一种2019-nCoV亚单位疫苗组合物及其免疫方法与流程

本发明属于药物和疫苗组合物技术领域，具体涉及一种2019-ncov亚单位疫苗组合物及其免疫方法。

背景技术：

冠状病毒属于冠状病毒科的冠状病毒属，是一类大型、有包膜的正链rna病毒。冠状病毒的基因组大小约为27至32千个碱基，是已知rna病毒中最长的。冠状病毒主要感染哺乳动物和鸟类的上呼吸道或胃肠道，可导致人类和其他动物的上呼吸道、胃肠道和中枢神经系统疾病。冠状病毒常见于牲畜和家养宠物中，可引起严重传染病，对农业造成威胁。例如，禽传染性支气管炎病毒(ibv)主要引起鸡的呼吸道疾病，并严重影响全世界的家禽业；猪冠状病毒(可传播的肠胃炎，tge)和牛冠状病毒，都导致幼小动物的腹泻等。人类冠状病毒hcov-oc43、hcov-229e、hcov-nl63和hcov-hku1在人体内传播并引起轻度呼吸道疾病。然而，2002年sars-cov和2012年mers-cov的爆发表明，冠状病毒可以越过物种壁垒并以高致病性病毒的形式出现。这些新兴的冠状病毒的高死亡率和广泛传播表明它们是对全球健康的严重威胁。

动物病毒通过与特定的细胞表面受体结合来感染细胞，对于包膜病毒，进入细胞质需要病毒包膜表面突出的s蛋白和细胞膜融合，该受体通常是决定它们可以感染哪些细胞的细胞类型特异性蛋白。冠状病毒的s糖蛋白通过识别宿主细胞受体并介导病毒和细胞膜融合，在病毒感染中发挥重要作用，是病毒生命周期的关键，也是抗病毒药物和疫苗的主要目标。许多中和病毒的抗体都是通过直接阻断病毒与表面受体的结合来实现的。2019-ncov病毒的s糖蛋白是位于病毒外壳的i型病毒融合蛋白，由约1,300个氨基酸组成，可被水解成一个氨基(n)末端的s1亚基(约700个氨基酸)和一个羧基(c)末端的s2亚基(约600个氨基酸)。s1亚基是受体结合亚基，包含受体结合结构域(rbd)；s2亚基是融合亚基，包含疏水融合肽和两个七肽重复区。冠状病毒s糖蛋白具有两个不同的蛋白酶切割位点。sars-cov的s糖蛋白的s1/s2裂解位点位于前体蛋白的残基667之后，而s2'裂解位点在s2亚基上，位于其n端130个氨基酸处。

已有的研究报告了sars-cov的s糖蛋白在病毒感染细胞过程中不同构象状态的结构。冠状病毒sars-cov关键糖蛋白的构象变化：融合前，s糖蛋白保留三聚体结构，由3个s1/s2异二聚体组装形成三聚体尖峰，从病毒包膜突出。i型病毒融合蛋白在与受体结合时，受ace2受体、蛋白水解过程和/或细胞内酸性环境的触发，在感染过程中经历了从亚稳态的预融合状态到稳定的融合后状态的转变，具体表现为受体结合亚基s1被裂解释放，融合亚基s2经历大规模构象重排，暴露疏水融合肽，诱导六螺旋束形成，使病毒和细胞膜紧密融合。

已知高等生物体特异性免疫反应的主要过程为：外源性抗原侵入体内后，经吞噬或吞饮作用，被抗原呈递细胞(apc)摄入胞内形成吞噬体，后者与溶酶体融合形成吞噬溶酶体。抗原在吞噬溶酶体内酸性环境中被蛋白水解酶降解为小分子多肽，其中具有免疫原性的称为抗原肽。mhc是主要组织相容性复合体，能够将“非自身”外来因子与熟悉的“自身”组分区分开，以确保外来因子引发免疫反应，而“自身”的组分被忽略或容忍。内质网中合成的mhc-ⅱ类分子进入高尔基体后，由分泌小泡携带，通过与吞噬溶酶体融合，使抗原肽与小泡内mhc-ⅱ类分子结合形成抗原肽-mhc类分子复合物。该复合物表达于apc表面，可被相应的cd4+辅助t细胞通过双识别效应识别结合，通过释放可溶性介体(例如细胞因子)来应答，以募集免疫系统的其他细胞(如b细胞产生抗体)参与免疫应答。同样，也具有特异性抗原识别能力的cd8+细胞毒性t细胞可能会通过结合并破坏带有抗原的细胞或颗粒而作出反应。在免疫学领域中已知根据多种制剂提供某些疫苗，通常是为了在宿主中诱导所需的免疫应答。在体液免疫应答中产生的第一个抗体始终是igm，因为igm可以表达而无需同种型转换。这些早期的igm抗体是在b细胞发生体细胞超突变之前产生的，因此倾向于具有低亲和力。其他同种型的抗体(igg、iga和ige)体积较小，很容易从血液中扩散到组织中。尽管iga可以形成二聚体，igg和ige始终是单体。各个抗原结合位点对其抗原的亲和力对于这些抗体的有效性至关重要，并且已经选择了表达这些同种型的大多数b细胞以提高生发中心的抗原结合亲和力。igg是血液和细胞外液中的主要同种型，而iga是分泌物中的主要同种型，是肠道和呼吸道粘液上皮最重要的同种型。igg有效地调理吞噬作用并激活补体系统，而iga是调理素效力较低的补体，是弱的补体激活剂。这种区别不足为奇，因为igg主要在存在辅助细胞和分子的人体组织中起作用，而iga主要在正常情况下不存在补体和吞噬细胞的上皮表面上起作用，因此主要起中和抗体的作用。

免疫球蛋白a(iga)是一种在黏膜免疫中起关键作用的抗体，iga虽然只占血清免疫球蛋白的15–20％，但却是分泌物(唾液、眼泪、初乳和支气管、肠道分泌物)中最丰富的免疫球蛋白。血清iga主要是单体，但在分泌物中，它以分泌型iga(siga)的形式存在。分泌型iga具有抵抗酶降解的能力，并能在恶劣的环境(如胃肠道和呼吸道)中生存，能够抵御病毒、细菌、食物残渣、酵母菌和寄生虫等对人体的侵犯，这是针对潜在病原体、毒素和食物的第一道防线。分泌iga的浆细胞主要存在于固有层的结缔组织中，固有层位于许多表面上皮的基底膜下。从那里，iga抗体可以穿过上皮运输到其外表面，到达支气管腔。在固有层中合成的iga抗体被分泌为与单个j链相关的二聚体iga分子。这种聚合形式的iga特异性结合于上层上皮细胞基底外侧表面上的多ig受体。当聚-ig受体结合二聚体iga分子时，复合物被内化并通过运输囊泡中的上皮细胞的细胞质被携带至其腔表面。该过程称为转胞吞作用。在上皮细胞的顶端或腔表面，通过酶切割多ig受体，释放仍附着于二聚igafc区的受体胞外部分。受体的这个片段称为分泌成分，可能有助于保护iga二聚体免受蛋白水解裂解。一些二聚iga分子从固有层扩散到组织的细胞外空间，排入支气管腔。2019-ncov病原体可能通过呼吸道、消化道和泌尿生殖道的粘膜上皮屏障进入人体，或通过受损的皮肤进入人体，然后可以在组织中引起感染。人体的粘膜表面、组织和血液都受到抗体的保护，以防感染。这些抗体用于中和病原体或促进病原体的消灭，然后避免引起重大感染。

