肿瘤选择性联合疗法的制作方法
本申请是申请号为201480026213.x的中国专利申请的分案申请，原申请是2014年4月8日提交的pct国际申请pct/us2014/033400于2015年11月9日进入中国国家阶段的申请。
相关申请
本申请根据35u.s.c.§119(e)要求于2013年4月9日提交的美国临时专利申请no.61/810,008的优先权，其通过引用并入本文。
政府支持
本发明是在美国国立卫生研究院授予的协议号ca102792的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定权利。
本发明涉及肿瘤选择性联合疗法。
背景技术：
癌症治疗中的一个基本挑战是发现对癌细胞具有毒性但是对健康细胞无毒性的化合物。癌症的一个显著特征是迅速且不受限制的细胞分裂。绝大部分传统化学治疗剂来靶向迅速分裂的细胞，通过破坏细胞周期造成细胞死亡。由于一些健康组织需要将细胞分裂作为其功能的一部分，所以抗增殖细胞毒素也杀伤健康细胞，导致严重的剂量限制性副作用。因此，必须鉴定更好地区分健康细胞和癌细胞的新治疗方法和新细胞靶标。所述靶标可仅存在于一小部分癌症患者中，因此允许治疗癌症的个体化策略。
含醌分子通常是细胞毒性的并且通过两种机制之一来伤害细胞。许多醌类是共轭加成受体和易于烷基化的亲核物质，例如dna和半胱氨酸残基。醌类也是1-电子还原酶(如细胞色素p450、细胞色素b5、黄嘌呤氧化酶和谷胱甘肽还原酶)的底物。这些酶对醌类的还原产生高反应性半醌，其可以直接破坏生物分子，或者可以被溶解的氧氧化，从而导致形成超氧化物阴离子基和母体醌的等同物。因此，醌类的1-电子还原可催化地产生损害细胞的活性氧物质(reactiveoxygenspecies，ros)。
nad(p)h醌氧化还原酶(nqo1，dt心肌黄酶)是一种fad依赖性2-电子还原酶，其主要功能是保护细胞免受细胞毒素(尤其是醌类)作用。尽管一般鉴定nqo1是胞质蛋白质，但是已经在亚细胞区室(如线粒体和细胞核)中鉴定了nqo1。通过在2-电子过程中还原醌类，nqo1绕过毒性半醌并且形成氢醌，其对于氧通常没有反应性。然后氢醌与分子(如谷胱甘肽、葡萄糖或硫酸盐/酯)缀合并且被细胞排出。但是，一些含氢醌分子不稳定并且通过2个1-电子氧化与氧反应回醌，产生ros。不能基于分子结构预测氢醌对于空气氧化的相对稳定性，并且其不与还原电势相关。
nqo1作为用于治疗癌症的潜在靶标已经吸引了许多注意力，因为已经发现相对于相邻健康组织的肿瘤中其经常以高得多的水平表达，特别是在肺癌的情况下。此外，在肿瘤进展中nqo1活性似乎提高。除了肺、乳腺和结肠组织外，相对较少报道正常组织中nqo1水平的数据。尽管在骨髓和肝细胞——经常被化学治疗剂损害的两种组织——中报道了低的nqo1水平，但是在胃和肾细胞中注意到了相对高的nqo1水平。
发现被nqo1活化而非失活的毒素的前景已经吸引了研究人员许多年。这样的分子可将这种正常的细胞保护酶转变成对细胞不利。已经发现了适于该描述的两个一般类型的分子：dna烷化剂(其亲电子性在生物还原后提高)，以及氧化还原循环分子(其在还原后催化地产生ros)。这样的dna烷化剂的实例包括丝裂霉素c、eo9和medzq，这样的ros产生分子的实例包括β-拉帕醌(β-lap)和链黑菌素，其细胞毒性机制分别涉及nqo1介导的生物还原。这些分子类型几乎仅由含醌化合物构成。
递送到细胞的β-lap的浓度可诱导不同形式的细胞死亡，较低浓度诱导凋亡，而较高浓度起始钙依赖性程序性坏死(necroptosis)。除了rbc中的ros产生外，β-lap的差水溶性使得必须使用羟丙基-β-环糊精(hpβcd)作为溶解度助剂，其高浓度造成体外rbc溶血。为了解决化合物不稳定性和损害rbc的问题，boothman和gao的小组已经设计了β-lap的胶束制剂，其证明了在鼠肿瘤模型中极大提高的pk性质和功效(blanco，boothman，gao等，cancerres.2010，70，3896)。
尽管个体化医药策略已经产生了救命的抗癌药，但是其仅影响一小部分癌症患者。由于大量实体瘤中nqo1的水平极大升高，所以成功利用nqo1水平的治疗可能使全部癌症患者中的很大一部分受益。因此，需要利用升高的nqo1水平并且可以选择性地抑制或杀伤癌细胞的新治疗方法以使更多的癌症患者受益。
技术实现要素：
本发明提供了治疗癌症和癌症肿瘤细胞(如具有升高的nqo1水平的肿瘤细胞)的化合物、组合物和方法。本发明还提供了新的联合疗法，其包括施用与dna修复抑制剂组合的nqo1生物可活化药物来提供肿瘤选择性疗法。在一个实施方案中，对碱基切除修复的抑制协同地增强用于癌症(如胰腺癌)的肿瘤选择性疗法的β-拉帕醌介导的细胞死亡。
nqo1生物可活化药物包括为nqo1底物的dnq类似物和前药，以及β-拉帕醌及其前药或类似物。这些药物使得dna修复抑制剂成为肿瘤选择性。这样的dna修复抑制剂可包括dna碱基切除(be)、单链断裂(ssb)和双链断裂(dsb)修复的抑制剂。
1.nqo1生物可活化药物可用于以肿瘤选择性方式对抗在碱基切除修复(ber)中具有缺陷的癌症。数据表明，在已知具有升高的nqo1水平的特定癌症(即，乳腺癌)中，ber过程缺陷(例如，xrcc1)。例如，xrcc1敲减(已经发现其水平在乳腺癌中选择性缺陷)在响应于nqo1生物可活化药物时表现出增强的致死性。xrcc1敲减和其他ber缺陷可导致dna单链断裂和ap位点增加。通过nqo1生物可活化药物治疗以肿瘤选择性方式引起的延长的ap位点、ssb或dna双链断裂(dsb)导致肿瘤特异性致死性以及，与明显的肿瘤选择性、nqo1依赖性代谢变化的协同作用。ogg1缺陷是例外情况，因为其敲减使得细胞抗nqo1生物可活化药物。这些数据表明，初始dna损伤是8-氧代鸟嘌呤碱基损伤，这是抑制ber过程之核心的未经报道的发现。还示出在胰腺癌细胞中以nqo1依赖性方式形成明显水平的8-氧代鸟嘌呤(8-og)。
