阿魏酸甲酯用于制备治疗/预防血栓药物中的应用的制作方法

本发明属于天然药物化学技术领域，本发明涉及阿魏酸甲酯在制备药物中的应用，具体涉及阿魏酸甲酯用于制备治疗/预防血栓药物中的应用。

背景技术：

随着社会经济的发展和医疗水平的提高，人均寿命已经明显增长，而心脑血管疾病随着人均寿命的增长与人口老龄化的加剧已成为老年疾病中最严重的疾病之一，严重影响人们的生活水平，血栓疾病是脑心血管疾病的一种，且血栓疾病发病率呈逐年上升和年轻化的趋势。血栓是指血液在人体体内过度凝固导致机体心脑血管供血不足引起心肌梗死、缺血性猝死、脑卒中、冠心病等疾病。

技术实现要素：

本发明的目的是提供阿魏酸甲酯在活血方面用于抑制血栓的形成从而为血栓类疾病的治疗和预防提供一种新的候选化合物。

本发明提供了如下技术方案：

阿魏酸甲酯或黄花油点草用于制备治疗/预防血栓病药物中的应用。

可选的，所述的血栓病包括高血压、动脉粥样硬化、脑血栓、冠心病、心肌梗死、弥漫性血管内凝血、肺栓塞或深部静脉血栓。

0.1～300μg/ml阿魏酸甲酯溶液用于制备治疗/预防高血压或动脉粥样硬化药物中的应用。

1.56～100μg/ml阿魏酸甲酯溶液用于制备治疗/预防动脉粥样硬化药物中的应用。

12～780ng/ml阿魏酸甲酯溶液用于制备治疗/预防冠心病或动脉粥样硬化药物中的应用。

0.5～2mg/ml阿魏酸甲酯溶液用于制备治疗/预防血栓病药物中的应用。

0.1～0.2mg/ml阿魏酸甲酯溶液用于制备治疗/预防血栓病药物中的应用。

按哺乳动物体重计，50～100mg/kg阿魏酸甲酯用于制备治疗/预防血栓病药物中的应用。

可选的，所述的血栓病包括高血压、动脉粥样硬化、脑血栓、冠心病、心肌梗死、弥漫性血管内凝血、肺栓塞或深部静脉血栓。

可选的，所述的阿魏酸甲酯溶液为阿魏酸甲酯甲醇溶液。

本发明的有益效果：

实验结果显示阿魏酸甲酯体外能够改善大鼠去肾上腺素引起的血管收缩，起到舒张血管的作用。阿魏酸甲酯能够抑制大鼠血液体外的凝固，改善大鼠血液在血管中的沉积作用，达到预防血栓的作用。阿魏酸甲酯具有抗氧化与抑制血管的损伤，抑制dpph自由基的氧化作用，抑制h2o2对huvec细胞的氧化损伤作用和对fecl3氧化大鼠颈总动脉在血管中形成血栓具有抑制作用。

附图说明

图1阿魏酸甲酯对大鼠体外血管的舒张作用(n＝6)注：与空白对照组比较：p<0.05为*，p<0.001为**.与阳性对照组snp比较：p<0.05为#,p<0.01为##；