已知抗病毒疫苗的三种类型：全病毒颗粒疫苗、分裂疫苗和亚单位疫苗。(1)全病毒颗粒疫苗基于完整病毒颗粒，通常具有更高的免疫原性，但往往具有更高的反应原性；(2)分裂疫苗由病毒裂解后获得的纯化病毒成分通过各种化学试剂处理制得，包含可变数量的病毒内部组分，如核糖核蛋白和基质蛋白；(3)亚单位疫苗含有来自特定病原体的分离的免疫原(例如蛋白质)，几乎仅包含血凝素和神经氨酸酶及病毒的表面抗原多肽。因为亚单位疫苗的制备不含任何病毒基因组，从而避免了临床感染或亚临床感染的风险，具有独特优势。因此寻找到病毒抗原的表面结构蛋白抗原位点，并用基因工程的方法表达这一段多肽，既可以诱导针对病原体的免疫力(参见，例如，liu，1998naturemedicine4(5suppl.)：515.)，又可以完全排除病毒对人体的侵入性损害，能够在免疫学上有效地保护宿主免受人类免疫缺陷病毒或其他传染性病原体、癌症、自身免疫性疾病或其他临床状况的侵害。

先前曾报道发现，一种新的源自人副流感3型病毒包膜糖蛋白与脂质复合的新型病毒亚单位疫苗能够诱导抗体应答，该应答远远优于先前使用福尔马林灭活的病毒疫苗制剂所获得的应答。用这种新的亚单位疫苗进行的研究表明，单次皮下免疫可以完全保护实验对象免受攻击性感染。糖蛋白脂质复合物对刺激受体的免疫反应具有如此优异的表现是非常令人惊喜的，疫苗中脂质的存在被认为会增加其免疫原性的效力。尽管尚未阐明观察到的免疫原性作用的潜在机制，但可以猜想脂质是通过增强糖蛋白的抗原作用而起到佐剂的作用，从而增强了制剂整体的免疫原性。此外我们还发现，由糖蛋白-脂质复合囊泡组成的新型病毒糖蛋白亚单位疫苗更易于制备。我们的亚单位疫苗的制备应确保获得所需抗体应答所必需的抗原性位点不会发生化学改变，而不会损害其致自动免疫性。

就目前所知，迄今尚未提出鼻内施用冠状病毒外壳亚单位疫苗的建议，这将是提供抗感染保护的有效手段。

技术实现要素：

针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种2019-ncov亚单位疫苗组合物及其免疫方法。本发明提供的2019-ncov亚单位疫苗组合物包含有效量的所选流感抗原或其抗原性多肽/蛋白质、无毒性的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(gla)。本发明提供的2019-ncov亚单位疫苗组合物可以在鼻内施用，具有抗原递呈效率高，对人体无毒副作用，无刺激性的优点。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种疫苗组合物，通过鼻内给药的方式施用，包含病毒包膜亚单位疫苗，吡喃葡萄糖基脂质佐剂

优选地，所述病毒可以为2019-ncov和人免疫缺陷病毒hiv。

本发明还提供了一种一种2019-ncov亚单位疫苗组合物，包含流感抗原或其抗原性多肽/蛋白质、无毒性的吡喃葡萄糖基脂质佐剂；所述抗原性多肽/蛋白质来自2019-ncov病原体的免疫原性蛋白质、肽或片段，其通过间隔区任选地与另一肽或蛋白质组成融合蛋白。

优选地，所述融合蛋白由2019-ncov亚单位抗原多肽与穿膜序列组合而成，可以为以下8种中的任意一种：

1)由如seqidno.1所示的氨基酸序列组成；

2)由如seqidno.2所示的氨基酸序列组成；

3)由如seqidno.3所示的氨基酸序列组成；

4)由如seqidno.4所示的氨基酸序列组成；

5)由如seqidno.5所示的氨基酸序列组成；

6)由如seqidno.6所示的氨基酸序列组成；

7)由如seqidno.7所示的氨基酸序列组成；

8)由如seqidno.8所示的氨基酸序列组成；

rkkrrqrrrppqgsqth-qio-mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldpl(seqidno.1)；

rkkrrqrrrppqgsqthqvslskqptsqpr-qio-mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldpl(seqidno.2)；

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rkkrrqrrrppqgsqthqvslskqptsqpr-qio-vrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstp(seqidno.8)。

优选地，所述的2019-ncov亚单位疫苗组合物，还包含用于包被的脂质体或外泌体。

优选地，所述外泌体是指细胞内囊泡。

优选地，所述疫苗组合物以气雾剂或雾化喷雾剂或液滴的形式，通过鼻内给药方式施用。

优选地，所述疫苗组合物还可以通过皮下接种注射的形式施用。

2002-2003年全球sars爆发是由人类冠状病毒sars-cov感染引起的，尽管已经对该病毒进行了流行病学，病毒学，临床特征和其他方面的广泛研究，但仍没有批准的抗病毒药物和疫苗来治疗和预防sars-cov感染。这次爆发的2019-ncov病毒与sars病毒的基因遗传序列高度相似，尤其重要的是，已知两种病毒都是通过s糖蛋白与呼吸道上皮的ace2受体结合感染细胞。因此，2019-ncov病毒疫苗的设计要根据sars病毒s糖蛋白与呼吸道上皮的ace2受体结合的过程来推导，而寻找出2019-ncov病毒与呼吸道上皮的ace2受体结合的关键蛋白表位，则是本专利设计的关键。

一方面，由脂质体保护的疫苗s蛋白也必须与细胞表面的ace2受体蛋白结合，这样可以阻止真正病毒颗粒与人体呼吸道细胞融合，在进行疫苗免疫的时候，最大限度的对ace2受体占位，保护细胞不被病毒侵入；另一方面，与病毒表面s蛋白结合的抗体会中和病毒，从而抑制病毒与细胞的初始结合或随后的进入。亚单位糖蛋白具有tat正电荷穿膜序列，能够进入抗原呈递细胞细胞质，引发apc对亚单位疫苗提供的表位抗原快速进行加工，并递呈到th辅助型t细胞，激活局部的b细胞，快速在固有层产生分泌型iga抗体，并分泌至上呼吸道粘膜表面。这种分泌型iga抗体可以识别病毒s蛋白攻击片段，中和病毒的毒力。同时，人体上呼吸道与病毒的接触可以引发局部更强烈的免疫反应，产生更多的分泌型iga，因此可以提高上呼吸道的免疫抵抗水平，从而抑制病毒对人体的侵入。

本发明提供的疫苗组合物有较好的免疫效果，其具有对人体理论上无任何毒副作用的优点。目前已经发现吡喃葡萄糖基脂质佐剂(gla)和某些流感抗原或其抗原性多肽/蛋白质的组合有效地实现了针对流感的保护性反应，而单独通过流感抗原不能实现这种保护性反应。如下所述，使用2019-ncov糖蛋白亚单位抗原性多肽与吡喃葡萄糖基脂质佐剂(gla)复合，用脂质体或外泌体包被，这样反应只需要较少量的糖蛋白抗原即可起到与纯化的flud和fullfreunds佐剂(cfa)(已知的强抗性)相同的效果。另外，fullfreunds佐剂(cfa)对人体是有潜在危害性的；而吡喃葡萄糖基脂质作佐剂(gla)与脂质体，外泌体包被的糖蛋白多肽对人体理论上是无任何毒副作用的。

目前，tat糖蛋白是一种来自于hiv病毒序列，经优选的一段带有多个正电荷的穿膜蛋白，在本发明疫苗组合物中与2019-ncov亚单位抗原多肽融合。本文公开的tat融合蛋白的情况一样，可以在两个融合序列之间插入接头序列谷氨酰胺-异亮氨酸-脯氨酸。