2.nqo1生物可活化药物可以与聚(adp-核糖基)聚合酶i(parp1)抑制剂(如本文所述的parp1抑制剂)组合以肿瘤选择性方式使用。parp1抑制剂缺少肿瘤选择性，而nqo1生物可活化药物赋予了这种选择性。关于nqo1生物可活化药物的所有目前已公开数据主张，parp1超活化是肿瘤选择性致死性所需要的；因此将不指示抑制parp1。在长期存活响应中并非如此，因为抑制parp1阻止了ssb和/或dsb的修复。相对于单独通过nqo1生物可活化药物引起的程序化坏死，细胞以不同的经典凋亡机制死亡。
在过表达nqo1的多种癌症中，测试的所有已知parp1抑制剂表现出与nqo1生物可活化药物的协同作用。细胞通过活化胱天蛋白酶而死亡，而不是经历程序化坏死。然而，在每一种情况下均观察到了肿瘤选择性致死性。获得的数据包括无毒剂量的parp1抑制剂与无毒剂量的nqo1生物可活化药物的协同作用。β-lap和dnq类似物的数据强烈支持该观察结果。另外，双香豆素阻止nqo1生物可活化药物和parp1抑制剂之间的协同作用，并且在nqo1缺陷细胞中未注意到协同作用，因为这些细胞缺乏因缺少nqo1介导的无效氧化还原循环所造成的dna损伤。
3.ap位点修饰药物(例如，甲氧胺(methoxyamine)、meox)可用于与nqo1生物可活化药物组合以用于nqo1依赖性肿瘤选择性杀伤率。nqo1生物可活化药物主要造成dna碱基损伤(例如，8-氧代鸟嘌呤(8-og))，而ogg1(检测8-氧代鸟嘌呤的糖基化酶)缺失导致对这些药物的抗性。当8-氧代鸟嘌呤被修复时，形成高水平的ap位点。尽管parp1可以结合ap位点，但是不知道parp1可以结合被甲氧胺或其他ap修饰药物修饰的ap位点。我们证明，meox增强nqo1生物可活化药物，反过来nqo1生物可活化药物使得meox具有肿瘤选择性。获得的数据包括无毒剂量的meox增强无毒剂量的nqo1生物可活化药物，并且meox增强atp的损失，并且更重要的是显著阻止毒性或无毒剂量的nqo1生物可活化药物之后的atp恢复。
对于上文和下文描述的所有三种方法，低得多剂量的nqo1生物可活化药物可用在联合疗法的所有三种形式中，避免β-拉帕醌、其前药、类似物、尤其是dnq类似物之剂量相关的毒性(即，高铁血红蛋白血症)。
本发明还提供了用于预测和确定nqo1生物可活化药物和/或其与碱基切除修复(ber)酶抑制剂、parp1抑制剂、ap碱基修饰药物或其组合之组合的功效的方法。所述方法可包括分析和监测细胞或对象中nqo1：过氧化氢酶的比以确定细胞或患者或者对象的组织是否具有相对高、中或低的nqo1：过氧化氢酶比，从而能够确定活性剂或活性剂组合的可能功效。
本发明的另一个方面提供了药物组合物，其包含至少一种β-拉帕醌或其衍生物或者dnq药物(如式(i)的化合物)，以及可药用稀释剂、载体或赋形剂，任选地与碱基切除修复(ber)酶抑制剂parp1抑制剂或ap碱基修饰药物(例如，meox)组合。本发明还提供了这些化合物及其组合用于制备药物组合物的用途，以及随后所述组合物用于治疗患者或对象的用途。患者或对象可以是哺乳动物，包括人。
本发明的另一个方面提供了治疗、杀伤具有升高的nqo1水平的肿瘤细胞或具有升高的nqo1水平之细胞的肿瘤或者抑制其生长的方法，其中至少一种肿瘤细胞暴露于治疗有效量的化合物、其可药用盐或溶剂合物、化合物的组合或其可药用组合物。可以同时或相继地向有治疗需要的细胞或患者(包括已知在dna碱基切除、单链或dna双链断裂修复中具有缺陷的脆弱性肿瘤)施用化合物，其中至少同时或在碱基切除修复(ber)酶抑制剂、parp1抑制剂或ap碱基修饰药物之后施用醌化合物。
因此，本发明提供了与碱基切除修复(ber)酶抑制剂或本文所述其他活性剂组合的nqo1生物可活化药物用于杀伤体外癌细胞或具有癌细胞或癌症肿瘤之患者中的癌细胞或者抑制这些癌细胞生长的用途。本发明还提供了与碱基切除修复(ber)酶抑制剂或本文所述其他活性剂组合的nqo1生物可活化药物用于制备用于杀伤体外癌细胞或具有癌细胞或癌症肿瘤之患者中的癌细胞或者抑制这些癌细胞生长的药剂的用途，其中所述药剂包含有效致死量或抑制量的nqo1生物可活化药物以及碱基切除修复(ber)酶抑制剂或本文所述其他活性剂。在另一些实施方案中，一种药剂可以包含nqo1生物可活化药物，并且第二种药剂可包含碱基切除修复(ber)酶抑制剂或本文所述其他活性剂。
附图说明
以下附图形成了说明书的一部分，并且被包括以进一步证明本发明的某些实施方案或多个方面。在一些情况下，可以参照附图并结合本文给出的详述描述来最好地理解本发明的实施方案。描述和附图可以突出本发明的某个特定实施例或某个方面。但是，本领域技术人员将理解，部分实施例或方面可与本发明的其他实施例或方面组合使用。
图1.相比于相关正常组织的胰腺肿瘤中nqo1和过氧化氢酶的表达。(a，b)分析来自59位胰腺患者的匹配的肿瘤和相关正常组织的nqo1(a)和过氧化氢酶(b)水平，示出相比于肿瘤组织，正常组织中过氧化氢酶过表达。(c，f)来自349份患者样品和85个胰腺癌细胞系的nqo1水平。(d，g)在(c，f)中监测的过氧化氢酶水平。(e，h)nqo1/过氧化氢酶的比可能是nqo1生物可活化药物之功效的主要决定因素。对于(c-h)，n＝232份患者样品。
图2.nqo1：对比于正常组织，胰腺癌组织中nqo1：过氧化氢酶的比是nqo1生物可活化药物β-lap和dnq之功效的主要决定因素。(a)胰腺癌细胞表达升高的nqo1，但是较低的过氧化氢酶水平。β-lap的代谢导致产生大量h2o2，其容易压倒低的肿瘤过氧化氢酶水平。(b)相比之下，正常胰腺组织表达低nqo1和丰富的过氧化氢酶水平，因此被保护免受nqo1生物可活化药物作用。患者样品酶测定已经证实了这些nqo1：过氧化氢酶的比。