图2阿魏酸甲酯对dpph自由基的清除率；

图3阿魏酸甲酯体外溶栓率；注：与空白对照比较：p<0.01为**，p<0.001为***，与阳性对照组比较：p<0.001为###；

图4阿魏酸甲酯对huvec的毒性作用；注：图4与空白组比较：p<0.01为**，p<0.001为***；

图5是h2o2对huvec刺激作用；注：图5与空白组比较：p<0.05为*，p<0.01为**，p<0.001为***；

图6阿魏酸甲酯对h2o2刺激huvec的预保护作用；注：图6与空白组比较：p<0.001为***，与模型组比较：p<0.01为##，p<0.001为###；

图7大鼠颈总动脉血栓重量；注：与模型组对比：p<0.01为**，p<0.001为***,与阳性组对比：p<0.01为##,p<0.001为###；

图8大鼠颈总动脉血栓抑制率；注：与模型组对比：p<0.01为**，p<0.001为***,与阳性组对比：p<0.01为##,p<0.001为###；

图9阿魏酸甲酯核磁共振¹h-nmr谱；

图10阿魏酸甲酯核磁共振¹³c-nmr谱。

具体实施方式

血栓病是指血液在人体体内过度凝固而形成的严重疾病，是由血栓形成和血栓栓塞两种病理过程而产生的，临床上称为血栓栓塞性疾病，包括心肌梗死、脑血栓、弥漫性血管内凝血、肺栓塞、深部静脉血栓等严重的心脑血管疾病。氧肾上腺素作用于平滑肌细胞α受体，通路激活受体门控性钙离子通道，造成血管收缩，导致高血压。动脉粥样硬化发生机制认为动脉粥样硬化疾病表现了一种高氧化应激状态,它以血管壁中脂质和蛋白质氧化为特征,活性氧与炎性因子相互作用,贯穿动脉粥样硬化的发生发展过程，因此抑制血管内自由基与活性氧能达到抑制动脉粥样硬化的作用。现代医学研究发现血栓形成是指血液在变流状态下，止血机制过度激活的一种病理性结局。血栓是形成的原因是血液循环过氧化脂质易导致血管壁损伤，血管内起抗凝血作用的细胞受到抑制；血液的凝聚，血小板活性的增加导致血液本身质地比较粘稠，引起血栓；血液流速减慢或血容量下降，因此抑制止血机制过度激活，抑制血管内壁氧化能起到抑制血栓形成的作用。

阿魏酸甲酯或黄花油点草对血管具有舒张作用，能用应用于预防高血压、动脉粥样硬化。

阿魏酸甲酯或黄花油点草能延长凝血时间、溶解血栓，能应用于预防及治疗血栓及冠心病、。

阿魏酸甲酯或黄花油点草在抑制血管损伤中的应用，预防动血栓、脉粥样硬化和高血压。

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

黄花油点草为百合科油点草属黄花油点草(tricyrtismaculate(d.don)j.f.macbr.)的干燥全草，民间习用药材，临床上用于骨伤瘀血和缺血性脑血管疾病，俗称羊角七，是陕西“太白七药”的重要品种之一，不仅对骨伤科瘀血引起的各种病症有较好疗效，而且对缺血性脑血管疾病引起的手脚麻木、偏头痛、头晕、乏力等症效果突出。文献报道黄花油点草的提取物具有抗氧化，可显著改善血瘀小鼠血液微循环，增加动、静脉管径及血流速度变化值，显著延长血瘀小鼠凝血时间，并且抑制血瘀大鼠血栓的形成。本实验对黄花油点草进行分离，并对其中的成分进行活性测定，检测到一种具有抑制血栓形成的化合物——阿魏酸甲酯。

制备实施例：

黄花油点草(10kg)全草粉碎，室温下用(体积浓度)80％meoh浸泡提取4次(4×45l，依次为3、5、7和7天,浓缩到1毫升药液含有1克原药材即1g/ml)。合并渗滤液，并用旋转蒸发仪进行减压浓缩得到粗提取物(495.0g)。将粗提取物溶解于水中，并依次用乙酸乙酯和正丁醇进行萃取(5×1l)。得到乙酸乙酯相、正丁醇相和水相。

将乙酸乙酯相在diaionhp-20极性大孔树脂中依次使用50％、75％、85％和100％(甲醇/水,v/v)洗脱，按洗脱顺序依次得到四个馏分(fr.1-4)。将fr.2用中压分离系统在mci柱上分离(6×20cm，6×180ml)，并用甲醇水溶液(50％、75％和85％)(甲醇/水,v/v)洗脱，得到三个馏分(fr.2a-2c)。将fr.2b(22.0g)通过硅胶cc(300-400目，7×32cm，5×1l)使用pe/丙酮(20：1至1：1.5，v/v)纯化，得到七个亚级馏分(fr.2b1-fr.2b7)。将fr.2b2.1通过硅胶柱用氯仿/甲醇(0-100,v/v)、石油醚/乙酸乙酯(5:1,v/v)洗脱分离，得到阿魏酸甲酯。

