一种生物医用材料防钙化的方法与流程

本发明涉及医学方法的技术领域，尤其涉及一种生物医用材料防钙化的方法。

背景技术：

生物医用材料作为一种研究人工器官和医疗器械的基础，生物医用材料现在已经成为了当代材料学科的重要分支，尤其是随着生物技术的蓬勃发展和重大突破，生物医用材料已经成为了各国科学家竞相进行研究和开发的热点，近几年来，有关医用材料以及医用材料在高新医疗技术领域应用研究相关报道层出不穷。

生物医用材料又称为生物材料，其传统领域主要包括支持运动功能人工器官(骨科植入物、人工骨、人工关节、人工假肢等)，血液循环功能人工器官(人工血管、人工心脏瓣膜等)，整形美容功能人工器官、感觉功能人工器官(人工晶体、人工耳蜗等)等，新型领域主要包括分子诊断、3d打印等。

生物医学材料的应用虽已取得极大成功，但是，长期临床应用亦暴露出不少的问题，突出表现在功能性、免疫性、服役寿命等不能很好地满足临床应用的要求。如人心瓣膜植入12年后死亡率达58％，血管支架植入后血管再狭窄率达≈10％，人工关节有效期老年组为12-15年，中青年组仅≈5年等。其中，材料的钙化严重影响材料的功能性。目前，生物医用材料的钙化速率的原理还没有完全研究清楚。但是，研究认为会影响钙化速率的因素包括病人的年龄、存在新陈代谢紊乱、饮食因素、存在感染、肠道外钙给药、脱水、该生物假体的原位变形、在外科手术植入初期内的抗凝血治疗不当、以及免疫宿主—组织响应。

近年来，已经在阻止生物医学材料的钙化方面做了很多的努力。由这些努力收获的技术可以广义分成两类：涉及用抑制钙化的一种或多种化合物对戊二醛固定组织进行预处理或者后处理，如文献：carpentier-edwardsthermafixprocess:amethodforextractingcalciumbindingsitesfrompericardialtissue，和涉及用除了戊二醛以外的化合物固定所述组织，从而降低钙化。

生物瓣材料一般用戊二醛鞣制和保存，戊二醛能加组织的热皱缩温度及机械抗拉强度，降低免疫原性，但游离的醛基具有细胞毒性作用，并降低细胞膜上钙依赖性三磷酸腺苷酶活性，引起细胞内钙含量增高，导致组织钙化。

尽管这些技术中的一部分已经被证明可以有效的降低材料钙化，但是在本领域中仍然需要对现有技术做进一步的改善或者研制新的防钙化技术。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供了一种生物医用材料防钙化的方法，将生物医用材料采用一定浓度的戊二醛交联处理、再将生物医用材料用醇类处理、经过灭菌后将生物医用材料保存在戊二醛溶液中，从而得到防钙化效果优良的生物医用材料。

为了实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

一种生物医用材料防钙化的方法，包括：

s1.将戊二醛进行处理，得到高纯度的单体戊二醛；

s2.将第一种单体戊二醛溶液的ph调节至5.0-9.0，并将生物医用材料浸泡于第一种单体戊二醛溶液中，保持一定温度且持续保存一定时间；

s3.将第一种醇类溶液的ph调节至5.0-9.0，将步骤s2中得到的生物医用材料浸泡于第一种醇类溶液中，保持一定温度且持续保存一定时间；

s4.将第二种单体戊二醛溶液的ph调节至5.0-9.0，将步骤s3中得到的生物医用材料浸泡于第二种单体戊二醛溶液中，保持一定温度且持续保存一定时间；

s5.将第三种单体戊二醛溶液的ph调节至5.0-9.0，将步骤s4中得到的生物医用材料浸泡于第三种单体戊二醛溶液中，保持一定温度且持续保存，得到防钙化的生物医用材料。