本发明的融合蛋白在疫苗接种的宿主中可加速引起抗原递呈细胞反应，有促进免疫应答能力的优点。在目前优选的实施方案中，方法是将①已知基因序列的用于制备亚单位糖蛋白的氨基酸序列，②限制为hiv病毒tat蛋白中的两段富含正电荷的穿膜序列：rkkrrqrrrppqgsqth以及rkkrrqrrrppqgsqthqvslskqptsqpr，分别与融合蛋白接头序列-谷氨酰胺-异亮氨酸-脯氨酸(-qio-)融合产生最终的融合蛋白，这段蛋白作为亚单位糖蛋白疫苗的识别抗原。

在本专利的研究中，我们寻找出2019-ncov病毒s糖蛋白与呼吸道上皮的ace2受体结合的关键蛋白表位，由此为2019-ncov病毒s糖蛋白介导的病毒侵入所涉及的疫苗设计提供了理论基础。我们报告了2019-ncov糖蛋白在病毒与人体ace2受体结合的计算机模拟结构(具体计算机模拟过程见具体实施方式)，根据模拟计算结果，结合多肽的二级结构预测，我们提出4段关键的可干预2019-ncov的s1亚单位与人体ace2受体结合的亚单位糖蛋白序列，这4段2019-ncov亚单位抗原多肽可与穿膜序列组合成以下8种融合蛋白序列。

融合蛋白序列公式：hiv穿膜引导序列-连接序列-2019-ncov病毒s蛋白功能序列；接头序列编码谷氨酰胺-异亮氨酸-脯氨酸。

为了证明是衍生自tat的融合糖蛋白肽具有被细胞毒性t细胞(ctl)识别的抗原性，在本发明设计中，tat糖蛋白肽序列的肽作用仅涉及穿过apc细胞膜，以快速产生抗原递呈。另外，tat糖蛋白肽成为抗原表位的可能性低，即使tat序列在人体内形成抗原表位，也不会对人体产生有害的免疫反应。

当用于免疫治疗时，本发明的肽将以与hla抗原的复合物的形式存在于细胞或外来体中。因此，选择具有ctl诱导性、且具有对hla抗原的高结合亲和力的肽。可以通过氨基酸残基的取代、添加等来修饰肽以获得更高的结合亲和力。除了天然展示的肽外：(1)一方面，由于通过结合hla抗原展示的肽序列的规则性(即一致性)是已知的(jimmunol152：3913，1994；immunogenetics41：178，1995；jimmunol155).：4307，1994)，可以对本发明的免疫原性肽进行基于这种规律性的修饰：例如，具有高hla-a24结合亲和力的肽可以将其n端的第二个氨基酸替换为苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，并将c端的氨基酸替换为苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，色氨酸或蛋氨酸也可以使用；(2)另一方面，可以使用具有高的hla-a02结合亲和力的肽，其中来自n-末端的第二个氨基酸被亮氨酸或蛋氨酸取代，并且其中的c-末端氨基酸被缬氨酸或亮氨酸取代。取代不仅在末端氨基酸处进行，而且还在潜在的tcr肽识别位置进行。

本发明肽的制备可以使用众所周知的技术来制备本发明的肽。例如，可以通过重组dna技术或化学合成来合成制备肽。本发明的肽可以单独合成或作为包含两个或更多个肽(例如，表面糖蛋白多肽与穿膜tat多肽)的更长的重复性序列多肽合成。所述肽可以被分离，即被纯化以基本上不含其他天然存在的宿主细胞蛋白及其片段，例如，至少约95％被纯化。

本发明的肽可以基于所选择的氨基酸序列通过化学合成获得。例如，可以用于合成的常规肽合成方法包括：

(i)肽合成，国际科学，1966年，纽约；

(ii)theproteins，vol。2，学术出版社，纽约，1976年；

(iii)baranyg.&merrifieldr.b.，肽卷。2，“固相肽合成”，学术出版社，纽约，1980，100-118。

可采用任何已知的用于产生肽的遗传工程方法来获得本发明的肽(例如，morrisonj.(1977)j.bacteriology132：349-51；clark-curtiss&curtiss(1983)methodsinenzymology(eds。wu)等人)101：347-62)。例如，首先，制备具有可表达形式(例如，在对应于启动子序列的调节序列的下游)携带编码目的肽的多核苷酸的合适载体，并将其转化入合适的宿主细胞中。然后培养宿主细胞以产生目的肽。肽也可以采用体外翻译系统在体外产生。

可以通过以下实施例纯化tat糖蛋白蛋白：可以将各种常规方法与本发明组合物的蛋白的纯化结合使用，尽管对于实现医药级高度纯化，这些其他方法不是必需的。可以在上述处理步骤之间、之前或之后采用这种程序。这样的可选步骤之一是渗滤，一种连续渗析的形式，对实现许多缓冲液交换非常有效。渗滤优选跨纤维素膜或超滤器进行。合适的膜/过滤器是具有约10000分子量(mw)截留值的那些膜/过滤器，即具有至多2.4μm直径的孔径的那些。市场上有许多适用于渗滤的不同系统，例如10kamicon双螺旋滤筒系统。在本发明的方法中，在约8ph的20mmtris缓冲液中进行的渗滤可有效地用于纯化和随后浓缩本发明疫苗组合物中所用的多肽。应用本文所述的纯化方法已实现95-99％纯度的亚单位糖蛋白制备，并已基本去除宿主细胞(酵母菌与293细胞)蛋白和其他污染物。

吡喃葡萄糖基脂质佐剂(gla)，脂质体，外泌体包被的糖蛋白多肽也可以是本发明疫苗组合物的组分。根据本发明，发明人已经确定，当高度纯化时，在没有佐剂的情况下，抗原多肽例如tat糖蛋白既没有免疫原性也没有保护性。然而，当与吡喃葡萄糖基脂质佐剂(gla)佐剂结合时，如本文所述和下文动物实验实施例所示，该蛋白质能够诱导针对2019-ncov的感染的保护性iga。此外，发明人已经发现，当流感抗原多肽例如tat糖蛋白蛋白包被脂质体与吡喃葡萄糖基脂质佐剂(gla)佐剂结合时，需要较低剂量的tat糖蛋白以达到较高的iga免疫应答水平。

如前述，脂质很可能通过增强糖蛋白的抗原作用而加强免疫反应。当糖蛋白脂质复合物的脂质成分可源自产生病毒的宿主细胞，在包膜在宿主细胞中组装期间，脂质与病毒指定的蛋白质一起掺入病毒包膜，存在于病毒包膜中的内源性脂质足以引起足够的抗体产生保护水平。但是，本发明的亚单位疫苗是从纯化的分离的糖蛋白制备的，则可能希望从外部来源添加脂质。通过脂质体包被，可以有效地重建原始的蛋白质-脂质膜结构，同时可以为融合蛋白提供保护，有利于提高疫苗的施用效力。

如疫苗组合物中所用以及相对于脂质体组合物中所用水的量，脂质体的“固体”成分包括脂质体形成材料、酸或胺成分、水合剂、葡萄糖基脂质佐剂(gla)和选择要包封的抗原物质。

本发明为了制备具有较小粒径的脱酰基单磷酰脂质粒，通常不超过120nm，可以从ribiimmunochem购买较大粒径的商业mpl，然后可以将产品制成进行超声处理，直到悬浮液澄清为止。可以使用动态光散射来估计颗粒的尺寸，优选的颗粒的尺寸在60-120nm的范围内。

在本发明的实施中，某些脂族和芳族基酸和胺是优选的。这样的化合物可以具有多种功能，例如具有两个或更多个酸或胺基或其组合。例如，可以使用二酸，二胺或具有酸和胺官能的化合物。优选的化合物是具有一个或两个酸或胺官能团的那些。更优选的是饱和的和不饱和的10-20个碳的脂肪单酸。最优选的是具有10至20个碳原子的烷基和烯基酸，特别是油酸。

