒在细胞内建立感染，并阻止被感染的细胞生成有感染能力的新病毒，即抑制轮状病毒的感染和复制，从而达到抗轮状病毒效果，明显减轻轮状病毒感染引起的腹泻和死亡等不良后果。故以其为主要活性成分，有望研发出高效特异性抗轮状病毒药物，缓解轮状病毒腹泻发生，降低重症致死性轮状病毒感染死亡率，以满足临床治疗需要，保障人民身体健康。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1a、图1b和图1c分别为ch5138303、ga和17-aag的化学结构式。

图2为ch5138303显著抑制轮状病毒感染建立。

体外轮状病毒wa株感染人肠上皮细胞caco-2(moi＝1)，感染分为3组:模拟感染组(mockinfectcion)、感染+dmso组(rv+dmso)以及感染+ch5138303组(rv+10μμch5138303)，感染20h后流式细胞术检测被感染细胞的频率。

图3为ch5138303强烈抑制活性轮状病毒的生成。

体外轮状病毒wa株感染人肠上皮细胞caco-2(moi＝1)，感染分为5组:模拟感染组(mockinfectcion)、感染+dmso组(rv+dmso)、感染+ch5138303组(rv+1μμch5138303)、感染+geldanamycin组(rv+1μmgeldanamycin)以及感染+17-aag组(rv+10μm17-aag)，感染24h后免疫荧光集落法(ffa)检测培养上清中轮状病毒滴度。

图4为不同浓度的ch5138303对轮状病毒感染的抑制作用。

体外轮状病毒wa株感染人肠上皮细胞caco-2(moi＝1)，并在病毒液中加入不同浓度(10μm、1μm、100nm、10nm、1nm)的ch5138303(溶于dmso)，同体积dmso做阴性对照。病毒液吸收1h后，弃病毒液。1mldmem培养基洗涤细胞2次，每次3min。最后每孔加入1mldmem培养基(含对应浓度的ch5138303)置入细胞培养箱中继续培养24h。流式细胞术及ffa法检测感染效率及培养上清病毒滴度。

图5为ch5138303对轮状病毒乳鼠腹泻发生的影响。

选择5-7日龄balb/c仔鼠且体重为3.5-5.0g，灌胃感染5×10⁵pfu轮状病毒(sa11株)，然后放回母鼠笼中由母鼠喂养。在乳鼠感染0、8小时分别给药物ch5138303、geldanamycin及17-aag(均为10mg/kg)体重各1次，对照给药组为等体积dmso溶入等体积的0.01mpbs灌胃。

图6为ch5138303对重症致死性轮状病毒感染中乳鼠死亡率的影响。

选择5日龄balb/c仔鼠且体重为4.6-5g，灌胃感染2×10⁶pfu轮状病毒(sa11株)，然后放回母鼠笼中由母鼠喂养。在乳鼠感染0、8、16小时灌胃给ch5138303、geldanamycin及17-aag(均为10mg/kg)体重各1次，对照给药组为等体积dmso溶入等体积的0.01mpbs灌胃。

图7为cck-8检测ch5138303细胞毒性。

96孔板中接种5000个caco-2细胞，培养12h后细胞贴壁，然后分别加入终浓度为10μm的ch5138303、geldanamycin及17-aag，等体积的dmso做对照，同时设置一组无细胞对照。加入药物1h后，每孔中加入10μl的细胞毒检测试剂cck-8(购自碧云天公司)，继续培养2h后检测样本od450吸光值。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中涉及的ch5138303、geldanamycin(ga)和17-aag，它们的化学结构式分别如图1a、图1b和图1c所示。

