一种利用壳寡糖提高血清白蛋白起泡性和泡沫稳定性的方法与流程

本发明涉及蛋白起泡技术领域，尤其涉及一种利用壳寡糖提高血清白蛋白起泡性和泡沫稳定性的方法。

背景技术：

血清白蛋白是血浆中最为丰富的蛋白质，占血浆蛋白含量的60％，是生物体内具有重要生理功能的大分子。血清白蛋白水溶性好，制备方便，稳定性高，富含丰富的营养价值，主要应用于食品、药品、动物饲料、细胞培养等领域，以血清白蛋白为主要成分的血豆腐也是一种很受消费者欢迎的食品。壳寡糖是壳聚糖或几丁质的降解产物，具有降血脂、抗氧化、抑菌、加速钙和铁的吸收、抑制肿瘤细胞生长等生物活性，具有良好的增稠和持水性，且广泛应用于食品、药品和化工等领域。

泡沫是一个气相与液相共存的体系，在食品、化妆品、药品等很多领域都有应用。蛋白质在泡沫型食品中占有重要地位，蛋白质作为表面活性组分可以形成高度弹性的界面膜，可防止泡沫聚结、排水和粗化。蛋糕、面包、冰淇淋、奶油、蛋奶酥、啤酒是很常见的泡沫型食品，均匀的泡沫提供了食品细腻、柔滑、均匀的质感和亮度，赋予这些食品疏松多孔结构，还能提高产品的风味成分。

影响蛋白质起泡性的因素有很多，如蛋白质的分子性质、蛋白质的浓度、ph值、温度、糖和盐添加量、脂类及机械处理等。目前通过研究发现对蛋白质进行适度改性可以提高蛋白质的起泡性能，其改性的方法包括高压处理、加热处理、辐照、脉冲辐照、超声处理、酸碱改性、酶处理、化学基团改性等方法。

中国专利cn201510924631.7公开了一种提高水产胶原蛋白乳化稳定性的糖基化方法，该方法是在胶原蛋白体系中加入转谷氨酞胺酶和壳寡糖，利用转谷氨酞胺酶可催化酰胺反应的功能，使得蛋白质中谷氨酸上γ-羟酰胺基与壳寡糖上的氨基之间发生结合，从而生成共价化合物，最终实现了壳寡糖对水产胶原蛋白的糖基化交联修饰。该修饰过程需要在一定温度、ph下反应数小时，同时最后需要高温灭酶，整个过程比较复杂。

因此如何开发一种简单易操作的提高蛋白起泡性和泡沫稳定性的方法，成为亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种利用壳寡糖提高血清白蛋白起泡性和泡沫稳定性的方法，通过调节ph值使壳寡糖与血清白蛋白产生非共价的静电相互作用，从而形成复合物，仅简单复配即能提高蛋白的起泡性，方法简单易操作。

本发明是这样实现的：

本发明目的之一在于提供一种利用壳寡糖提高血清白蛋白起泡性和泡沫稳定性的方法，所述方法为：在血清白蛋白中加入壳寡糖，并在溶剂中混匀，调节ph至5～9即可。

优选地，所述壳寡糖与血清白蛋白的质量比为2：1～8。

优选地，所述加入壳寡糖步骤前，先将血清白蛋白粉末和壳寡糖粉末，分别溶解于溶剂中制备成血清白蛋白溶液和壳寡糖溶液，然后进行混匀，再调节ph。

优选地，所述血清白蛋白的质量浓度为1～10％，壳寡糖的质量浓度为0.25～20％。

优选地，所述溶剂包括去离子水。

优选地，所述血清白蛋白为牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、鸡血清白蛋白中的至少一种。

优选地，所述壳寡糖平均分子量＜3000，脱乙酰度为70～95％。

本发明的目的之二在于提供一种起泡剂，所述起泡剂为血清白蛋白/壳寡糖体系，即为血清白蛋白、壳寡糖溶于溶剂中制备得到的ph为5～9的混合溶液。

优选地，所述壳寡糖与血清白蛋白的质量比为2：1～8。

优选地，所述血清白蛋白/壳寡糖体系中血清白蛋白的质量浓度为1～10％，壳寡糖的质量浓度为0.25～20％。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