为了本发明的目的，乳化剂是指具有至少两个可电离基团的化合物。所述水合剂本身不固有地形成脂质体。这种试剂在生理上也是可接受的，即，在其在本发明中使用的上下文中，它将对所施用的宿主没有任何不利或有害的生理作用。(1)优选具有相反的电荷，其中一个能够形成易离解的离子盐，该盐可与酸或离子的离子官能团络合；(2)更优选的水合剂是ω取代的α氨基酸，例如精氨酸，其n-酰基衍生物，高精氨酸，γ-氨基丁酸，天冬酰胺，赖氨酸，鸟氨酸，谷氨酸，天冬氨酸；(3)最优选的化合物是精氨酸，高精氨酸，γ-氨基丁酸，赖氨酸，鸟氨酸，谷氨酸或天冬氨酸。

本发明的乳化剂可以单独使用或混合使用。本发明的乳化剂列在许多化学品生产商的目录中，可以由这类生产商定制生产，或者可以通过本领域已知的方法制备。精氨酸，高精氨酸，赖氨酸，谷氨酸，天冬氨酸和其他天然存在的氨基酸可通过蛋白质水解并分离单个氨基酸或从细菌来源获得。

乳化剂、脂质体形成材料和不连续量的水的混合物形成凝胶状物质。当呈这种凝胶形式时，水合剂和酸或胺与所有脂质体形成材料一起排列成“水合复合物”，其是高度有序的液晶。水合物络合物是指脂质体形成材料中的水合剂与酸或胺之间形成的络合物。在本文中，络合表示离解性离子盐的形成，其中一种官能团与脂质体形成材料的离子官能团缔合，而另一种官能团具有亲水性，从而赋予所得复合物以水溶性。尽管水合物配合物的液晶结构随ph和水合剂的量而变化，但仍保留了液晶结构。nmr光谱证实该晶体结构由多层脂质双层和亲水层以交替方式堆叠在一起组成。

脂质体形成材料，长链脂族或芳香族基酸或胺，一种或多种水合剂，与相对于总固体的至多300m摩尔水的混合物，带有或不带有选定量的抗原性物质的混合物，都会产生凝胶，该凝胶可以被标记为脂质体前凝胶，因为其结构特征本质上是脂质体的结构特征，并且该凝胶具有在用水溶液稀释后可以转化为脂质体的便利。当加入水溶液时，该凝胶直接从其形成脂质体，超过约300m摩尔当量的水溶液导致脂质体开始形成。

尽管这些脂质体的主要成分是脂质、磷脂、其他脂肪酸，但也可以添加各种其他成分来修饰脂质体的通透性。可以添加例如非离子脂质组分，例如聚氧醇化合物，聚甘油化合物或多元醇的酯，聚氧链烯醇化的醇，等等。多元醇和合成脂的酯，例如脑苷。其他物质，例如长链醇和二醇，固醇，长链胺及其季铵衍生物；聚氧乙烯化脂肪胺，长链氨基醇的酯及其盐和季铵衍生物；脂肪醇，多肽和蛋白质的磷酸酯。脂质体的组合物可以由多种脂质，脂肪酸，烷基胺等中的一种以上的成分以及水合剂制成。

本发明提供了称为外泌体的细胞内囊泡，其呈现出在本发明的肽与表面上的hla抗原之上形成的复合物。如本文所用，术语“外泌体”是指具有在约100-200nm直径(或最大尺寸，其中颗粒不是球形的)的膜状颗粒。与本发明的肽相似，本发明的外泌体可以作为疫苗接种。人工外泌体可以通过胎盘间充质干细胞或天然组织获取按照实例详细描述的方法来制备，也可以使用作为治疗靶点和/或靶点的受试者获得的抗原呈递细胞来制备。

外泌体的分离外泌体可以在任何合适的样品类型(例如体液)中检测到或与之分离。如本文所用，术语“分离的”是指从其天然环境中分离出来。外泌体也可以从组织样品，例如手术样品，活检样品，的细胞中分离。当从组织来源分离外泌体时，可能有必要使组织均质化以获得单细胞悬浮液，然后裂解细胞以释放外泌体。当从组织样本中分离外泌体时，选择不导致外泌体破坏的均质化和裂解程序非常重要。本文考虑的外泌体优选在生理上可接受的溶液中从体液中分离，所述溶液例如是缓冲盐水，生长培养基，各种水性培养基等。

外泌体所含hla所用hla抗原的类型必须与需要治疗和/或预防的对象的类型相匹配。例如，hla-a24，尤其是hla-a2402通常是合适的。关于hla抗原，在亚洲人和高加索人中高表达的a-24或a-02类型的使用有利于获得有效的结果，并且使用包括a-2402和a-0201的亚型是有用的。通常，预先研究需要治疗的患者的hla抗原的类型，这使得能够适当选择对该抗原具有高水平的结合亲和力或通过抗原呈递具有细胞毒性t细胞(ctl)诱导性的肽。此外，为了获得显示出高结合亲和力和ctl诱导性的肽，可以基于天然存在的tat糖蛋白肽的氨基酸序列进行1、2或几个氨基酸的取代或添加。

抗原呈递细胞提高糖蛋白多肽的抗原递呈的效率本发明还提供了抗原呈递细胞(apc)，其在其表面上呈递hla抗原和本发明的肽之间形成的复合物。通过接触本发明的肽或编码本发明的肽的核苷酸而获得的apc可以从作为治疗和/或预防靶标的受试者制备，并且可以作为疫苗本身或与之组合施用。其他药物，包括本发明的肽，外来体或细胞毒性t细胞。

树突状细胞(dc)被特别用作本发明的apcapc不限于任何种类的细胞，并且包括树突细胞(dc)，朗格汉斯细胞，巨噬细胞，b细胞和活化的t细胞，已知所有这些都在其细胞表面上呈递蛋白质性抗原以便被识别。由于dc是具有代表性的apc，在apc中具有最强的ctl诱导作用，因此dc被特别用作本发明的apc。

例如，可以通过从外周血单核细胞中诱导树突状细胞，然后使其在体外，离体或体内与本发明的肽接触(刺激)来获得apc。当向受试者施用本发明的肽时，在受试者体内诱导具有固定有本发明的肽的apc。“诱导apc”包括使细胞与本发明的肽或编码本发明的肽的核苷酸接触(刺激)，以在细胞表面上呈现在hla抗原和本发明的肽之间形成的复合物。或者，在将本发明的肽固定于apc之后，可以将apc作为疫苗施用给受试者。例如，离体给药可包括以下步骤：

a：从病人外周血液中收集apc；

b：将步骤a的apc与肽接触；

c：可将通过步骤b获得的apc作为疫苗施用。

根据本发明，提供了鼻内施用2019-ncov糖蛋白亚单位疫苗的方法，该方法在疫苗的接受者中引起保护性免疫应答。鼻内免疫后引起对病毒糖蛋白亚基疫苗的全身和局部抗体应答。该结果与用相同抗原剂量的皮下免疫所获得的结果形成鲜明对比，后者显着增加了全身初始抗体的反应，但在支气管中仅引起中等的局部反应，因此仅产生有限的保护以免受感染。鼻内免疫后引起对病毒糖蛋白亚基疫苗的局部抗体应答，使上呼吸道更好的对2019-ncov病毒产生防御反应。