1、ch5138303显著抑制轮状病毒感染建立

人肠上皮细胞caco-2(购自atcc，htb-37)接种于6孔细胞培养板，使用dmem高糖培养基+10％体积比的肽牛血清于37℃体积百分数5％co2细胞培养箱中培养。待细胞完全汇合时，使用轮状病毒wa株(购自atcc，vr-2018)感染(moi＝1)，感染分为3组:模拟感染组(mockinfectcion,使用等体积的dmem培养基代替病毒液)、感染+dmso组(rv+dmso,轮状病毒wa株感染并加入等量(同加入的ch5138303(购自selleck公司，s7340)溶液体积)dmso)以及感染+ch5138303组(rv+ch5138303,轮状病毒wa株感染并加入10μm的ch5138303(溶于dmso))。感染20h后，质量浓度0.25％胰蛋白酶-edta消化细胞,质量浓度4％多聚甲醛固定细胞15min，质量浓度1％triton-x-100通透细胞7min，0.01mpbs(ph7.3)洗涤细胞2次,fitc(异硫氰酸荧光素)标记山羊抗轮状病毒多克隆抗体(购自美国virostat公司)染色rv抗原(1:100稀释)，流式细胞术检测被感染细胞的频率(图2)。结果显示，ch5138303可显著抑制轮状病毒感染肠上皮细胞caco-2，使其感染能力下降超过50％。

2、ch5138303强烈抑制活性轮状病毒的生成

人肠上皮细胞caco-2接种于12孔细胞培养板，使用dmem高糖培养基+10％体积比的胎牛血清于37℃体积百分数5％co2细胞培养箱中培养。待细胞完全汇合时，使用轮状病毒wa株感染(moi＝1)，感染分为3组:模拟感染组(mockinfectcion,使用等体积(1ml)的dmem培养基代替病毒液)、感染+dmso组(rv+dmso,轮状病毒wa株感染并加入等量(同加入的ch5138303溶液体积)dmso)、感染+ch5138303组(rv+ch5138303,轮状病毒wa株感染并加入终浓度1μm的ch5138303(溶于dmso))、感染+geldanamycin组(rv+1μmgeldanamycin)以及感染+17-aag组(rv+10μm17-aag)。病毒液吸收1h后，弃病毒液。1mldmem培养基洗涤细胞2次，每次3min。最后每孔加入1mldmem培养基(不加胎牛血清)置入细胞培养箱中继续培养24h后，吸取培养上清到1.5mlep管中，2000g离心5min去细胞残渣，取100μl培养上清(含新生成的轮状病毒)并加入终浓度为10μg/ml胰蛋白酶37℃消化30min，将胰蛋白酶消化的培养上清100μl加入到96孔板中培养的ma104细胞(购自atcc，crl-2378)中(汇合度100％)，病毒液吸收1h后，吸取病毒液。100μldmem培养基(不加胎牛血清)洗涤细胞2次，每次3min。最后每孔加入100μldmem培养基(不加胎牛血清)置入细胞培养箱中继续培养20h后，质量浓度4％多聚甲醛固定细胞15min，质量浓度1％triton-x-100通透细胞7min，0.01mpbs洗涤细胞2次,fitc(异硫氰酸荧光素)标记山羊抗轮状病毒多克隆抗体(购自美国virostat公司，1:100稀释)染色轮状病毒抗原(室温3h)，0.01mpbs洗涤一次后吸干液体，置于奥林巴斯倒置荧光显微镜下观察感染的细胞并计算培养上清中病毒含量。结果显示，ch5138303强烈抑制活性轮状病毒的生成，10μmch5138303体外抑制90％活性轮状病毒的生成(图3)。

3、显示不同浓度的ch5138303对轮状病毒感染的抑制作用

人肠上皮细胞caco-2接种于12孔细胞培养板，使用dmem高糖培养基+10％体积比的胎牛血清于37℃5％co2细胞培养箱中培养。待细胞完全汇合时，使用轮状病毒wa株感染(moi＝1)，并在病毒液中加入不同浓度(10μm、1μm、100nm、10nm、1nm)的ch5138303(溶于dmso)，同体积dmso做阴性对照。病毒液吸收1h后，弃病毒液。1mldmem培养基洗涤细胞2次，每次3min。最后每孔加入1mldmem培养基(含对应浓度的ch5138303)置入细胞培养箱中继续培养24h。吸取培养上清到1.5mlep管中，检测新生病毒滴度，方法同图3；质量浓度0.25％胰蛋白酶-edta消化细胞以检测细胞感染率，方法同图2。结果显示，10μm及1μmch5138303均能显著抑制轮状病毒对肠上皮细胞的感染(抑制效率约50％)，100nm、10nm及1nmch5138303对轮状病毒对肠上皮细胞的感染不明显抑制作用。10μm、1μmch5138303均能有效抑制活性轮状病毒的生成，抑制效率分别为90％、80％；100nm、10nm、1nmch5138303不能有效抑制活性轮状病毒的生成。因此，体外1-10μmch5138303能有效的抑制轮状病毒感染及活性病毒的产生(图4)。