1、本发明提供的一种利用壳寡糖提高血清白蛋白起泡性和泡沫稳定性的方法，调节ph值使壳寡糖与血清白蛋白产生非共价的静电相互作用，从而形成壳寡糖/血清白蛋白复合物，仅简单复配即能显著性提高蛋白的起泡性和泡沫稳定性，工艺简单，减少了时间成本。且原料易得：所用原材料壳寡糖是壳聚糖或几丁质的降解产物，廉价易得，具有降低胆固醇、抗氧化、抑菌、加速钙和铁的吸收、抑制肿瘤细胞生长等功能特性，可以广泛应用于食品、生物医学和化学工业等领域。

2、本发明提供的一种起泡剂，采用血清白蛋白/壳寡糖体系，其泡沫起泡性和半衰期(半衰期范围为566.2±38.6s～2296.5±147.7s)显著高于血清白蛋白，因此采用本发明的血清白蛋白/壳寡糖体系可以作为新的起泡剂。

附图说明

图1为应用例中蛋糕比容和弹性的结果图片；

图2为实验例4中的壳寡糖/牛血清白蛋白比例(r)在不同ph下的浊度；

图3为实验例4中的表明cos-bsa间存在静电作用的itc结果；(a)在25℃下，将cos(400μm)滴定到bsa溶液(20μm)中的itc热谱图。(b)使用独立位点结合模型拟合的结合等温线以及获得的热力学参数。

具体实施方式

下面将结合实例对本发明的技术方案进行详细描述。下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为对本发明进行限制。实施例中未注明的具体技术或者条件，均按照本领域内的文献所记载或本领域常规技术手段进行操作。

实施例1

本实施例提供一种利用壳寡糖提高血清白蛋白起泡性和泡沫稳定性的方法，包括如下步骤：

步骤1：称取一定质量的牛血清白蛋白粉末溶解于去离子水中，制备浓度为2％的牛血清白蛋白溶液；

步骤2：称取一定质量的壳寡糖粉末溶解于去离子水中，制备浓度为4％的壳寡糖溶液；

步骤3：将步骤1和步骤2中的牛血清白蛋白溶液和壳寡糖溶液混合，配制壳寡糖/牛血清白蛋白比例为1：4的混合体系，固定体系中牛血清白蛋白的质量浓度为1％，300rpm下混匀15min，采用1m盐酸和氢氧化钠调节ph至5.0，300rpm下持续搅拌30min，得到壳寡糖/牛血清白蛋白混合液。