图3.shrna-nqo1敲减对nqo1的功能抑制保护在β-lap暴露后免于细胞死亡。(a)β-lap氧化还原循环的机制；dnq及其衍生物可以根据类似的机制。(b)miapaca-2亲本、敲减(17-1、17-3和17-7)和非沉默(ns、miapaca-2shscr)克隆中的nqo1蛋白水平和酶活性。(c)在指定剂量下用β-lap或β-lap加双香豆素(dic)暴露2小时，miapaca-2亲本和nqo1敲减细胞的长期相对存活测定。(d)与拯救(rescue)miapaca-2ns克隆所需的剂量相比，通过低剂量dic(μm，2h)显著拯救了暴露于β-lap(6μm，2h)的nqo1敲减克隆(17-1、17-3、17-7)的存活(＊＊＊p＜0.001)。(e)用于miapaca-2敲减克隆和不同胰腺癌细胞系(bxpc3、capan1、aspc1、hs766t、capan2和cfpac1)的ld50的β-lap剂量(r2＝0.9053)。(f)具有或不具有双香豆素(dic，50μm)或bapta-am(5μm，1h)处理的多种胰腺癌细胞中β-lap的致死性。
图4.nqo1shrna敲减使β-lap诱导的dna损伤显著减少。(a)使ns和shrna-nqo1敲减miapaca-2克隆(17-1、17-3、17-7和ns)暴露于β-lap+50μmdic，并且使用彗星实验评估dna损伤。还使细胞暴露于2mmh2o22小时作为阳性对照。(b)使用imagej软件(a.u.，任意单位)测量彗星尾长度(＊＊＊，p＜0.001)。(c)β-lap处理在miapaca-2胰腺癌细胞中造成大量8-氧代鸟嘌呤(8-og)碱基损伤。因此，β-lap造成ssb和大量碱基损伤。
图5.β-lap或dnq处理后的代谢变化。用β-lap(6μm)(a)、dnq或dnq衍生物(dnq87)(c，d)+/-dic(50μm)处理miapaca-2细胞并且监测存活。还评估暴露于β-lap+/-dic的miapaca-2细胞在指定时间的atp(b)、葡萄糖消耗(e)和培养基中乳酸产生(f)的变化。
图6.sirna介导的ogg1糖基化酶的敲减赋予β-lap处理的胰腺癌细胞对β-拉帕醌有抗性。示出了两个单独室验。使mia-paca2胰腺癌细胞暴露于sirna乱序(sirna-scrambled，ns)或ogg1特异性的sirna(siogg1)24小时，然后以指定剂量用β-拉帕醌处理细胞2小时。然后通过集落形成能力测定进行测量并且用所使用的β-拉帕醌剂量绘图，如(a)和(b)中所示。
图7.nqo1生物可活化药物以肿瘤特异性方式造成ssb和碱基损伤，因此其可用于使dna修复抑制剂具有肿瘤选择性。
图8.parp1抑制剂与nqo1生物可活化药物的协同作用。(a-d)如指出的，将miapaca-2细胞与多种parp1抑制剂(10μm)，然后与脱氧尼博醌(deoxynyboquinone，dnq)预孵育，和抑制剂孵育2小时。(e-h)ag014699增强β-lap。然后使用7天dna测定评估相对存活(huang等，cancerres.，2012，72(12)，3038-3047)(＊＊＊，p＜0.001)。
图9.甲氧胺(meox)增强β-lap诱导的nqo1驱动的致死性。将miapaca-2细胞用指定剂量的β-lap+/-meox(12mm)或单独β-lap处理2小时。终点检查：(a)集落形成测定示出meox+β-lap的协同作用；(b)meox处理修饰miapaca-2细胞中由β-lap诱导的ap位点；(c)meox增强β-lap诱导的atp损失；(d)在亚致死剂量的β-lap之后，meox阻断atp恢复；(e)β-lap+meox共处理增强γh2ax焦点(foci)形成。meox+亚致死剂量(2μm)β-lap与致死剂量(6μm)β-lap等效；以及(f)meox(6mm)+β-lap(2μm)以nqo1依赖性方式诱导比单独β-lap(4μm)显著更高的凋亡(tunel+细胞)。双香豆素(dic，50μm，2h)阻断协同作用。
图10β-拉帕醌对miapaca-2肿瘤异种移植物具有显著的抗肿瘤功效。(a)具有原位miapaca-2肿瘤的小鼠的体重变化。(b)(a)中描述的胰腺抗肿瘤功效实验的kaplan-meier存活。进行对数秩分析以比较静脉内(iv)20或30mg/kghpβ-cd相比于β-lap-hpβ-cd的存活曲线(＊＊＊p＜0.0001)。结果是来自三个类似实验的组合的存活数据。(c)在用静脉内20或30mg/kghpβ-cd或β-lap-hpβ-cd(arq761)处理之前和之后，具有脾植入的胰腺癌之小鼠的生物发光(bli)图像。(d)胰腺肿瘤负荷的量化。在用静脉内20或30mg/kghpβ-cd或β-lap-hpβ-cd治疗前和治疗后12天，测定bli(光子/秒)。结果为平均值+se(n＝5)。进行学生t检验(＊＊＊p＜0.005)以比较静脉内20或30mg/kghpβ-cd相比于β-lap-hpβ-cd。v，载剂(hpβ-cd)。
图11.根据本发明多个实施方案的某些dnq化合物的式子。当n＝1-30，n可以特定的是1至30的任何整数，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
图12.根据多个实施方案的特定dnq化合物的实例。
图13.dnq87(ib-dnq)以相比于β-拉帕醌低得多的剂量以及与母体dnq化合物相等的剂量作用。其以nqo1依赖性方式有效抵抗乳腺癌细胞以及三阴性乳腺癌细胞(a-f，多种细胞类型)。
图14.dnq87的功效以nqo1依赖性方式增加(多种浓度的ib-dnq暴露，a-h)。