进一步的，所述步骤s1中将戊二醛进行处理具体包括将戊二醛经过气体膜分离、减压分级蒸馏、纳滤膜分离，去除戊二醛中的戊二醛二聚体、戊二醛三聚体、戊二醛四聚体的多聚体物质，得到高纯度的单体戊二醛。

进一步的，所述步骤s2中的第一种单体戊二醛溶液的物质包括磷酸缓冲溶液、戊二醛中的一种或多种；所述第一种单体戊二醛溶液的浓度为0.1％-2％；所述第一种单体戊二醛溶液的ph被调节至7.1-7.8；所述第一种戊二醛溶液的温度被调节至3℃-50℃；所述生物医用材料持续浸泡于第一种戊二醛溶液4小时-10天。

进一步的，所述步骤s3中第一种醇类溶液的物质包括醇类、磷酸缓冲溶液、hepes缓冲溶液中的一种或多种；所述醇类包括乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇中的一种或多种；所述第一种醇类溶液中醇类的体积占10％-100％；所述第一种醇类溶液的ph被调节至7.1-7.8；所述第一种醇类溶液的温度被调节至3℃-40℃；所述生物医用材料持续浸泡于第一种醇类溶液10小时-3天。

进一步的，所述步骤s4中所述第二种戊二醛溶液的物质包括磷酸缓冲溶液、戊二醛中的一种或多种；所述第二种戊二醛的浓度为0.05％-2％；所述第二种戊二醛溶液的ph被调节至7.1-7.8；所述第二种戊二醛溶液的温度被调节至3℃-45℃；所述生物医用材料持续浸泡于第二种戊二醛溶液4小时-7天。

进一步的，所述步骤s5中第三种戊二醛溶液的物质包括磷酸缓冲溶液、戊二醛中的一种或多种；所述第三种戊二醛的浓度为0.1％-1％；所述第三种戊二醛溶液的ph被调节至7.1-7.8；所述第三种戊二醛溶液的温度被调节至3℃-40℃；所述生物医用材料持续浸泡于第三种戊二醛溶液并长期保存。

进一步的，所述第一种醇类溶液中醇类的体积占60％-100％。

进一步的，所述的生物医用材料为哺乳动物组织；所述哺乳动物组织为心包组织、瓣膜组织、血管组织、肠外膜、胸膜、腹膜、跟腱，韧带中的一种或多种。

进一步的，所述步骤s2和/或步骤s3和/或步骤s4和/或步骤s5在非氧化条件下执行，所述非氧化条件包括键入抗氧化剂、惰性气体保护、暗光，用于增强生物医用材料的性能。

进一步的，所述第一种单体戊二醛溶液和/或第一种醇类溶液和/或第二种单体戊二醛溶液和/或第三种单体戊二醛溶液中加入抗氧化剂，所述抗氧化剂包括抗坏血酸。

进一步的，所述第一种单体戊二醛溶液和/或第二种单体戊二醛溶液和/或第三种单体戊二醛溶液中加入甲醛、表面活性剂、乙醇、异丙醇中的一种或多种，以提高溶液的实际功效。

进一步的，所述第一种醇类溶液中包括甲醛、表面活性剂、戊二醛、异丙醇中的一种或多种，以提高溶液的实际功效。

进一步的，在配置所述第一种单体戊二醛溶液、第一种醇类溶液、第二种单体戊二醛溶液、第三种单体戊二醛溶液时采用磷酸缓冲溶液和/或hepes缓冲溶液。

与现有技术相比，本发明采用的戊二醛为经过气体膜分离、减压分级蒸馏、纳滤膜分离去除戊二醛二聚体、戊二醛三聚体和戊二醛四聚体等多聚体物质，等得到的高纯度单体戊二醛。将生物医用材料采用一定浓度的单体戊二醛交联处理、再将生物医用材料用醇类处理、经过灭菌后将生物医用材料保存在单体戊二醛溶液中。从而得到防钙化效果优良的生物医用材料。

附图说明

图1是实施例一提供的一种生物医用材料防钙化的方法流程图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种生物医用材料防钙化的方法。