实施例2-实施例4

实施例2-实施例4除壳寡糖与血清白蛋白的质量比不同外，其余均同实施例1，具体见表1。

实施例5

该实施例除ph改为7.0外，其余均同实施例1，具体见表1。

实施例6-实施例8

实施例6-实施例8除壳寡糖与血清白蛋白的质量比不同外，其余均同实施例5，具体见表1。

实施例9

该实施例除ph改为9.0外，其余均同实施例1，具体见表1。

实施例10-实施例12

实施例10-实施例12除壳寡糖与血清白蛋白的质量比不同外，其余均同实施例9，具体见表1。

实施例13-24

实施例13-24将“牛血清白蛋白”替换为“猪血清白蛋白”，其余设置见表2所示。

实施例25-29

实施例25-29壳寡糖与血清白蛋白的质量比为1：1，ph为7.0，不同的是壳寡糖与血清白蛋白的质量浓度，具体见表3所示。

对比例1

该对比例不添加壳寡糖且ph调至5.0，具体步骤如下：

步骤1：称取一定质量的牛血清白蛋白粉末溶解于去离子水中，制备浓度为1％的血清白蛋白溶液；

步骤2：采用1m盐酸和氢氧化钠调节ph至5.0，300rpm下持续搅拌30min得到牛血清白蛋白待测样品。

对比例2-对比例3

对比例2-3除壳寡糖与血清白蛋白的质量比不同外，其余均同实施例1，具体见表1。

对比例4

该对比例不添加壳寡糖且ph调至7.0，具体步骤如下：

步骤1：称取一定质量的牛血清白蛋白粉末溶解于去离子水中，制备浓度为1％的血清白蛋白溶液；

步骤2：采用1m盐酸和氢氧化钠调节ph至7.0，300rpm下持续搅拌30min得到牛血清白蛋白待测样品。

对比例5-对比例6

对比例5-6除壳寡糖与血清白蛋白的质量比不同外，其余均同实施例5，具体见表1。

对比例7

该对比例不添加壳寡糖且ph调至9.0，具体步骤如下：

步骤1：称取一定质量的牛血清白蛋白粉末溶解于去离子水中，制备浓度为1％的血清白蛋白溶液；

步骤2：采用1m盐酸和氢氧化钠调节ph至9.0，300rpm下持续搅拌30min得到牛血清白蛋白待测样品。

对比例8-对比例9

对比例8-9除壳寡糖与血清白蛋白的质量比不同外，其余均同实施例9，具体见表1。

对比例10

该对比例不添加壳寡糖且ph调至4.0，具体步骤如下：

步骤1：称取一定质量的牛血清白蛋白粉末溶解于去离子水中，制备浓度为1％的血清白蛋白溶液；

步骤2：采用1m盐酸和氢氧化钠调节ph至4.0，300rpm下持续搅拌30min得到牛血清白蛋白待测样品。

对比例11-对比例14

对比例11-对比例14除壳寡糖与血清白蛋白的质量比不同外，其余均同对比例10，具体见表1。

对比例15

该对比例不添加壳寡糖且ph调至10.0，具体步骤如下：

步骤1：称取一定质量的牛血清白蛋白粉末溶解于去离子水中，制备浓度为1％的血清白蛋白溶液；

步骤2：采用1m盐酸和氢氧化钠调节ph至10.0，300rpm下持续搅拌30min得到牛血清白蛋白待测样品。

对比例16-对比例19

对比例16-对比例19除壳寡糖与牛血清白蛋白的质量比不同外，其余均同对比例15，具体见表1。

对比例20-38

对比例20-38将“牛血清白蛋白”替换为“猪血清白蛋白”，其余设置见表2所示。

对比例39-42

对比例39-42壳寡糖与血清白蛋白的质量比为1：1，ph为7.0，不同的是壳寡糖与血清白蛋白的质量浓度，具体见表3所示。

实验例1

统计实施例1-12以及对比例1-19的牛血清白蛋白起泡性和泡沫稳定性，结果如表1所示。

泡沫性能测定的方法为：利用动态泡沫分析仪dfa100来测定上述实施例1-24，以及对比例1-38的发泡性能；将壳寡糖/血清白蛋白混合液进行适度稀释(蛋白终浓度为1％)，取50ml壳寡糖/血清白蛋白混合液或血清白蛋白溶液于高度为250mm，内径为40mm的圆柱形玻璃容器中，使压缩空气(0.3l/min)吹扫其底部的烧结多孔玻璃料(fl4504，孔隙为16-40μm，duran)从而产生泡沫，当发泡至180mm时，停止通入空气。泡沫高度随时间的延长而降低，来测量泡沫的发泡能力和泡沫的稳定性。重复试验3次，取平均值。通常，用泡沫的半衰期(t1/2)来评估整体泡沫的稳定性，其定义为泡沫高度降低至初始值的一半所需的时间。通过最大泡沫体积与用于发泡的气体体积的比率来评价样品的发泡能力。