备注：术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是修饰残基或非天然残基的氨基酸聚合物，例如相应天然氨基酸的人工化学模拟物，以及天然氨基酸聚合物。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸具有相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及在细胞中翻译后被修饰的氨基酸(例如，羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸)。短语“氨基酸类似物”是指与天然氨基酸具有相同的基本化学结构(与氢，羧基，氨基和r基团结合的α碳)但具有修饰的r的化合物基团或修饰的骨架(例如，高丝氨酸，正亮氨酸，甲硫氨酸亚砜，甲硫氨酸甲基sulf)。短语“氨基酸模拟物”是指具有与一般氨基酸不同的结构但具有相似功能的化合物。氨基酸在本文中用iupac-iub生化命名委员会推荐的众所周知的三个字母符号或一个字母的符号表示。

备注：除非另有说明，否则术语“基因”，“多核苷酸”，“核苷酸”和“核酸”在本文可互换使用，并且类似于其通常接受的单字母代码所指的氨基酸。

与现有技术相比，本发明提供的2019-ncov亚单位疫苗组合物具有如下优点：

(1)本发明提供的2019-ncov亚单位疫苗组合物，在进行疫苗免疫的时候，由脂质体保护的疫苗s蛋白也必须与细胞表面的ace2受体蛋白结合，这样可以阻止真正病毒颗粒与人体呼吸道细胞融合，保护细胞不被病毒侵入；

(2)本发明提供的2019-ncov亚单位疫苗组合物，以吡喃葡萄糖基脂质作佐剂对人体无任何毒副作用，由脂质体或外泌体包被，可以保护融合蛋白，提高糖蛋白多肽的抗原递呈的效率；

(3)本发明提供的2019-ncov亚单位疫苗组合物，可以提高上呼吸道的免疫抵抗水平，从而抑制病毒对人体的侵入。

附图说明

图1为2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体结合构象；

图2为2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体结合的氨基酸序列范围估算图；

图3为脂质体保护雾化吸入对比结果；

图4为生理盐水保护雾化吸入对比结果；

图5为脂质体保护与gla佐剂复合雾化吸入对比结果；

图6为单独2019-ncov亚单位疫苗多肽(不进行脂质体保护与gla佐剂复合)雾化吸入对比结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

实施例1s糖蛋白与人体ace2受体结合的计算机模拟具体过程

2019-ncov病毒s糖蛋白是由约1,300个氨基酸组成的前体蛋白，可被切割成一个氨基(n)末端的受体结合亚基s1(约700个氨基酸)和一个羧基(c)末端的融合亚基s2(约600个氨基酸)。s1亚基包含受体ace2结合结构域(rbd)，s2亚基包含疏水融合肽和两个七肽重复区。2019-ncov糖蛋白有两个不同的蛋白酶切割位点：s1/s2裂解位点位于前体蛋白的残基660-675之间，而s2'裂解位点在s2亚基上。因此干预2019-ncov的s1亚单位与人体ace2受体结合的关键部位在残基660-675之前。

我们报告了2019-ncov糖蛋白在病毒与人体ace2受体结合的计算机模拟结构，2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体结合的绿色区域是亚单位糖蛋白疫苗的作用关键位点，二者结合的预测结构如图1所示，其中，a表示2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体结合构象的表面能量图，绿色区域显示2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体的结合区；b表示2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体结合的氨基酸结合骨架图，绿色区域显示2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体的结合区；c表示2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体结合的分子动力结合模拟图，绿色区域显示2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体的结合区。三种分子动力的模拟方法都显示，2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体结合的绿色区域是亚单位糖蛋白疫苗的作用关键位点，也就是a，b，c三图显示的2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体的结合绿色区域。

由此可知，该结构构象变化可以阻止病毒侵入人体，并发生对人体的保护作用。

根据模拟计算结果，结合多肽的二级结构预测，2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体结合的氨基酸序列范围估算图如图2所示，其中，绿色区域显示2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体的结合区，通过两条划线标出的氨基酸名称之间的范围界定2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体结合的氨基酸序列范围。

图2中，a正面显示2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体的结合区域组织的示意图和拓扑图。2019-ncov的s1区域为金色，ace2受体为暗红色阿尔法螺旋区域，红色，蓝色为2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体结合的能量最低区。经推算2019-ncov表面糖蛋白的306位phe与553位thr之间的氨基酸区域是最可能的2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体结合部位。b背面显示2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体的结合区域组织的示意图和拓扑图。ace2受体结合构象为暗红色阿尔法螺旋区域，2019-ncov表面糖蛋白s1结合区域为金色，经推算2019-ncov表面糖蛋白的361位cys与453位tyr之间的氨基酸区域是第二种2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体结合方式；经推算2019-ncov表面糖蛋白的423位try与446位gly之间的氨基酸区域是第三种2019-ncov表面糖蛋白与ace2受体结合方式。

由此，我们提出4段关键的可干预2019-ncov的s1亚单位与人体ace2受体结合的亚单位糖蛋白序列，其与穿膜序列组合成如seqidno.1-8所述的8种融合蛋白序列。

这8种亚单位蛋白可以单一使用，也可以选若干种蛋白联合使用，以最有效产生广谱的抗2019-ncov病毒的分泌型iga。在目前专利的动物实验中，使用的是这8种亚单位糖蛋白组合体，组合比例是摩尔比1：1：1：1：1：1：1：1。混合亚单位糖肽使用时按重量进行疫苗制备。

实施例2凝胶乳化剂的制备

称取3.0g双棕榈酰磷脂酰胆碱放入50ml烧杯中，加入1.2g油酸并混合在一起以形成均匀的糊剂。

在30ml蒸馏去离子水中加入0.72g精氨酸，并将其添加到二棕榈酰磷脂酰胆碱油酸糊中，加热到45℃。磁力搅拌混合，混合物形成透明稳定的凝胶。储存凝胶。

取100ml凝胶，加入2mg合成并纯化的糖蛋白，磁力搅拌3min，超声波水浴锅内震荡15min，分装为每毫升20μg的小瓶，为1人用量，4℃冰箱保存。

实施例3脂质体的制备

将120g双棕榈酰磷脂酰胆碱和24g油酸一起添加并充分混合，直到观察到白色均匀糊状物。

然后将2mg的精氨酸溶解在60ml的磷酸盐缓冲盐水中(离子强度＝0.15，ph＝7.4)。

将精氨酸盐溶液加入到糊状物中，并加热至40℃达1小时，或直至观察到稍微混浊的溶液。

取100ml脂质体悬浊液，加入2mg合成并纯化的糖蛋白，磁力搅拌3min，超声波水浴锅内震荡15min，分装为每毫升20μg的小瓶，为1人用量，4℃冰箱保存。

实施例4磷脂脂质体的制备

(1)凝胶的制备：向50g20型蛋磷脂粉(asahichemicals)中加入20g油酸。混合得到白色糊，将其冷却至4℃并研磨成细粉。将该粉末加到含有20g精氨酸和500g蒸馏去离子水的水溶液中。将混合物用刮铲混合，同时将溶液加热至约35℃以帮助磷脂水合。形成均匀的略带黄色的斑点。可以将该凝胶高压灭菌并在4℃下保存，也可以冷冻并随后重新配制。

(2)脂质体的制备：将上段中制备的凝胶从冷藏中取出并恢复到室温。然后将其与2lph7.4的磷酸盐缓冲盐水混合。形成白色不透明脂质体溶液。

取100ml磷脂脂质体悬浊液，加入2mg合成并纯化的糖蛋白(指8种专利的多肽，每种0.5毫克)，磁力搅拌3min，超声波水浴锅内震荡15min，分装为每毫升20μg的小瓶，为1人用量，4℃冰箱保存。