图15.ib-dnq细胞毒性：“非胱天蛋白酶介导的细胞死亡”。dnq87造成细胞死亡，其可以被双香豆素、过氧化氢酶和bapta-am(一种钙螯合剂)阻断(a)，以降序并且符合提出的由nqo1生物可活化药物造成的细胞死亡的途径(b)。(c)通过par-parp1形成来测量由dnq87暴露造成的parp1超活化，其通过μ-钙调蛋白介导的p53切割(c)和细胞死亡期间parp1对～60kda蛋白水解片段的非典型切割(d)来突出。
图16.通过γ-h2ax、ser1981处atm的磷酸化和位点thr1892处的dna-pkcs的磷酸化(a-f)的监测，dnq87以延迟的方式造成dna损伤(dna双链断裂)。
图17.ssb-parp1-dsb时间顺序。在具有或不具有双香豆素(dic，50μm)的情况下，使mcf-7乳腺癌细胞暴露于dnq87(ib-dnq)，并且在指定的特定位点监测存活(a)或par-parp1(par)形成的时间序列，以及h2ax(g-h2ax)、atm是否磷酸化，并且使用α微管蛋白水平来监测上样。
图18.与过表达nqo1的mcf-7人乳腺癌细胞中使用双香豆素模拟正常组织相比，正常组织中使用双香豆素模拟低水平的nqo1的dnq87治疗窗(时间点为30分钟、60分钟、2小时、24小时、48小时和72小时)。
图19.暴露于nqo1生物可活化药物造成过量的8-氧代鸟嘌呤水平。a)β-拉帕醌暴露造成大量形成8-氧代鸟嘌呤。b，c)示出了两个独立的实验。使mia-paca2胰腺癌细胞暴露于sirna乱序(ns)或ogg1特异性的sirna(siogg1)24小时，然后用β-拉帕醌以指定的剂量处理细胞2小时。然后通过集落形成能力测定来测量存活并且用所使用的β-拉帕醌剂量绘图。
图20.致死剂量相比于亚致死剂量的甲氧胺(如指出的，meox或mx)的测定；a，meox和β-拉帕醌；b，meox；c，meox。
图21.甲氧胺(meox)(a、b)或xrcc1shrna敲减介导的ber的抑制增强了β-lap的致死效应，如使用集落形成能力测定而测量(c)；(d)示出了存活分数。
图22.ber抑制剂和β-lap的联合处理增加dna损伤(a)和通过tunel测定监测的细胞死亡(b)，符合程序化坏死。
图23.抑制ber途径增强了β-lap诱导的atp损失并且阻抑其恢复(a至d)。
图24.在致死(6μm或4μm)或亚致死(3μm或2.5μm)β-lap处理后，meox阻抑atp损失的恢复。
图25.丙酮酸甲酯(mp)阻抑β-拉帕醌诱导的细胞死亡；(a)相对atp水平；(b)相对细胞存活。
图26.meox减弱丙酮酸甲酯保护细胞的作用；(a)β-lap对照和添加mp；(b)β-lap和meox，以及(c)β-lap和mp或者β-lap和meox。
图27.甲氧胺(meox)加速parp1超活化诱导的nad+/atp损失，进一步加速β-拉帕醌暴露的miapaca-2胰腺细胞中nqo1依赖性过程的o2消耗。a.β-拉帕醌增加miapaca2细胞中的耗氧率(ocr)。致死剂量的β-lap造成明显的ocr峰(spike)，随后损失所有的代谢能力。亚致死剂量的β-lap造成随着时间ocr始终升高。这两种反应都是nqo1介导的。b.与亚致死剂量的β-lap组合添加meox增加了ocr率，其类似于致死剂量的β-拉帕醌(4μm)，推测是由于parp1超活化造成的nad+和atp的损失。
图28.nqo1生物可活化药物的处理阻抑miapaca2细胞中的糖酵解。葡萄糖利用(a)和乳酸产生(b)二者均被阻抑。
图29.用12mm甲氧胺(meox)和dnq87共处理a549nsclc细胞2小时并且测量相对存活(如huang等，cancerres.，2012中)。
图30.parp1的抑制增强了nqo1生物可活化药物的致死性；(a)azd2281；(b)ag14361；(c)ag-014699；(d)bsi-201。
图31.a549nsclc细胞中单独parp1抑制剂的非致死剂量的测定；(a)azd-2281；(b)ag14361；(c)ag014699；(d)bsi-201；(e)abt-888；(f)ino-1001。
图32.parp1抑制剂ag014699(rucaparib)的数据；(a)ag014699；(b)β-lap和ag014699；(c)ag014699；(d)β-lap和ag014699。
图33.ag014699增强a549nsclc细胞中β-拉帕醌的nqo1依赖性致死性。a.对照以证明单独药物对brca1-/-capan-1细胞的合成致死性(syntheticlethality)，而其他brac1野生型癌细胞(a549和miapaca-2细胞)完全抗parp1抑制剂。b.证明ag014699抑制响应于β-lap的parp1超活化。c.与β-lap组合的ag014699的协同致死性，其受到nqo1抑制剂双香豆素的阻止。d.与β-lap组合的ag014699的剂量响应，其通过添加双香豆素逆转。
图34.parp1敲减增加三阴性mda-mb-231(231)乳腺癌细胞中β-拉帕醌的致死性；(a)231nqo1+/-；(b)ns-shrna和parp1-shrna；(c)md-mba-231的存活分数；(d)md-mba-231nqo1+的存活分数。
图35.mcf-7乳腺癌细胞中的parp1敲减也增加β-lap致死性；(a)5μm的β-lap；(b)mcf-7细胞的相对存活。
图36.用无毒剂量的β-lap+无毒剂量的ag014699处理的nqo1+h596nsclc细胞示出切割的胱天蛋白酶-3形式的凋亡证据。
图37.parp1shrna稳定敲减增加致死性(a)，但是由于parp1超活化的阻抑(损失)而阻抑atp损失(b)。