表1

由表1可知：

1、ph范围为5～9能显著性提高牛血清白蛋白的起泡性和泡沫稳定性

对比例11-14的ph均为4，其半衰期范围为262.3±37.7s～462.6±29.8s；对比例16-19的ph均为10，其半衰期范围为116.5±5.8s～282.9±23.7s；而实施例1-12的ph范围为5～9时，半衰期范围能达到566.2±38.6s～2296.5±147.7s，表明本发明调节ph值为5～9时使壳寡糖与血清白蛋白产生非共价的静电相互作用，从而形成壳寡糖/血清白蛋白复合物，仅简单复配即能显著性提高蛋白的起泡性和泡沫稳定性。

2、壳寡糖与牛血清白蛋白的质量比

在实施例1-4以及对比例2-3中，可知其ph均为5，只是壳寡糖与牛血清白蛋白的质量比不同；对比例2中壳寡糖与牛血清白蛋白的混合比例为1：8，其半衰期为429.5±66.9s、对比例3混合比例为4：1，其半衰期为376.8±21.9s；实施例1-4中壳寡糖与牛血清白蛋白的混合比例为2：1～8，其半衰期范围为682.9±52.6s～1023.9±118.3s；

在实施例5-8以及对比例5-6中，可知其ph均为7，只是壳寡糖与血清白蛋白的质量比不同；对比例5中壳寡糖与牛血清白蛋白的混合比例为1：8，其半衰期为389.4±43.2s、对比例6混合比例为4：1，其半衰期为399.5±38.4s；实施例5-8中壳寡糖与牛血清白蛋白的混合比例为2：1～8，其半衰期范围为1081.9±257.4s～2296.5±147.7s；

在实施例9-12以及对比例8-9中，可知其ph均为9，只是壳寡糖与血清白蛋白的质量比不同；对比例8中壳寡糖与牛血清白蛋白的混合比例为1：8，其半衰期为178.9±17.8s、对比例9混合比例为4：1，其半衰期为138.6±6.7s；实施例9-12中壳寡糖与牛血清白蛋白的混合比例为2：1～8，其半衰期范围为566.2±38.6s～1702.3±106.9s；

以上三组实验结果均表明，当ph值为5～9时，壳寡糖与血清白蛋白的质量比为2：1～8的范围时能进一步提高牛血清白蛋白的起泡性和泡沫稳定性。

3、不加壳寡糖与加壳寡糖的对比

对比例1(不加壳寡糖)与实施例1-4(加壳寡糖)相比其他反应条件两两相同；对比例4(不加壳寡糖)与实施例5-8(加壳寡糖)相比其他反应条件两两相同；对比例7(不加壳寡糖)与实施例9-12(加壳寡糖)相比其他反应条件两两相同；结果表明对比例1、4、7的牛血清白蛋白的起泡性和泡沫稳定性远低于对应的实施例。

实验例2

统计实施例13-24以及对比例20-38的猪血清白蛋白起泡性和泡沫稳定性，结果如表2所示。

表2

由表2可知：

1、ph范围为5～9能显著性提高猪血清白蛋白的起泡性和泡沫稳定性

对比例30-33的ph均为4，其半衰期范围为319.0±25.5s～375.8±23.3s；对比例34-37的ph均为10，其半衰期范围为218.3±8.3s～264.6±24.6s；而实施例13-24的ph范围为5～9时，半衰期范围能达到526.7±25.7s～2784.2±189.7s，表明本发明调节ph值为5～9时使壳寡糖与血清白蛋白产生非共价的静电相互作用，从而形成壳寡糖/血清白蛋白复合物，仅简单复配即能显著性提高蛋白的起泡性和泡沫稳定性。

2、壳寡糖与猪血清白蛋白的质量比

在实施例13-16以及对比例21-22中，其ph均为5，只是壳寡糖与血清白蛋白的质量比不同；对比例21中壳寡糖与猪血清白蛋白的混合比例为1：8，其半衰期为488.3±34.9s、对比例22混合比例为4：1，其半衰期为459.7±85.5s；实施例13-16中壳寡糖与猪血清白蛋白的混合比例为2：1～8，其半衰期范围为688.8±73.5s～1189.4±109.5s；