实施例5从2019-ncov病毒tat糖蛋白制备疫苗组合物

(一)免疫刺激复合物的制造方法

各种示例性实施方案还涵盖产生包含2019-ncov糖蛋白肽免疫原构建体和吡喃葡萄糖基脂质佐剂(gla)的免疫刺激复合物(isc)的方法。

在一个实施例中，肽/吡喃葡萄糖基脂质佐剂(gla)免疫刺激复合物会自我聚集，并有助于呈递给免疫系统的“专业”抗原加工细胞(apc)，从而进一步增强复合物的免疫原性。这些配合物易于表征，可在制造过程中进行质量控制。肽/吡喃葡萄糖基脂质佐剂(gla)在体内具有良好的耐受性。

在一个实施方案中，疫苗制剂采用以等摩尔比制备的两个2019-ncov糖蛋白肽免疫原构建体与专有的吡喃葡萄糖基脂质佐剂(gla)混合，导致自发形成免疫刺激复合物。该新的微粒体系包含吡喃葡萄糖基脂质佐剂(gla)和2019-ncov糖蛋白肽免疫原构建体。设计该体系以利用与使用吡喃葡萄糖基脂质佐剂(gla)相关的普遍的b细胞有丝分裂性，同时促进平衡的th-1/th-2类型响应。

在由相反电荷的静电中和介导的过程中，所公开的疫苗制剂中的吡喃葡萄糖基脂质佐剂gla(avantipolarlipids，inc.，alabaster，al；产品号699800)与免疫原100％结合，导致形成微米尺寸的颗粒。颗粒形式允许从吡喃葡萄糖基脂质佐剂(gla)的常规使用，具有较少的潜在先天免疫应答潜力，并促进包括抗原呈递细胞(apc)在内的其他免疫原加工途径。因此，所公开的制剂在概念上是新颖的，并且通过促进通过替代机制刺激免疫应答而提供优势。

具有抗原性糖蛋白成分的任何含脂质的病毒都构成用于本发明方法的合适物质。如本文前述，疫苗中脂质的存在似乎对刺激受体的免疫反应具有意想不到的有益作用。尽管尚未阐明观察到的免疫原性作用的潜在机制，但可以猜想可能是脂质通过增强糖蛋白的抗原作用而起佐剂的作用。(1)病毒的糖蛋白脂质复合物的脂质成分源自产生病毒的宿主细胞。在宿主细胞中组装期间，脂质与病毒指定的蛋白质一起掺入病毒包膜。较早描述的制备疫苗的方式导致糖蛋白和脂质形成单糖复合物或囊泡。与其期望的是相关的脂质似乎通过充当佐剂而整体上形成抗原性脂质-糖蛋白囊泡增强了制剂的免疫原性。当通过较早描述的方法与糖蛋白同时提取时，存在于病毒包膜中的内源性脂质足以引起足够的抗体产生保护水平。

但是，如果疫苗是从纯化的分离的糖蛋白制备的，则可能希望从外部来源添加脂质，以获得与包含天然脂质的未纯化制剂相同的结果。通过这种方式制备亚单位疫苗，可以有效地重建原始的蛋白质-脂质膜结构。已经发现添加脂质引起囊泡的自发形成，囊泡包含包膜糖蛋白及脂质双层。脂质：蛋白质比例一般>20:1几乎任何脂质来源都可以用于蛋白保护性囊泡的重建。预期可用于本疫苗的脂质是磷脂，其代表性实例是卵磷脂，脑磷脂和鞘磷脂，特别优选卵磷脂。

含有糖蛋白-脂质的病毒可在多种脊椎动物宿主中引起感染，上述药物适于鼻内施用给易受这些感染影响的任何脊椎动物宿主。然而，旨在预防副流感感染的本发明优选的疫苗在治疗包括人在内的哺乳动物宿主中是有价值的。

疫苗配制可接受载体。可以将上述亚单位疫苗与药学上可接受的载体例如水，缓冲生理盐水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，液体聚乙二醇等)，其合适的混合物或植物油一起配制成鼻内给药。如有必要，可以用各种抗菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞等)来防止污染微生物的作用。通常优选在制剂中包括等渗剂，例如葡萄糖或氯化钠。这样的制剂可以作为气雾剂或雾化喷雾剂或作为液滴滴鼻给药。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括可能适合鼻内施用病毒糖蛋白亚单位疫苗的任何和所有溶剂，分散介质，抗细菌和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂等。这种介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗组合物中。如果需要或需要，也可以将补充活性成分掺入组合物中。

为了易于施用和剂量均匀，以剂量单位形式配制疫苗是特别有利的。如本文所用，剂量单位形式是指适合于要免疫的受试者的疫苗的物理上离散的单位。每个剂量应包含经计算可产生所需治疗效果的活性物质的量，并与选定的药物载体结合使用。为给定类别的接受者确定适当疫苗剂量的程序是本领域技术人员众所周知的。通常，当给予包含病毒的抗原的组合物时，约5-20μg的剂量应足以产生所需的免疫应答。

(二)疫苗组合物的生产方法

应用2019-ncov糖蛋白肽构建体的免疫原性进行通用的疫苗组合物的生产。

每个实验中使用的药物组合物和疫苗制剂在下文所述的实施例中有更详细的描述。简而言之，每个研究组中指定的制剂通常包含所有类型的设计2019-ncov糖蛋白肽构建体，其中2019cov糖蛋白肽的片段通过间隔区(例如谷氨酰胺-异亮氨酸-脯氨酸，-qio-，以增强肽构建体的溶解性)和穿膜肽序列(包括一组来自hiv病毒tat蛋白的穿膜序列)融合，其2019-ncov糖蛋白肽片段连接在设计者肽构建体的n末端。

2019-ncov糖蛋白肽构建体是在油包水乳液中制备的，包含不同量的指定肽构建体。

本发明提供的疫苗组合物的制备过程为：将8种多肽按1：1：1：1：1：1：1：1的比例混合，每种加2.5μg，共20mg，如实施例4所述，与磷脂脂质体充分混合，然后向其中加入50mggla，加入实施例2制得的凝胶乳化剂1μl，滴加缓冲生理盐水至0.1ml，最后，用纯化水稀释100倍至10ml，将疫苗制剂在室温下保持约30min，并在免疫前通过超声混合约10至15s；鼻内给药时，取0.1ml通过雾化气体进行雾化吸入，使雾化的疫苗可以到达终末肺泡中。

本发明提供的疫苗组合物的制备过程为：将8种多肽按1：1：1：1：1：1：1：1的比例混合，每种加2.5μg，共20mg，如实施例4所述，与磷脂脂质体充分混合，然后向其中加入50mggla，加入实施例2制得的凝胶乳化剂1μl，滴加缓冲生理盐水至0.1ml。这种疫苗也可以采用皮下接种注射的形式使用。

最初在豚鼠中评估了超过100个2019-ncov糖蛋白肽构建体的相对免疫原性，以及它们与人体细胞膜蛋白交叉反应性。在纳入最终疫苗组合物之前，仅对最有前途的2019-ncov糖蛋白肽免疫原候选物进行进一步的广泛评估，以在glp指导的临床前研究中进行免疫原性，持续时间，毒性和功效研究，以准备提交新药研究和临床试验。

实施例6测试动物的免疫的安全性

实验采用五组60只仓鼠进行2019-ncov病毒感染的特异性体液免疫应答的抗体滴度水平的测量。在三周的实验中，五组进行2019-ncov病毒感染的特异性体液免疫应答的60只仓鼠未出现不正常死亡，饮食与二便正常，未显示异常的神经系统损伤的行为学表现。对各组动物的心脏，肺，肝脏，脾脏，肾脏进行he染色观察，未发现病理损伤症状。