图38.β-lap诱导的atp损失被parp1shrna稳定敲减或添加ag014699所阻止；(a)mcf-7；(b)mcf-7-parp1-shrna。
图39示出了miapaca-2中的研究以及dnq与parp1抑制剂组合的数据(a至d)。
图40至42示出了miapaca-2中的研究以及一些dnq与parp1抑制剂组合的数据。
图43.体内dc3胶束的药物代谢动力学分析和靶标评估；(a)dc3和β-lap；(b)dc3和β-lap；(c)空白胶束与dc3的比较；(d)相对atp水平。
图44.体内dnq衍生物par-parp1的形成。
图45.用dnq-87和parp抑制剂(ag014699)处理的a549。
图46.通过联合处理的dna损伤。(a)将a549nsclc细胞用rucaparib(ag014699)预处理或不用其预处理，然后在具有或不具有相同parp1抑制剂的情况下，在指定浓度下暴露于无毒剂量的β-拉帕醌(3μm)。细胞还暴露于致死剂量的β-拉帕醌(8μm)。然后通过中性彗星实验分析细胞，并且dna损伤绘制在(b)中。(b)数据示出在parp1抑制剂的存在下，暴露于亚致死剂量的β-lap的细胞中的dna损伤明显增加，相当与致死剂量的β-拉帕醌所产生的dna损伤。
图47.乳腺癌肿瘤中nqo1/过氧化氢酶的比升高，但是在相关正常组织中较低；(a)a-f患者样品计数和表达数据；(b)nqo1表达。
图48.与相关正常组织相比非小细胞肺癌(nsclc)中nqo1水平也升高(n＝105)(a)，而过氧化氢酶在正常组织中升高但在nsclc肿瘤中发现其为较低水平(b)。(c)至(e)表达和样品计数。
图49.人nsclc患者样品中，与正常组织相比肿瘤中nqo1/过氧化氢酶的比。
具体实施方式
肿瘤选择性是对抗癌症的有效化学治疗策略的挑战。尽管目前开发的特定利用大部分实体瘤中升高水平的nad(p)h：醌氧化还原酶1(nqo1)的β-拉帕醌代表了新的化学治疗手段，但是需要通过多种机制(如程序化坏死)以增高的效力来杀伤的额外的疗法。与β-拉帕醌相比，脱氧尼博醌(dnq)以极大提高(20至100倍)的效力以nqo1依赖性方式杀伤广谱的癌细胞类型(即，胰腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌)。dnq致死性依赖于nqo1依赖性无效的氧化还原循环，使用氧并且产生广泛的活性氧物质(ros)，特别是超氧化物和过氧化氢。升高的ros水平造成广泛的dna损伤和parp-1超活化，其继而导致严重的nad+/atp损耗，这刺激对于这类nqo1“生物活化”药物(例如，β-拉帕醌和dnq)独特的钙依赖性程序化坏死细胞死亡响应。出人意料地发现，nqo1生物可活化药物和dna修复抑制剂的组合提供了协同和肿瘤选择性疗法。
到2020年，胰腺癌将是美国癌症相关死亡中的第二大原因，其中5年存活＜6％。当前的标准护理疗法提供了很低的选择性和高的毒性。因此迫切需要新的肿瘤选择性方法。近90％的胰腺癌具有升高水平(10至40倍)的nqo1，而且我们最近发现，β-拉帕醌(β-lap)以nqo1依赖性方式有效对抗胰腺癌(li等，clin.cahcerres.，2011)。与大部分醌类似，β-lap被nqo1还原，但是与大部分醌不同的是，其氢醌形式不稳定并且以无效形式自发氧化还原循环，其中在2分钟内1摩尔的β-lap产生约120摩尔的超氧化物，主要诱导dna碱基和单链断裂(ssb)损伤。这导致parp1超活化和程序化坏死，不依赖于以下来杀伤nqo1+癌细胞：i，p53；ii，细胞周期；iii，所有已知的致癌驱动物；以及iv，凋亡/抗凋亡基因表达(例如，bax、bak、bcl2)。因此，“nqo1生物可活化药物”是用于提高癌症疗法(包括用于胰腺癌和其他实体瘤癌症的疗法)之功效的肿瘤选择性且优异的候选物。
为了提高其功效，检查了添加ap位点修饰药物和碱基切除修复(ber)抑制剂甲氧胺(meox)以及β-lap对于过表达nqo1的胰腺癌细胞的协同作用。meox+β-lap的协同作用导致亚致死剂量β-lap的致死性增加；仅在肿瘤细胞中提高dna损伤形成；atp水平明显损失；以及对糖酵解的明显阻抑。因此，meox增强β-lap的parp1超活化和协同的细胞杀伤。机理上，数据表明parp1检测meox-ap修饰位点或ssb，允许parp1超活化和协同的细胞死亡。因为meox是非毒性剂，所以meox和第二试剂的组合可以提供用于癌症(特备是胰腺癌和其他过表达nqo1的实体癌)治疗的疗法。
治疗性醌类
dnq是强效化学治疗剂，其具有宽的治疗窗，这保持了用于对许多难以治疗的癌症(包括胰腺癌和非小细胞肺癌)的靶向疗法的极大前景。尽管在癌症化学治疗中有了相当大的进步，但是大部分癌症化学治疗缺少选择性依然是主要的限制因素。大部分实体瘤(特别是非小细胞肺癌细胞(nsclc)、前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌)中发现的升高的nad(p)h：醌氧化还原酶-1(nqo1，dt-心肌黄酶，ec1.6.99.2)水平提供了本文所述治疗性治疗的靶标。nqo1是能够还原大部分醌形成稳定氢醌的可诱导的ii相解毒二电子氧化还原酶。在大部分情况下，然后谷胱甘肽转移酶使氢醌解毒，使其与谷胱甘肽缀合以分泌，并有效避免了毒性更高的半醌。
但是，对于一些罕见化合物，nqo1介导的生物还原可用于抗肿瘤活性。不促进解毒，nqo1活性可将特定醌转变成高细胞毒性物质。大部分依赖于nqo1的抗肿瘤醌类是dna烷化剂：(a)丝裂霉素c(mmc)；(b)rh1；(c)e09；和(d)azq。但是，这些dna烷化剂不仅经受解毒途径，并且来自升高的或可诱导的dna修复途径的抗性也限制了其有用性。此外，这些物质中的许多是正常组织中普遍表达的一电子氧化还原酶的有效底物。