同理，在实施例17-20以及对比例24-25中，其ph均为7，只是壳寡糖与血清白蛋白的质量比不同；对比例24中壳寡糖与猪血清白蛋白的混合比例为1：8，其半衰期为504.7±55.9s、对比例25混合比例为4：1，其半衰期为485.2±39.4s；实施例17-20中壳寡糖与猪血清白蛋白的混合比例为2：1～8，其半衰期范围为1184.3±103.5s～2784.2±189.7s；

在实施例21-24以及对比例27-28中，其ph均为9，只是壳寡糖与血清白蛋白的质量比不同；对比例27中壳寡糖与猪血清白蛋白的混合比例为1：8，其半衰期为255.8±15.9s、对比例28混合比例为4：1，其半衰期为283.9±21.4s；实施例21-24中壳寡糖与猪血清白蛋白的混合比例为2：1～8，其半衰期范围为526.7±25.7s～1854.3±137.5s；

以上三组实验结果均表明，当ph值为5～9时，壳寡糖与血清白蛋白的质量比为2：1～8的范围时能进一步提高蛋白的起泡性和泡沫稳定性。

3、不加壳寡糖与加壳寡糖的对比

对比例20(不加壳寡糖)与实施例13-16(加壳寡糖)相比其他反应条件两两相同；对比例23(不加壳寡糖)与实施例17-20(加壳寡糖)相比其他反应条件两两相同；对比例26(不加壳寡糖)与实施例21-24(加壳寡糖)相比其他反应条件两两相同；结果表明对比例20、23、26的蛋白的起泡性和泡沫稳定性远低于对应的实施例。

实验例3

由表1-2可知，当壳寡糖与血清白蛋白的质量比为1：1，ph为7时血清白蛋白起泡性和泡沫稳定性最优。在最优条件下探索合适的血清白蛋白、壳寡糖的质量浓度范围，结果如表3所示。

泡沫性能测定的方法为：由于实验例3中样品浓度较高，可通过搅打法来测定上述实施例25-29，以及对比例39-42的发泡性能；在室温下将所有样品(20ml)用匀浆器(t18，ika)以8000rpm的速度发泡2分钟。然后，立即将泡沫倒入100ml量筒中。通过比较2分钟时的泡沫体积与样品的初始液体体积来评估起泡性(fa)。通过比较60分钟时的泡沫体积与样品的初始泡沫体积来测量泡沫稳定性(fs)。

其中v2是2分钟时的泡沫体积，v60是60分钟时的泡沫体积。

表3

由表3可知，血清白蛋白的质量浓度优选为1～10％，壳寡糖的质量浓度优选为0.25～20％。

实验例4

1、配制不同比例(10：1、4：1、2：1、1：1、1：10)的cos/bsa混合体系，固定bsa的浓度为0.1％。使用紫外/可见分光光度计(tu-1900型，北京普析通用仪器有限责任公司)在600nm波长下测定蛋白及蛋白混合物在不同ph条件下的浊度，控制实验温度25.0±0.2℃。重复实验3次。浊度τ(λ＝600nm)的计算公式如下：

τ＝(-1/l)ln(i/i0)

其中l为光路长，i0为入射光强，i为透射光强，i/i0为透过率t(％)。

浊度结果如图2所示，表明在ph4.0-7.0范围内，cos与bsa存在着强烈的相互吸引而导致分子聚集。

2、使用autoitc200(英国，malvern)等温滴定量热仪测定cos-bsa混合物在ph5.5时的热力学参数。利用磷酸盐缓冲液(ph5.5，终浓度为10mm)稀释储备溶液，制备bsa(20μm，mw＝66kda)和cos(400μm，mw＝788da)溶液，并在缓冲液中透析过夜。样品池体积200μl，进样针体积40μl，每次进样量2μl，总滴定次数20次，进样时间4s，滴定间隔150s，搅拌速率750rmp，反应温度25℃。样品池中为bsa，进样针中为cos。使用microcaloriginitc分析软件中的单点结合模型进一步拟合实验数据，给出k(结合常数)，n(结合化学计量数)，δh(焓值)和δs(熵值)热力学参数。

itc数据如图3所示，用cos滴定bsa的过程出现了明显的放热峰，说明在ph＝5.5时，cos和bsa之间出现了相互作用，并且在复合过程中放出了热量(放热过程)。δh﹤0和δs>0表明相互作用是由静电引力引起的。