4、ch5138303显著缓解轮状病毒乳鼠腹泻症状

选择5-7日龄balb/c仔鼠(购自陆军军医大学实验动物中心)且体重为3.5-5.0g，灌胃感染5×10⁵pfu轮状病毒(sa11株，购自atccvr-1565)，然后放回母鼠笼中由母鼠喂养。在乳鼠感染0、8小时分别给药物ch5138303、geldanamycin及17-aag(均为10mg/kg)体重各1次。药物均为50mm的储液，溶剂为dmso。给药方式为将含相应质量的ch5138303储液用0.01mpbs稀释到50μl后灌胃。对照给药组用等量的0.01mpbs稀释等量的dmso到50μl后灌胃。结果显示对照组病毒感染16h部分乳鼠开始出现明显的腹泻症状(水样便)，感染24h后100％均出现腹泻症状；然而给药组感染24h时候只有20％均出现腹泻症状；说明ch5138303能显著抑制肠道轮状病毒感染引起的腹泻的发生(图5)。

5、ch5138303显著降低重症致死性轮状病毒感染模型中小鼠死亡率

首先建立重症致死性轮状病毒感染模型：选择5日龄balb/c仔鼠(购自陆军军医大学实验动物中心)且体重为4.6-5g，灌胃感染2×10⁶pfu轮状病毒(sa11株)，然后放回母鼠笼中由母鼠喂养。在乳鼠感染0、8、16小时灌胃给药物ch5138303、geldanamycin及17-aag(均为10mg/kg)体重各1次。药物均为50mm的储液，溶剂为dmso。给药方式为将含相应质量的ch5138303储液用0.01mpbs稀释到50μl后灌胃。对照给药组用等量的0.01mpbs稀释等量的dmso到50μl后灌胃。对照组病毒感染48h部分乳鼠死亡,感染72h后全部乳鼠死亡；然而给药组却能显著降低轮状病毒感染的致死率，给ch5138303感染72h后只有20％乳鼠死亡，且此后乳鼠不再死亡，说明ch5138303能显著降低重症轮状病毒感染致死率(图6)。

6、ch5138303细胞毒性显著较低。

细胞毒性是化合物成药的一项重要指标。我们在96孔板中接种5000个caco-2细胞，培养12h后细胞贴壁，然后分别加入终浓度为10μm的ch5138303、geldanamycin及17-aag，等体积的dmso做对照，同时设置一组无细胞对照。加入药物1h后，每孔中加入10μl的细胞毒检测试剂cck-8(购自碧云天公司)，继续培养2h后检测样本od450吸光值，od450值越高代表细胞毒性越小。结果显示，ch5138303的细胞毒性明显低于目前常用的ch5138303抑制剂geldanamycin及17-aag(图7)。

由上述结果可以判定，常见的hsp90抑制剂格尔德霉素及其衍生物17-aag在体外实验中虽然对轮状病毒的复制有比较明显的抑制作用，但乳鼠体内实验表明其抗轮状病毒腹泻能力以及预防重症致死性轮状病毒感染的能力差，故常见的hsp90抑制剂格尔德霉素及其衍生物17-aag并不适合制备婴幼儿抗轮状病毒感染的药物。

由上述结果可以判定，ch5138303能显著抑制轮状病毒感染肠上皮细胞，强烈抑制活性轮状病毒的生成，同时ch5138303具有较低的细胞毒性，在乳鼠体内ch5138303有效抑制轮状病毒腹泻的发生并显著降低重症致死性轮状病毒感染引起的乳鼠死亡率。其可作为活性成分，单独应用或与其它活性成分组成复方，采用药学上可接受的辅料和制剂常规方法，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液或注射液等各种剂型的预防重症致死性轮状病毒药物，供临床使用。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。