邻萘醌，β-拉帕醌(β-lap，方案1)以nqo1依赖性方式杀伤培养的癌细胞以及体内的鼠异种移植物和原位人或小鼠肿瘤模型。与烷基化醌类相比，β-lap通过nqo1依赖性活性氧物质(ros)形成和氧化应激诱导细胞死亡。β-lap的nqo1代谢导致不稳定的氢醌，其被2当量的双氧自发氧化，从而产生超氧化物。
方案1.醌化合物的实例
因此建立了氧化还原的无效循环，并且升高了超氧化物水平，继而导致大量dna碱基和单链断裂(ssb)损伤，其通常被容易地和快速地修复。但是，β-lap处理的过表达nqo1的癌细胞中产生的大量dna损伤导致聚(adp-核糖)聚合酶-1(parp1)的超活化，其是一种其他的基础碱基和ssb修复酶。继而，parp1超活化导致由于adp核糖基化而使得nad+/atp库明显减少，从而造成极大的能量损耗和细胞死亡。结果，β-lap通过独特的程序化坏死机制杀伤nqo1+癌细胞，所述机制为：(a)不依赖于胱天蛋白酶的活化或p53状态；(b)不依赖于bcl-2水平；(c)不受bax/bak缺陷影响；(d)不依赖于egfr、ras或其他组成型信号转导的活化；和/或(e)不依赖于增殖，因为nqo1在所有细胞周期阶段中均表达。因此，β-lap是有吸引力的实验性化学治疗剂，并且许多β-lap制剂已经或正处于i/ii期临床试验。
脱氧尼博醌(dnq，方案1)是有前途的抗瘤剂。之前的数据表明，dnq通过氧化应激和ros形成杀伤癌细胞。dnq的细胞毒性被n-乙酰半胱氨酸(一种整体自由基清除剂和谷胱甘肽的前体)部分地阻止。现在发现，dnq经历类似于β-lap的nqo1依赖性无效循环，其中氧被消耗，并且形成ros，大量dna损伤引起parp1超活化，明显降低基础nad+/atp核苷酸库，表明程序化坏死。重要地，dnq比β-lap强效20至100倍，与nqo1-nsclc细胞相比，显著增强nqo1+细胞中的治疗窗。还在体外乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌模型中发现了dnq之有效的nqo1依赖性杀伤。此外，体外nqo1比β-lap有效得多地处理dnq，表明增加的利用率是其效力提高的原因。因此，dnq作为用于治疗具有升高的nqo1水平之实体瘤的选择性化学治疗剂提供了显著的前途，但是，由于联合的协同，本文所述联合疗法可以提供利用多种醌化合物的有效疗法。
由于nqo1在大部分实体瘤中过表达，并且多种醌化合物的细胞毒性主要取决于酶nqo1升高的表达，因此醌化合物及其衍生物可以是实现靶向实体瘤的优异手段。本发明提供了许多新的细胞毒性化合物，其可用作本文所述的新癌症治疗。
通过以下详细描述，本公开内容的前述以及其他目的和特征将变得明显，所述描述参考附图进行。根据本文提供的详细描述和附图，本申请的其他实施方案、形式、特征、方面、益处、目的和优点将变得明显。
nqo1生物可活化药物与dna修复抑制剂一起用于肿瘤特异性使用的用途
nqo1生物可活化药物(为nqo1的底物的所有β-拉帕醌和dnq衍生物)以nqo1依赖的肿瘤选择性方式产生极高水平的活性氧物质，允许以肿瘤特异性方式使用dna修复抑制剂(包括所有parp1抑制剂、dna双链断裂修复抑制剂和碱基切除修复抑制剂)，实现两种试剂的肿瘤选择性功效。通常，dna修复抑制剂由于缺少肿瘤选择性而不成功。由于这些nqo1生物可活化药物造成肿瘤选择性的dna损伤(包括dna碱基损伤、单链断裂和双链断裂)的产生，因此dna修复抑制剂可用于提供肿瘤选择性抗肿瘤活性。肿瘤选择性活性和应答包括明显的糖酵解抑制和其他肿瘤选择性代谢抑制。
以除非知道产生了dna损伤否则不明显的方式，以及以造成不明显并且依赖于所使用的dna修复抑制剂而改变的代谢变化和细胞死亡响应的方式，nqo1生物可活化药物可用于使nda修复抑制剂具有肿瘤选择性。例如，与dnq生物可活化药物一起施用的parp1抑制剂造成标准凋亡响应，而无能量损失。相比之下，dna双链断裂修复、单链断裂修复和碱基切除修复抑制剂增强parp1超活化，以及随后能量代谢中的损失和程序化坏死。
目前唯一使用的dba修复抑制剂(如parp-1抑制剂)是通过独特利用肿瘤特异性合成致死性响应(例如，在braca1/2突变肿瘤中使用parp1抑制剂)。但是，这是dna修复抑制剂非常有限的用途-仅为乳腺癌的仅5％。相比之下，本文所述方法可以治疗所有具有升高的nqo1水平和降低的过氧化氢酶水平的癌症，而正常组织具有升高的过氧化氢酶和低水平的nqo1。本文所述方法提供了dna修复抑制剂的新用途，允许其以肿瘤选择性方式使用，同时还加强了nqo1生物可活化药物。两种试剂可以以无毒剂量使用以产生协同的肿瘤选择性功效响应。
迄今为止，dna修复抑制剂的失败之处在于缺少肿瘤选择性响应和功效。本文所述方法解决了这些限制，同时极大加强了nqo1生物可活化药物。所述方法还允许使用2至＞4倍较低剂量的nqo1生物可活化药物，解决了这些nqo1生物可活化药物的毒性作用(例如，高铁血红蛋白血症)。在所述治疗方法中，抑制剂可以在nqo1生物可活化药物之前和之后添加，在之前最短时间以及之前任意时间、同时、之后或其组合。细胞死亡响应取决于所使用的抑制剂。响应不明显，并且将需要特定生物标志物以在体内追踪。
定义
一般来说，本文中使用的术语和短语具有其本领域中承认的含义，这些含义可以通过参考本领域技术人员已知的标准文本、期刊参考文献和上下文找到。这样的本领域承认的含义可以通过参考技术词典如hawley’scondensedchemicaldictionary第14版，r.j.lewis，johnwiley&sons，newyork，n.y.，2001来获得。
ber，碱基切除修复；ssbr，单链断裂修复；dsbr，双单链断裂修复。