通过核磁共振1h-nmr谱和13c-nmr鉴定与文献对比得出为阿魏酸甲酯，1h-nmr谱和13c-nmr鉴定(具体见图9和图10)。

实施例1：血管舒张实验

实验材料：spf级sd雄性大鼠(200-250g)均购自成都达硕实验动物有限公司。nacl,kcl,nahco3,kh2po4,cacl2,mgso4,葡萄糖(上海信裕生物科技有限公司),pe,snp,ach均为(sigma公司)

实验方法：将6只sd雄性大鼠脱颈处死，肠系膜动脉血管被迅速分离并转移至4℃含氧k-h液中。迅速剥离血管周围脂肪后，将游离干净的动脉剪成长约2-3mm长的环段。将血管环安装在含有1.5mlkrebs-henseleit(k-h)溶液的器官浴中。将k-h溶液保持在37℃，并用95％o2/5％co2气体混合物连续鼓泡。拉伸主动脉至其静息张力为0.5g。平衡60min，期间，每10min更换一次浴液。平衡期过后，用高k⁺(60mm)k-h溶液刺激组织使主动脉环收缩，验证其可用性。用高钾k-h液(60mmol/lk⁺)检验动脉血管环收缩性，选择两次收缩幅度相差<10％的血管环用于实验。

将主动脉环与去氧肾上腺素(1×10^-4m)预收缩，达到平稳状态后，通过向池中添加阿魏酸甲酯的累积浓度即可获得被测化合物诱导的弛豫的浓度-响应曲线(n＝6)。硝普钠(snp)用作阳性对照,使用传感器测量并记录张力。

实验结果见图1：阿魏酸甲酯在0.1-300μg/ml浓度范围内对去氧肾上腺素导致的血管舒张有一定的降血压和抗动脉粥样硬化作用。图1在pe预收缩到最大张力后，浓度积累法分别用阿魏酸甲酯和snp诱导血管舒张曲线，随着加入浓度的累积，阿魏酸甲酯和snp在一定浓度范围内舒张血管的作用随浓度的增大而增强。阿魏酸甲酯最大舒张率为33.97％±6.6％，硝普纳的最大舒张率为67.93％±12.68％。阿魏酸甲酯与阳性组相比舒张血管作用弱于snp。

实施例2：dpph自由基清除实验

实验材料：dpph、abts试剂(湖北津乐达化工有限公司)，1510型全波长酶标仪(thermofisherscientficoyratastie2fi-0162vantaafiniand)。

实验方法:制备100μmdpph的甲醇溶液，然后在96孔微孔板加入dpph溶液100μl再依次加入不同浓度0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100μg/ml的阿魏酸甲酯的甲醇溶液10μl的样品溶液混合。在避光孵育30分钟后，使用酶标仪在517nm上测量吸光度，所有测试均一式三份进行^[8-9]。将水溶性维生素e用作阳性对照，并根据以下公式计算清除率：

清除率＝[1-(样品-空白样品)]/(对照-空白对照)×100％

实验结果见图2：阿魏酸甲酯在浓度为1.56-100μg/ml浓度范围内提高了清除自由基的能力，具有抗动脉粥样硬化作用。图2阿魏酸甲酯的自由基清除率ec50值为12.37μg/ml,阳性对照组水溶性维生素e的自由基清除率为ec50值为8.76μg/ml。阿魏酸甲酯与水溶性维生素ec50值相近，清除dpph自由基能力也相近。