综上，浊度数据和itc数据说明cos-bsa间存在静电作用。

应用例

通过制作天使蛋糕，测量泡沫体积、蛋糕的比容和质构来检验起泡性能，具体方案如下：

1、实验原料：鸡蛋清、牛血清白蛋白、壳寡糖、白砂糖、低筋面粉。

2、天使蛋糕制作流程：将鸡蛋清、牛血清白蛋白和壳寡糖混合液用中速搅打至出现大的鱼眼状泡沫，加入三分之一的白砂糖，中速搅打至泡沫变小变均匀，加入三分之一的白砂糖，中速搅打至蛋白表面出现纹路，加入剩余三分之一的白砂糖，高速搅打至硬性发泡，过筛加入面粉，调糊，入模，烘烤(上下火170℃，25min)，冷却，脱模。

3、测量参数

(1)泡沫体积

用量筒量取高速搅打至硬性发泡的泡沫。

(2)比容

蛋糕比容是用小米置换法进行测量的。在容器中倒满小米，然后将小米倒出，放入蛋糕，然后用小米边放边摇填满容器，用量筒量取剩余的小米体积，即为蛋糕所占体积。蛋糕比容(ml/g)＝蛋糕体积/蛋糕质量。

(3)质构

将蛋糕切成相同的厚度，确保表面和底面的平整，剔除边缘的硬的外壳，每个样品大概为长、宽、高分别为2cm、2cm、2cm。采用p/36r探头进行全质构分析，分析指标包括硬度、弹性、咀嚼性、粘结性。测定参数为：测定前速度1mm/s，测定速度1mm/s，测后速度1mm/s，应变位移50％，引发力5g，引发类型为自动。

4、实验分组如下：

应用例1：鸡蛋清332.5g、8.2％牛血清白蛋白溶液47.5g、壳寡糖3.895g、白砂糖120g、低筋面粉160g。

应用例2：除实验原料为鸡蛋清285g、8.2％牛血清白蛋白溶液95g、壳寡糖7.79g、白砂糖120g、低筋面粉160g外，其余同应用例1。

应用例3：除实验原料为鸡蛋清190g、8.2％牛血清白蛋白溶液190g、壳寡糖15.58g、白砂糖120g、低筋面粉160g外，其余同应用例1。

应用对比例1：除实验原料为鸡蛋清380g、白砂糖120g、低筋面粉160g外，其余同应用例1。

应用对比例2：除实验原料为鸡蛋清285g、8.2％牛血清白蛋白溶液95g、白砂糖120g、低筋面粉160g外，其余同应用例1。

应用对比例3：除实验原料为鸡蛋清380g、壳寡糖7.79g、白砂糖120g、低筋面粉160g外，其余同应用例1。

5、实验结果：应用例1-3，以及应用对比例1-3的天使蛋糕的比容和质构数据如表4所示。

表4

由表4可知，将应用例1、2和3相比，发现随着牛血清白蛋白和壳寡糖含量的增加，泡沫体积、蛋糕比容和弹性呈现先上升后下降的趋势，而硬度、粘性和咀嚼性呈现先下降后上升的趋势，由此可知应用例2的起泡性、泡沫稳定性、蛋糕比容和质构均较好。

将应用例2与应用对比例1、2和3相比，发现应用例2的泡沫体积、蛋糕比容和弹性显著增加，硬度、粘性和咀嚼性显著降低。这说明牛血清白蛋白与壳寡糖对体系的起泡性、泡沫稳定性、蛋糕比容和质构等特性具有协同增强性，且在天使蛋糕中添加牛血清白蛋白和壳寡糖之后蛋糕口感更为松软爽口。

所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。