未用数量词限定的名词包括复数指示物，除非上下文清楚地另有说明。因此，例如，提到“化合物”包括多个这样的化合物，因此化合物x包括多个化合物x。还应注意的是，权利要求可能被撰写为排除了任何任选的要素。因此，该陈述旨在充当结合权利要求之要素的陈述来使用排他性术语(如“唯一”、“仅”等)或者使用“负”限制的在先基础。
术语“和/或”意指该术语所结合的项目中的任何一个，以及项目的任意组合，或者所有项目。短语“一个/种或更多个/种”是本领域技术人员容易理解的，特别是结合其所使用的上下文来阅读时。例如，苯环上的一个或更多个取代基是指1至5、或1至4(例如如果苯环是双取代的)。
术语“约”可以指指定值的±5％、±10％、±20％或±25％的变量。例如，“约50％”在一些实施方案中可以包括45％至55％的变量。对于整数范围，术语“约”可以包括比所述范围每一端的整数大和/或小的一个或两个整数。除非本文另有说明，否则术语“约”旨在包括在个别成分、组合或实施方案的功能方面等同的接近所述范围的值(例如，重量百分比)。
如技术人员将理解的，所有数值(包括表达成分的量、特性(例如分子量)、反应条件等的那些)，是近似值并且应理解为在所有情况下均任选地被术语“约”所修饰。这些值可以根据本领域技术人员使用本文所述教导尝试得到的期望特性而改变。还应理解的是，这样的值固有地包括在各自测试测量中所发现的标准差造成的必要的变化性。
尽管本发明可以采取许多不同形式，然而为了有利于理解本发明的原理的目的，现将参考附图中举例说明的实施方案并且使用特定语言来对其进行描述。然而，应理解的是，并未意在由此限制本发明的范围。如本发明所涉及领域技术人员通常将理解的，预期了所描述实施方案的任何改变和进一步修改，以及本发明原理的进一步应用。
当本文公开取代基的组时，应理解的是，分别公开了该组和所有亚组的所有独立成员，包括组成员的任何异构体、对映体和非对映体。当本文使用马库什组或其他分组时，所述组的所有独立成员和所述组的所有可能的组合和亚组合均意在独立地包括在所公开内容中。当本文描述化合物以使得未指明所述化合物的具体异构体、对映体或非对映体(例如以式子或化学名称)时，所述描述意在包括单独的或以任意组合所描述化合物的每种异构体和对映体。另外，除非另有说明，否则本文所公开化合物的所有同位素变体均意在被所公开内容所涵盖。例如，应理解，所公开分子中的任意一个或更多个氢可以被替换成氘或氚。分子的同位素变体通常可用作分子的测定以及与所述分子或其用途有关的化学和生物学研究中的标准物。用于制备这样的同位素变体的方法是本领域中已知的。化合物的具体名称旨在是示例性的，因为已知本领域技术人员可能将相同化合物命名为不同名称。
当在说明书中给出范围(例如温度范围、时间范围、碳链范围或者组成或浓度范围)时，所有包括在所述范围内的中间范围和子范围以及所有独立数值也旨在独立地包括在所公开内容中。应理解的是，包括在说明书中的范围或子范围中的任何子范围或独立数值均可任选地从本发明的实施方案中排除。
本文使用的“包括”与“包含”、“含有”或“其特征在于”同义，是包含性的或开放性的，且并不排除额外的未提及的要素或方法步骤。本文使用的“由......组成”排除了任何未在权利要求的要素中指明的要素、步骤或成分。本文使用的“基本上由......组成”并不排除不会实质性影响权利要求的基础和新特征的材料或步骤。在本文的每一种情况下，术语“包括”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任何可以被其他两个术语中的任一代替。本文适当地示例性描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何要素、限制的情况下实施。
“化学治疗剂”是指任何能够减少或阻止癌细胞、癌细胞群、肿瘤或其他恶性组织的生长、增殖或扩散的物质。该术语还旨在涵盖任何抗肿瘤剂或抗癌剂。
关于本发明治疗方法的化合物的“治疗有效量”是指根据用于待治疗疾病或病症或者化妆品目的的临床上可接受的标准(例如在适合于任何医学治疗的合理收益/风险比下)，在作为期望的给药方案(向不哺乳动物，例如人)施用时缓解症状、改善病症或者减缓疾病状况的发作之制剂中化合物的量。
术语“治疗”包括(i)防止疾病、病理或医学状况发生(例如，预防)；(ii)抑制疾病、病理或医学状况或阻止其发展；(iii)减轻疾病、病理或医学状况；和/或(iv)减少与疾病、病理或医学状况相关的症状。因此，术语“治疗”可以延伸到预防，并且可以包括预防、防止、阻止、减少、终止或逆转被治疗的病症或症状的进展或严重性。因此，术语“治疗”可以包括适当地医学治疗和/或预防性施用。术语“治疗”可以包括以改善或稳定对象病症的方式逆转、减少或阻止症状、临床病征和病症潜在的病理。
术语“抑制”是指减缓、停止或逆转疾病、感染、病症或细胞群的生长或进展。例如与在不存在治疗或接触的情况下发生的生长或进展相比，抑制可以大于约20％、40％、60％、80％、90％、95％或99％。
术语“接触”是指接触、使接触或使非常或极为接近的动作，包括在例如溶液中、反应混合物中、体外或体内的细胞水平的或分子水平的接触，例如，使发生生理反应、化学反应或物理变化。
术语“暴露”意在涵盖本领域中广泛理解的定义。在一个实施方案中，该术语意指经受或被允许经受作用、影响或条件。例如，仅举例来说，可以使细胞经受治疗有效量的可药用形式的化学治疗剂的作用、影响或条件。
术语“癌细胞”旨在涵盖本领域中广泛理解的定义。在一个实施方案中，该术语是指可以在人或动物中造成癌症的临床病症的异常调控细胞。在一个实施方案中，该术语可以是指培养的细胞系或者人或动物体的细胞或来源其的细胞。癌细胞可以是广泛多种分化的细胞、组织或器官类型，如本领域技术人员理解的。
术语“肿瘤”是指赘生物、通常为包含多个聚集的恶性细胞的团块。
在本文所述式子中，以下基团可以适当地为r基或桥连基。