实施例一

本实施例提供一种生物医用材料防钙化的方法，如图1所示，包括：

s11.将戊二醛进行处理，得到高纯度的单体戊二醛；

s12.将第一种单体戊二醛溶液的ph调节至5.0-9.0，并将生物医用材料浸泡于第一种单体戊二醛溶液中，保持一定温度且持续保存一定时间；

s13.将第一种醇类溶液的ph调节至5.0-9.0，将步骤s12中得到的生物医用材料浸泡于第一种醇类溶液中，保持一定温度且持续保存一定时间；

s14.将第二种单体戊二醛溶液的ph调节至5.0-9.0，将步骤s13中得到的生物医用材料浸泡于第二种单体戊二醛溶液中，保持一定温度且持续保存一定时间；

s15.将第三种单体戊二醛溶液的ph调节至5.0-9.0，将步骤s14中得到的生物医用材料浸泡于第三种单体戊二醛溶液中，保持一定温度且持续保存，得到防钙化的生物医用材料。

在步骤s11中，将戊二醛进行处理，得到高纯度的单体戊二醛。

在本实施例中，所采用的戊二醛为经过气体膜分离、减压分级蒸馏、纳滤膜分离去除戊二醛二聚体、戊二醛三聚体和戊二醛四聚体等多聚体物质等得到的高纯度单体戊二醛。调节第一种、第二种、第三种单体戊二醛溶液的ph至5.0-9.0，优选的ph至5.0-7.0，碱性条件下戊二醛不稳定，易聚合成多聚体。若ph≥8的溶液通常在4周内失去活性，活化的碱性戊二醛使用时间不应超过两周。将生物医用材料浸泡于戊二醛溶液中，保持一定温度，持续一定时间。胶原蛋白的基本结构单位是原胶原，原胶原是由三条α-肽链组成的纤维状蛋白质，相互拧成三股螺旋状构型,长300nm，直径1.5nm。三股螺旋是指各型胶原都是由三条相同或不同的肽链形成三股螺旋。胶原的三螺旋结构彻底松开，成为3条自由的肽链，相对分子质量从几千到几万，分子量分布很宽。采用单体戊二醛进行交联的优点是，单体戊二醛只会在肽链内部发生交联，交联比较牢固；而戊二醛多聚体会在胶原蛋白的股与股之间发生交联，即产生所谓的假性交联，在后期生物材料的长周期使用过程中假性交联破裂产生大量游离醛基，使得生物材料的交联度大大降低。

在步骤s12中，将第一种单体戊二醛溶液的ph调节至5.0-9.0，并将生物医用材料浸泡于第一种单体戊二醛溶液中，保持一定温度且持续保存一定时间。

在本实施例中，第一种单体戊二醛溶液的主要物质包括磷酸缓冲溶液、戊二醛中的一种或多种；

第一种单体戊二醛溶液的浓度为0.1％-2％；

第一种单体戊二醛溶液的ph被调节至7.1-7.8；

第一种戊二醛溶液的温度被调节至3℃-50℃；

生物医用材料持续浸泡于第一种戊二醛溶液4小时-10天。

具体的，在使用第一戊二醛溶液时，用该溶液与配置好的磷酸缓冲溶液混合，配置0.5％的戊二醛水溶液。使用1mol/l的盐酸溶液和1mol/l氢氧化钠溶液将戊二醛水溶液的ph调整到7.4。将需要做防钙化处理的生物医用材料完全浸没于溶液中。将存有生物医用材料的戊二醛溶液放置于25℃环境中，放置70小时。

在步骤s13中，将第一种醇类溶液的ph调节至5.0-9.0，将步骤s12中得到的生物医用材料浸泡于第一种醇类溶液中，保持一定温度且持续保存一定时间。

第一种醇类溶液的主要物质包括醇类、磷酸缓冲溶液、hepes缓冲溶液中的一种或多种；其中醇类包括乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇中的一种或多种；另外，第一种醇类溶液中可能含有其他化学成分以保证或提高溶液的实际功效。例如甲醛、表面活性剂、戊二醛、异丙醇等。