实施例7测试动物的免疫的特异性抗体滴度

1.抗体滴度

病毒疫苗所引起的免疫反应滴度必须达到一定水平才能表明免疫力，但是对于临床上重要的“关于核心抗原”的疾病疫苗，任何可测抗体的存在都表明具有保护作用。

阳性滴度测试结果表示动物受到保护。阴性结果通常表示效价未能达到所需的抗体阈值水平，但效价低可能仍意味着狗在暴露时受到保护，因为它不能反映免疫力。

研究表明，正确接种过疫苗的实验动物中有92％到98％对所测的传染原具有良好的可测抗体效价。通常，对“核心抗原”疫苗的血清抗体滴度持续至少7–9年，并且可能终身存在。这与我们在临床上看到的相符，因为在这些疫苗接种人群中，由于这些疾病引起的病例和死亡人数已大大减少。

最重要的是，使用疫苗效价测试作为评估疫苗诱导的保护的手段可能会导致人类获得有效的免疫接种。这对于控制传染性疾病的爆发流行是一个巨大的好处。

2.采用五组60只仓鼠进行2019-ncov病毒感染的特异性体液免疫应答的抗体滴度水平的测量

免疫疫苗动物分为五组：

第一组：鼻内5μg糖蛋白雾化吸入；

第二组：鼻内10μg糖蛋白雾化吸入；

第三组：鼻内20μg糖蛋白雾化吸入；

第四组：鼻内生理盐水雾化吸入；

第五组：未免疫阴性对照组。

滴度表示为显示阳性反应性的五组动物的样品的最高稀释度的均值。

处死被感染的仓鼠，并收集支气管灌洗液用于iga分泌型抗体检测。缓慢滴入并抽吸1ml，从每个仓鼠中收集支气管灌洗液。用注射器和10号针头通过气管注入磷酸盐缓冲盐水(pbs)。离心澄清支气管灌洗液，并冷冻保存。

测量五组60只仓鼠2019-ncov病毒感染的特异性体液免疫应答的抗体滴度水平。生理盐水雾化吸入组以及阴性空白对照组仓鼠血清或鼻腔分泌物没有检测到2019-ncov病毒特异性抗体。实验结果显示这些抗体在感染后2周首先增加，并在3周达到最大值。第三组有较高分泌型iga抗体水平，第二组其2019-ncov病毒特异性分泌型iga抗体滴度中等，第一组显示血清或鼻腔分泌物中的2019-ncov病毒分泌型iga特异性较低。

3.分泌型iga抗体的检测方法

为了仔细分析分泌型iga抗体免疫应答，通过酶联免疫吸附测定(elisa)检测血清和支气管灌洗液中2019-ncov的分泌型iga抗体。通过分别测定血清和支气管灌洗液以确定对2019-ncov的特异性抗体应答。这些测定结果示于图5-6。

亲和纯化的2019-ncov糖蛋白多肽分别用于包被elisa板。在添加测试样品之前，用硼酸盐溶液中的1％bsa封闭抗原包被的板。将连续两次稀释的血清或支气管灌洗液与抗原包被的96孔板一起孵育。

兔抗仓鼠全血清用作第二抗体，以确定对病毒糖蛋白疫苗雾化吸入后仓鼠呼吸道内总iga分泌型抗体的滴度，同时通过使用兔抗仓鼠iga的血清精确确定iga类特异性抗体应答。

制备兔抗仓鼠iga的抗血清所需的仓鼠分泌型iga是通过使用jacalin(piercechemicalco.，rockford，il)通过凝集素亲和层析从合并的血清中制备的。jacalin是一种α-d-半乳糖结合凝集素，是从菠萝蜜种子中提取的，已观察到与人iga特异性结合。将固定在琼脂糖珠上的贾卡琳装在一个小的一次性塑料柱(bioradlaboratories，里士满，加利福尼亚)中，直至体积为4ml。用约5倍柱体积的pds，ph7.4洗涤该柱。用pbs透析合并的仓鼠血清(6ml)，并通过jacalin柱缓慢地循环四次。用十倍体积的pbs洗涤该柱，并用pbs中的0.1m三聚糖(sigmachemicalco.，st.louis，mo)洗脱结合的蛋白，并监测级分在200mm的吸光度。合并洗脱的级分，并浓缩在火棉胶袋中(schleicher和schuell，keene，nil)。结合到jacalin柱上的仓鼠血清蛋白被黑色素糖洗脱为尖峰。

与第二种抗体孵育后，将山羊抗兔ig碱性磷酸酶偶联物添加到elisa板的孔中。最后，将对硝基苯基磷酸酯用作底物以进行显色反应，温育后，通过添加等体积的2(n)naoh终止反应。用分光光度计(titertekmultiskanrmc，flow实验室，弗吉尼亚州麦克莱恩)。通过用jacalin或山羊抗仓鼠全血清(cappelphiladelphia，pa)包被平板并使用兔抗仓鼠iga作为第二抗体来测量支气管清洗液中的总iga滴度。事先将所有elisa试剂针对其对应物进行滴定，以确定要使用的适当稀释度。根据elisa测定的结果，在鼻内雾化吸入亚单位糖蛋白免疫仓鼠的支气管灌洗液中观察到更高的抗体反应，并且滴度随着糖蛋白剂量的增加而增加(1,2,3组)。在鼻内免疫动物的血清和支气管灌洗液中，可以检测到糖蛋白特异性抗体的出现以及对2019-ncov的iga类特异性应答。可以看出，鼻内免疫动物对2019-ncov糖蛋白的局部iga反应十分明确。

在前述实施例中列出的测试结果表明，上述糖蛋白亚单位疫苗可以在通过鼻内途径给药后，在呼吸道中有效诱导定向免疫反应。这似乎至少部分是由于诱导的局部抗体产生，特别是iga类抗体。上述数据进一步表明，与皮下给药相比，鼻内免疫需要少量的病毒包膜糖蛋白和脂质复合物，以便有效保护免受攻击性感染。

4.疫苗组合物诱导的试验动物血清和支气管灌洗特异性抗体的elisa滴度

(1)仓鼠经鼻雾化吸入脂质体保护2019-ncov亚单位疫苗后的特异性分泌型iga抗体反应：实验组分别吸入5μg复合多肽亚单位疫苗组合物，10μg复合多肽亚单位疫苗组合物，20μg复合多肽亚单位疫苗组合物，以生理盐水雾化作为saline对照，空白免疫组作为阴性对照，进行特异性分泌型iga抗体滴度检测。使用仓鼠上呼吸道灌洗液稀样品进行elisa检测，其中，每组仓鼠个数为n＝6，数据是滴度平均值±sd。

实验结果见图3，图中分析了显著性差异：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，如t检验所示。根据t检验，采用脂质体保护雾化吸入的实验组仓鼠在吸入5μg、10μg、20μg后产生分泌性iga与阴性对照组相比均具有统计学意义(2weeks，p<0.01；3weeks，p<0.001)。且3周时检测抗体，吸入5μg与吸入10μg组之间差别具有统计学意义。

(2)仓鼠经鼻雾化吸入生理盐水后的特异性分泌型iga抗体反应：实验组分别吸入来自5μg复合多肽亚单位疫苗组合物，10μg复合多肽亚单位疫苗组合物，20μg复合多肽亚单位疫苗组合物，以生理盐水雾化作为saline对照组，以空白免疫组作为阴性对照，进行特异性分泌型iga抗体滴度检测。使用仓鼠上呼吸道灌洗液稀样品进行elisa检测，其中，每组仓鼠个数为n＝6，数据是滴度平均值±sd

实验结果见图4。图中分析了显著性差异：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，如t检验所示。根据t检验，采用生理盐水保护雾化吸入的实验组仓鼠在吸入5μg、10μg、20μg后产生分泌性iga与阴性对照组相比均具有统计学意义(2weeks，p<0.01；3weeks，p<0.01)。