实施例3：体外抗凝血实验

实验材料：凝血酶原时间(pt)测定试剂盒(105237)；活化部分凝血酶时间(aptt)测定试剂盒(112182)；凝血酶时间(tt)测定试剂盒(121151)均由上海太阳生物技术有限公司生产。spf级sd雄性大鼠(200-250g)均购自成都达硕实验动物有限公司。

实验方法：样品的制备

制备浓度为0.25、0.5、1和2mg/ml的阿魏酸甲酯和阳性药阿司匹林(1mg/ml)。取新鲜的大鼠血液与3.8g/l柠檬酸钠(9:1，v/v)混合后在3000rpm/min下离心15min，取上清液备用。

体外抗凝血测定

将浓度为0.125、0.25、0.5、1mg/ml(100μl)的阿魏酸甲酯和阿司匹林分别添加到400μl血清中，空白组加入100μl的纯水，使用全自动凝血仪进行aptt、pt、tt测试。

表1.阿魏酸甲酯体外抗凝血活性测定(n＝3)

注：与空白对照组比较：p<0.05为*，p<0.01为**，p<0.001为***。与阳性对照组比较：p<0.05为^#。

实验结果见表1：阿魏酸甲酯浓度0.5-2mg/ml通过延长凝血时间达到抗血栓作用。表1阿魏酸甲酯和阳性对照组阿司匹林与空白对照组相比存在显著性差异。阿魏酸甲酯在0.5-2mg/ml范围内，随着阿魏酸甲酯的浓度增大atpp和tt对凝血的时间增长，但对pt凝血因子的影响没有显著性差异。

实例4：体外溶栓实验

实验材料：spf级sd雄性大鼠(200-250g)均购自成都达硕实验动物有限公司，生理盐水。

实验方法：血液处理：

将做好标记的微量离心管称重，记录其重量并记为m1，微量离心管中分别加入500μl的新鲜取的大鼠全血，在37℃下恒温孵育90min以使血液充分凝固。待血液凝固后，在不破坏血凝块的基础上小心析出上层的血清，将离心管称量记录其重量并记为m2，并计算血凝块的质量并记为m3(m3＝m2-m1)。

体外溶栓测定：

实验分为3组空白对照组、阳性对照组、给药组。向各离心管中分别加入500μl不同浓度的阿魏酸甲酯甲醇溶液(0.05、0.1、0.15、0.2mg/ml)，另外以500μl不同浓度的阿司匹林作为阳性(溶栓效果)对照(0.1mg/ml)，以500μl生理盐水作为对照。所有离心管置于37℃恒温孵育150min，并观察血块裂解情况。孵育完成后，将离心管取出，在不破坏血凝块的基础上小心析出上层液体，完成后将离心管称重，记为m4，并计算裂解后血凝块的重量，记为m5(m5＝m4-m1)，最后计算血凝块裂解率＝((m3-m5)/m3)×100％。

实验结果见图3：在浓度0.1-0.2mg/ml具有抗血栓作用。图3阿魏酸甲酯与空白对照组相比具有显著性差异，切溶栓的作用随着浓度的增大增强，在0.1-0.2mg/ml范围内阿魏酸甲酯溶栓作用与未处理组有显著性差异。

实例5：阿魏酸甲酯对双氧水诱导的huvec预保护作用

实验材料：超净工作台(苏州市金净净化设备科技有限公司)。snayoco2恒温培养箱(美国)，olympusckx41倒置相差显微镜。725型超低温冷冻冰箱(美国，thermoforma)；1510型全波长酶标仪(thermofisherscientficoyratastie2fi-0162vantaafiniand)；胰蛋白酶和mtt、dmso(sigma公司)；dmemf-12培养基，d-hanks液(gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；h2o2(成都市科龙化工试剂厂)；水为超纯水。细胞株:人脐静脉内皮细胞株(humanumbilicalveinendothelialcells，huvecs)购自上海酶研生物科技有限公司。