第一种醇类溶液中醇类的体积占10％-100％；优选的第一种醇类溶液中醇类的体积占60％-100％。

第一种醇类溶液的ph被调节至7.1-7.8；所述第一种醇类溶液的温度被调节至3℃-40℃；

生物医用材料持续浸泡于第一种醇类溶液10小时-3天。

具体的，取无水乙醇和hepes缓冲溶液混合，无水乙醇体积占90％，使用1mol/l的盐酸溶液和1mol/l氢氧化钠溶液将戊二醛水溶液的ph调整到7.4。将步骤s12中处理的生物医用材料用生理盐水清洗干净后完全浸没于溶液中。将存有生物医用材料的戊二醛溶液放置于25℃环境中，放置40小时。

在步骤s14中，将第二种单体戊二醛溶液的ph调节至5.0-9.0，将步骤s13中得到的生物医用材料浸泡于第二种单体戊二醛溶液中，保持一定温度且持续保存一定时间。

第二种戊二醛溶液的物质包括磷酸缓冲溶液、戊二醛中的一种或多种；

第二种戊二醛的浓度为0.05％-2％；

第二种戊二醛溶液的ph被调节至7.1-7.8；

第二种戊二醛溶液的温度被调节至3℃-45℃；

生物医用材料持续浸泡于第二种戊二醛溶液4小时-7天。

具体为，使用第二戊二醛溶液，甲醛，磷酸缓冲溶液混合。配置0.6％的戊二醛水溶液.使用1mol/l的盐酸溶液和1mol/l氢氧化钠溶液将戊二醛水溶液的ph调整到7.4。将步骤s13的生物医用材料用生理盐水清洗干净后完全浸没于溶液中。将存有生物医用材料的戊二醛溶液放置于25℃环境中，放置70小时。

在步骤s15中，将第三种单体戊二醛溶液的ph调节至5.0-9.0，将步骤s14中得到的生物医用材料浸泡于第三种单体戊二醛溶液中，保持一定温度且持续保存，得到防钙化的生物医用材料。

第三种戊二醛溶液的物质包括磷酸缓冲溶液、戊二醛中的一种或多种；

第三种戊二醛的浓度为0.1％-1％；

第三种戊二醛溶液的ph被调节至7.1-7.8；所述第三种戊二醛溶液的温度被调节至3℃-40℃；

生物医用材料持续浸泡于第三种戊二醛溶液并长期保存。

具体的，使用第三戊二醛溶液，磷酸缓冲溶液混合。配置0.4％的戊二醛水溶液。使用1mol/l的盐酸溶液和1mol/l氢氧化钠溶液将戊二醛水溶液的ph调整到7.4。将步骤s14中处理的生物医用材料用生理盐水清洗干净后完全浸没于溶液中。将存有生物医用材料的戊二醛溶液放置于25℃环境中长期保存。

本实施例中，在第一种单体戊二醛溶液和/或第一种醇类溶液和/或第二种单体戊二醛溶液和/或第三种单体戊二醛溶液中加入抗氧化剂，优选抗坏血酸。

本实施例中提到的每一种戊二醛溶液，都可以作为最后的消毒或灭菌溶液。另外在第一种单体戊二醛溶液和/或第二种单体戊二醛溶液和/或第三种单体戊二醛溶液可加入一定可能含有其他化学成分以保证或提高溶液的实际功效。例如甲醛、表面活性剂、乙醇、异丙醇等。

在第一种醇类溶液中可能含有其他化学成分以保证或提高溶液的实际功效。例如甲醛、表面活性剂、戊二醛、异丙醇等。

在实际操作中，最终灭菌优选在密封的容器中进行，生物医用材料将在所述容器中储存和运输直到完成植入。在这过程中，必须满足存放温度的要求，一般优选3℃-40℃。保存溶液ph优选7.1-7.8，更优选7.4。保持在一定温度有利于ph值稳定。所述容器通过运输放置在医院或其他位置，被储存起来直到使用。