(3)仓鼠经鼻雾化吸入2019-ncov亚单位疫苗脂质体保护与gla佐剂复合组后的特异性分泌型iga抗体反应：实验组分别吸入来自5μg复合多肽亚单位疫苗组合物，10μg复合多肽亚单位疫苗组合物，20μg复合多肽亚单位疫苗组合物，以生理盐水雾化作为saline对照组，以空白免疫组作为阴性对照组，进行特异性分泌型iga抗体滴度检测。使用仓鼠上呼吸道灌洗液稀样品进行elisa检测，其中，仓鼠个数为n＝6。数据是滴度平均值±sd。

实验结果如图5所述，图中分析了显著性差异：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，如t检验所示。根据t检验，采用脂质体保护雾化吸入的实验组仓鼠在吸入5μg、10μg、20μg后产生分泌性iga与阴性对照组相比均具有统计学意义(2weeks，5μg组、10μg组：p<0.01；2weeks，20μg组、3weeks，5μg组：p<0.001；3weeks，10μg组、20μg组：p<0.0001)。2周时检测抗体，5μg组与20μg组之间差别具有统计学意义。3周时检测抗体，5μg与10μg组之间、5μg组与20μg组之间差别具有统计学意义。另外，10μg组中2weeks是检测抗体量与3weeks检测抗体量之间差别有统计学意义(p<0.01)。

(4)仓鼠经鼻雾化吸入单独2019-ncov亚单位疫苗多肽(不进行脂质体保护与gla佐剂免疫增强)后的特异性分泌型iga抗体反应。实验组分别吸入来自5μg复合多肽亚单位疫苗组合物，10μg复合多肽亚单位疫苗组合物，20μg复合多肽亚单位疫苗组合物，以生理盐水雾化作为saline对照组，以空白免疫组作为阴性对照组，进行特异性分泌型iga抗体滴度检测。使用仓鼠上呼吸道灌洗液稀样品进行elisa检测。其中，仓鼠个数为n＝6。数据是滴度平均值±sd。

实验结果见图6，图中分析了显著性差异。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，ns，不具有统计学意义。如t检验所示。根据t检验，不进行脂质体保护与gla佐剂免疫增强雾化吸入的实验组仓鼠在吸入5μg、10μg、20μg后产生分泌性iga与阴性对照组相比差别不具有统计学意义。

实施例8应用外泌体电穿孔体外转染亚单位2019-ncov糖蛋白促进免疫应答

1.外泌体电穿孔体外转染辅助免疫疗法

本领域技术人员将理解，可以将2019-ncov亚单位疫苗多肽与外泌体的体外转染方法组合或结合使用。在本发明的背景下，2019-ncov亚单位疫苗多肽免疫疗法通常依靠使用免疫效应细胞产生特异性分泌型iga抗体，中和2019-ncov病毒s亚单位蛋白与ace2受体结合部位，阻止2019-ncov病毒侵入人类上呼吸道与消化道。

一些实施方案涉及2019-ncov亚单位疫苗重组蛋白。具体的实施方案涉及表现出至少一种治疗活性的重组蛋白或多肽通过电穿孔插入到外泌体内或表面。这种外泌体会更好的被apc细胞识别特征性抗原表位，更高效地产生特异性分泌型iga抗体。

2.具体操作步骤

(1)纯化外泌体

如先前所述(alvarez-erviti等人，2011；el-andaloussi等人，2012)，通过差异离心法纯化外泌体。从胎盘间充质细胞中收集上清液，该细胞在含外泌体减少的fbs的培养基中培养48小时，随后依次进行800g5分钟和2000g10分钟的离心步骤。然后在培养瓶中使用0.2μm过滤器过滤所得的上清液，超速离心2小时后，28,000g的速度回收沉淀(beckman)。吸出上清液，将沉淀重悬于pbs中，随后超速离心2小时。然后分析纯化的外泌体并将其用于外泌体的电穿孔。

(2)外泌体电穿孔

将1×108外泌体(通过nanosight分析测量)和1μgsirna(qiagen)或shrna混合在400pl电穿孔缓冲液(1.15mm磷酸钾，ph7.2，25mm氯化钾，21％optiprep^tm)中。如前所述(alvarez-erviti等，2011；el-andaloussi等，2012)，使用genepulserxcell^tm电穿孔系统(biorad)使用4mm比色皿对外泌体进行电穿孔。电穿孔后，将外泌体用不含蛋白酶的rna酶a(sigmaaldrich)处理，然后添加10x浓缩的rnase抑制剂(ambion)，并在如上所述的超速离心方法下用pbs洗涤。

(3)外泌体体外转染

对于使用外泌体的体外转染，均如上所述将其电穿孔并用含有2019-ncov亚单位疫苗多肽pbs洗涤(5mg/ml)，电穿孔方法，以将2019-ncov亚单位疫苗多肽插入外泌体而不会破坏外泌体。

实施例9经鼻雾化吸入糖蛋白胶体脂质体颗粒

鼻粘膜和声门上喉内有一个感觉系统，似乎既对机械敏感又对化学敏感。我们的数据表明，通过微雾吸入产生的呼吸改变代表机械感受器而非化学感受器反应。从临床角度来看，假定气雾吸入反射改变了呼吸方式，从而导致部分上呼吸道呼吸流速提高，并可以将含有糖蛋白疫苗成分的纳米微小颗粒带入下呼吸道及终末肺泡，在这种情况下，是雾化吸入的有利治疗方式。吸入均匀的5微米纳米糖蛋白胶体脂质体颗粒，可以通过增加气雾的吸取深度来提高呼吸道产生igg的效率。

使用吸入器吸入糖蛋白胶体脂质体颗粒气雾剂，请按照以下步骤操作：

①从烟嘴的末端取下防尘帽。如果防尘盖没有放在烟嘴上，请检查烟嘴是否有灰尘或其他物体。确保将储药罐完全牢固地插入烟嘴中。

②要预先灌注吸入器，请充分摇匀，然后向下按压罐子3次以释放3股喷雾剂，使之远离面部。

③注意不要让气雾入您的眼睛。

④摇匀吸入器。

⑤尽可能通过嘴呼吸。

⑥握住罐子，将烟嘴放在底部，面向您，并使罐子指向上方。将吹口的开口端放入嘴中，紧闭双唇。

⑦慢慢地通过吸嘴呼吸，同时在容器上向下按一次以将药物喷入您的嘴中。

⑧尝试屏住呼吸10秒钟，使糖蛋白胶体脂质体颗粒充分进入上，下呼吸道。移开吸入器，然后缓慢呼吸。

⑨如果被告知要使用2次抽吸，请等待1分钟，然后重复上述步骤。

⑩盖上吸入器的保护盖。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110>陈宛莎

<120>一种2019-ncov亚单位疫苗组合物及其免疫方法

<130>2020.2.18

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>315

<212>prt

<213>融合蛋白-1(fusionprotein-1)

<400>1

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151015

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65707580

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290295300

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305310315

<210>2

<211>328

<212>prt

<213>融合蛋白-2(fusionprotein-2)

<400>2

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151015

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325

<210>3

<211>406

<212>prt

<213>融合蛋白-3(fusionprotein-3)

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<210>4

<211>419

<212>prt

<213>融合蛋白-4(fusionprotein-4)

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<210>5

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<213>融合蛋白-5(fusionprotein-5)

<400>5

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165170175

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<210>6

<211>252

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<213>融合蛋白-6(fusionprotein-6)

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<210>7

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<213>融合蛋白-7(fusionprotein-7)

<400>7

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151015

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<213>融合蛋白-8(fusionprotein-8)

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