实验方法：h2o2模型制作

取对数期的huvec细胞制成细胞悬液以1×10⁴/孔接种于96孔板，每孔100μl，恒温培养24h后除空白对照组加10μl的空白培养基，其余h2o2组等体积加入终浓度为300、400、500、600、800μm的h2o2损伤液，恒温孵育24h后用mtt法检测各孔od值，重复3次。

阿魏酸甲酯对huvec细胞的毒性实验：取对数期huvec细胞制成细胞悬液以1×10⁴/孔接种于96孔板，恒温孵育24h，空白对照组加入10μl的空白培养基，阿魏酸甲酯组等体积加入终浓度依次为0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、50、100μg/ml。恒温孵育24h。后用mtt法检测各孔od值，重复3次。

实验结果见图4，从图中可看出孵育24h后，与空白对照组相比，浓度为0.31μg/ml的阿魏酸甲酯对huvec细胞活性没有显著性影响。

阿魏酸甲酯对h2o2损伤的huvec活性影响：取对数期huvec细胞制成细胞悬液以1×10⁴/孔接种于96孔板，恒温孵育24h，随机分为模型组、空白组、给药组。将浓度依次为6、12、24、49、98、200、390、780ng/ml的阿魏酸甲酯一次加入96孔板中孵育2h，加入500μm的h2o2造模，恒温孵育24h后后用mtt法检测各孔od值，重复3次。

实验结果见图5，采用500μm的h2o2作用于huvec细胞24h后抑制率达到50％，因此本实验采用500μm的h2o2作用于huvec细胞24h作为损伤模型的造模剂量。

血管内皮损伤是动脉粥样硬化过程中的始动环节，h2o2损伤血管内壁，同时活性氧导致的低密度脂蛋白氧化程度抑制动脉粥样硬化的形成。阿魏酸甲酯预防冠心病、动脉粥样硬化实验结果见图6：在浓度12-780ng/ml对双氧水对细胞的损伤，对冠心病、动脉粥样硬化具有预防作用。图6阿魏酸甲酯和模型组与空白对照组相比模型组p<0.001为***，细胞活性显著降低，阿魏酸甲酯与模型组相比，p<0.01为^##，p<0.001为^###。从浓度12-780ng/ml细胞活性明显增强，并且随着阿魏酸甲酯浓度的增加细胞活性随之增加。

实例6：大鼠颈总动脉血栓实验

实验材料：spf级sd雄性大鼠(200-250g)均购自成都达硕实验动物有限公司。阿司匹林肠溶片(拜耳医药有限公司)，六水三氯化铁(南京化学试剂股份有限公司)，羧甲基纤维素钠，吐温80，生理盐水。

实验方法：将30只大鼠随机分为6组，假手术组(空白组)、模型组，对照组(阿司匹林肠溶片100mg/kg)和阿魏酸甲酯高(100mg/kg)、中(50mg/kg)、低(25mg/kg)剂量组。按照(1ml/100g)剂量灌胃，连续给药7天。最后一次给药前12h禁食，给药30分钟后用水合氯醛(10％)麻醉，将右侧颈总动脉分离，用聚乙烯塑料塑料将动脉血管与其他组织隔开，给药组用浸润了4％fecl3的滤纸条包裹动脉5min,诱导血栓形成迅速剪下1cm血管用滤纸吸干周围的残血，立即称重，然后剪开血管壁称量血管壁的重量并计算血栓湿重量和血栓抑制率,假手术组用生理盐水浸润操作同给药组。

fecl3导致血管内膜损伤，引起血小板粘附、聚集、释放产生血栓。实验结果见图7和图8：阿魏酸甲酯在浓度为(50、100mg/kg)对大鼠动脉血栓形成有一定的抑制作用，能用于预防血栓的形成。fecl3干预大鼠颈总动脉产生血栓，给予阿魏酸甲酯进行预防，随着阿魏酸甲酯的浓度增高，大鼠颈总动脉血栓的重量减轻，说明大鼠颈总动脉清除率随着阿魏酸甲酯的含量增高抑制血栓形成的作用增强，当给药剂量为50mg/kg时有显著性差异。