本实施例考虑将步骤s12和/或步骤s3和/或步骤s4和/或步骤s15在非氧化条件下执行，其中非氧化条件包括键入抗氧化剂、惰性气体保护、暗光，用于增强生物医用材料的性能。

在配置上述戊二醛溶液及醇溶液时用到了磷酸缓冲溶液和/或hepes缓冲溶液。

每一步操作(步骤s12-s15)优选在尽可能无菌的环境下操作，如万级净化车间、百级层流室、生物安全柜等处，以减少生物负载和环境中的颗粒物等。

可用于本实施例的生物医用材料，优选哺乳动物组织，特别是心包组织、瓣膜组织、血管组织、肠外膜、胸膜、腹膜、跟腱，韧带等。

在优选的实施例中，生物医用材料的防钙化方法适用于任何含有哺乳动物组织的部件。例如心脏瓣膜、带瓣管道、人工血管、生物补片，韧带等各种可植入物用于置换或修复手术。

与现有技术相比，本实施例采用的戊二醛为经过气体膜分离、减压分级蒸馏、纳滤膜分离去除戊二醛二聚体、戊二醛三聚体和戊二醛四聚体等多聚体物质，等得到的高纯度单体戊二醛。将生物医用材料采用一定浓度的单体戊二醛交联处理、再将生物医用材料用醇类处理、经过灭菌后将生物医用材料保存在单体戊二醛溶液中。从而得到防钙化效果优良的生物医用材料。

实施例二

本实施例提供一种生物医用材料防钙化的方法与实施例一的不同之处在于：

本实施例为对比本发明工艺与传统处理工艺的不同，进行以下三个实验，并具体说明。

实验一：

交联度测试检验方法常用皮革热皱缩法，胶原组织的交联程度与其受热后的皱缩温度呈正相关。交联度对比实验：

取经过气体膜分离、减压分级蒸馏、纳滤膜分离去除戊二醛二聚体、戊二醛三聚体和戊二醛四聚体等多聚体物质，等得到的高纯度单体戊二醛作为第一组(a1，a2，a3，a4，a5)，没有经过上述工艺处理的戊二醛为第二组(b1，b2，b3，b4，b5)。分别处理牛心包。制成产品后，放入疲劳测试系统加速疲劳一亿次后用皮革热皱缩法测试样品热皱缩温度。

方法是将各组试片切成10cm×50cm大小，用蒸馏水冲洗后，将试片平直插入皮革温度仪的上下挂钩中，另一端系3g重物，以蒸馏水为介质，从室温开始加热，每分钟升高2℃，以试片开始收缩指针发生偏转作为它的热皱缩温度。在本实施例中，经过疲劳试验后的交联度测试数据数据如表1：

表1

实验二：

经过疲劳试验后的液体中的游离醛基的含量。

取实验一中的第一组(a1，a2，a3，a4，a5)，第二组(b1，b2，b3，b4，b5)的溶液测试，测试游离醛基的含量，如表2。

醛基的检验方法常用的有两种，一是用新制的银氨溶液检验，二是用新制的氢氧化铜悬浊液检验，以下分别对两种方法分别加以介绍。

(一)用新制的银氨溶液检验

1：制取银氨溶液

由于此实验需用新制的银氨溶液，所以银氨溶液需现用现配，制取银氨溶液方法为：向硝酸银溶液中逐滴滴加氨水，直到刚开始产生的白色沉淀恰好完全溶解时立即停止滴加，这时即制成了银氨溶液。中间过程产生的白色沉淀是氢氧化银，有关反应方程式如下：

2：用银氨溶液检验有机物中的醛基

取一支洁净的试管，向其中注入待检测的有机溶液，再加入银氨溶液，混合均匀，把试管放入水浴中加热，控制水浴的温度在60℃～70℃，若最终试管内出现光亮的银镜，证明有机分子内含有醛基，若是乙醛则有关反应为：若是甲醛，方程式如下：

甲醛虽然是一元醛，但结构比较特殊，相当于是二元醛，所以消耗银氨溶液的量是等物质的量的其他一元醛的二倍。也正是这个原因，平时在做有关由一元醛与银氨溶液反应的西提时先要验证一下该一元醛是不是甲醛

此法检验醛基，实验要点是：配制银氨溶液时氨水不能过量，并且必须要求水浴加热。

其中氢氧化二氨合银是银氨溶液中的溶质，它是一种强电解质，也是一种强碱。由于该实验过程中产生了光亮的银镜，化学上又把这类反应叫银镜反应。做完试验后，试管内壁上的银可用稀硫酸除去。

(二)用新制的氢氧化铜悬浊液检验

1：制取氢氧化铜悬浊液

用此方法检验醛基，氢氧化铜悬浊液也需现用现配，制备方法为：向氢氧化钠溶液中滴加少量的硫酸铜溶液至出现悬浊物即制成了氢氧化铜悬浊液。这个过程中的反应方程式为：

2：用新制的氢氧化铜悬浊液检验有机物中的醛基

取一支洁净的试管，向其中注入待检测的有机溶液，再加入新制的氢氧化铜悬浊液，混合均匀后直接放在酒精灯上加热至沸腾，若最终出现砖红色沉淀，就说明被检验机物分子内含有醛基，该砖红色沉淀是氧化亚铜。

若被检验的有机物是乙醛，则有关反应为：

此法检验醛基，实验要点是：配制新制的氢氧化铜悬浊液时要求氢氧化钠过量，所以在配制时要求用少量的硫酸铜溶液。另外在检验醛基时，需要直接加热至沸腾，并且煮沸时间不能过长，防止氢氧化铜分解生成黑色的氧化铜。

此实验原理在医学上可用做糖尿病的检验，因为糖尿病患者的尿液里含有葡萄糖，而葡萄糖分子内含有醛基。

小结：醛基的检验需在碱性条件下进行。常见的含有醛基的物质有：醛类、甲酸、甲酸盐、甲酸酯、葡萄糖，麦芽糖等，这些物质都能发生银镜反应，也都能与新制的氢氧化铜悬浊液反应，生成砖红色沉淀。另外有些糖类本身不含醛基，但在酸性条件下水解可以生成有醛基的物质。例如，蔗糖分子内没有醛基，但水解生成物之一--葡萄糖含有醛基。淀粉和纤维素水解产物都是葡萄糖。在检验糖类物质水解产物时，由于水解是在酸性条件下进行的，所以水解液呈酸性，需将其调节至碱性才可检验。

经过疲劳试验后的液体中的游离醛基的含量如表2：

表2

实验三：

取经过气体膜分离、减压分级蒸馏、纳滤膜分离去除戊二醛二聚体、戊二醛三聚体和戊二醛四聚体等多聚体物质，等得到的高纯度单体戊二醛作为第一组(c1，c2，c3，c4，c5，c6，c7，c8)，没有经过上述工艺处理的戊二醛为第二组(d1，d2，d3，d4，d5，d6，d7，d8)。分别处理牛心包。得到的牛心包分别料切割出10mm×10mm大小的样品，使用无菌生理盐水漂洗干净。在无菌条件下，将以上牛心包分别植入小鼠背部皮下，使用5-0prolene线间断缝合伤口，送动物实验室常规饲养，术后常规青霉素注射3d【20万u/(kg·d)】。

组织钙含量检测：将植入牛心包试片60d后大鼠(178～327g)戊巴比妥钠过量麻醉，取出各组试片，进行组织钙含量检测：各组试片用蒸馏水漂洗3次，10min/次，滤纸吸干表面水分，80℃干烤至恒重后用原子吸收火焰法测钙含量。实验结果如表3：

表3

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。