术语“烷基”是指单价支链或无支链的饱和烃链，优选地具有1至30个碳原子。短烷基是具有1至12个碳原子的那些，包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基，包括其所有的异构体。长烷基是具有12至30个碳原子的那些。所述基团可以是端基或桥连基。
烷基、杂烷基、芳基、杂芳基和杂环基以及其环状和/或不饱和形式可以是式i的r基，并且每个基团可以任选地被取代。
术语“取代的”是指使用“取代的”之表述中所指基团上的一个或更多个氢原子被“取代基”替换。通过“一个或更多个”提及的数目可以从存在取代基的部分上明显看出。例如，一个或更多个可以指例如1、2、3、4、5或6个；在一些实施方案中，1、2或3个；并且在一些实施方案中，1或2个。取代基可以是所指基团的一个选择，或可以是本领域技术人员已知的合适基团，只要不超过被取代原子的正常价并且所述取代导致稳定化合物即可。合适的取代基包括例如，烷基、烯基、炔基、烷氧基、卤代、卤代烷基、羟基、羟烷基、芳基、芳酰基、(芳基)烷基(例如苄基或苯乙基)、杂芳基、杂环、环烷基、烷酰基、烷氧羰基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、三氟甲基、三氟甲氧基、三氟甲硫基、二氟甲基、酰氨基、硝基、羧基、羧基烷基、酮基、硫代、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、芳基亚磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基亚磺酰基、杂芳基磺酰基、杂环亚磺酰基、杂环磺酰基、磷酸盐/酯、硫酸盐/酯、羟基胺、羟基(烷基)胺和氰基。此外，合适的取代基可以是例如-x、-r、-o-、-or、-sr、-s-、-nr2、-nr3、＝nr、-cx3、-cn、-ocn、-scn、-n＝c＝o、-ncs、-no、-no2、＝n2、-n3、-nc(＝o)r、-c(＝o)r、-c(＝o)nrr、-s(＝o)2o-、-s(＝o)2oh、-s(＝o)2r、-os(＝o)2or、-s(＝o)2nr、-s(＝o)r、-op(＝o)o2rr、-p(＝o)o2rr、-p(＝o)(o-)2、-p(＝o)(oh)2、-c(＝o)r、-c(＝o)x、-c(s)r、-c(o)or、-c(o)o-、-c(s)or、-c(o)sr、-c(s)sr、-c(o)nrr、-c(s)nrr或-c(nr)nrr，其中每个x独立地为卤素(“卤代”)：f、cl、br或i；并且每个r独立地为h、烷基、芳基、(芳基)烷基(例如，苄基)、杂芳基、(杂芳基)烷基、杂环、杂环(烷基)或保护基。如本领域技术人员将容易理解的，当取代基是酮基(＝o)或硫代(＝s)等时，被取代原子上的两个氢原子被替换。在一些实施方案中，可以将上述一个或更多个取代基从用于被取代基团上之取代基的潜在值的组中排除。
除非另有陈述，独自的或与另一术语结合的术语“杂烷基”意指包含至少一个碳原子和至少一个杂原子的稳定的直链或支链或环烃基或者其组合，其链中通常具有2至14个碳或2至10个碳，所述杂原子选自o、n、p、si和s，并且其中所述氮原子和硫原子可任选地被氧化，且所述氮杂原子可任选地季铵化。杂原子o、n、p和s可位于杂烷基的任何内部位置或烷基与分子的其余部分的连接位置处。杂烷基在链中可以具有例如1至约20个碳原子。实例但不限于--ch2--ch2--o--ch3、--ch2--ch2--nh--ch3、--ch2--ch2--n(ch3)--ch3、--ch2--s--ch2--ch3、--ch2--ch2--s(o)--ch3、--ch2--ch2--s(o)2--ch3、--ch＝ch--o--ch3、--si(ch3)3、--ch2一ch＝n--och3、--ch＝ch--n(ch3)--ch3、o--ch3、--o--ch2--ch3和--cn。杂烷基的另外实例包括烷基醚、仲和叔烷基胺、酰胺、烷基硫化物等。基团可以是端基或桥连基。如本文使用的，提到在桥连基的情况下使用的链是指连接桥连基的两个末端位置的原子的直接链。
本文使用的术语“醇”可以定义为包含在氢原子处被一个羟基取代的c1-12烷基部分的醇。醇包括乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、正己醇、环己醇、正庚醇、正辛醇、正壬醇、正癸醇等。醇中的碳原子可以是直链、支链或环形。
“酰基”可以定义为烷基-co-基团，其中所述烷基如本文所述。酰基的实例包括乙酰基和苯甲酰基。所述烷基可以是c1-c6烷基。所述基团可以是端基或桥连(即，二价)基。
“烷氧基”是指-o-烷基，其中烷基如本文所定义。优选地，烷氧基是c1-c6烷氧基。实例包括但不限于甲氧基和乙氧基。所述基团可以是端基或桥连基。
作为基团或基团一部分的“烯基”表示含有至少一个碳碳双键的脂肪烃基团，其可以是直链或支链，在正常链中优选地具有2至14个碳原子，更优选地具有2至12个碳原子，最优选地具有2至6个碳原子。所述基团可在正常链中含有多个双键，并且每个双键的方向独立地为e或z。示例性的烯基包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基和壬烯基。所述基团可以是端基或桥连基。
作为基团或基团一部分的“炔基”可以定义为含有碳碳三键的脂肪烃基团，其链可以是直链或支链，在正常链中优选地具有2至14个碳原子，更优选地具有2至12个碳原子，最优选地具有2至6个碳原子。示例性结构包括但不限于乙炔基和丙炔基。所述基团可以是端基或桥连基。
“烯氧基”是指--o--烯基，其中烯基如本文所定义。优选的烯氧基是c1-c6烯氧基。所述基团可以是端基或桥连基。
“炔氧基”是指--o-炔基，其中炔基如本文所定义。优选的炔氧基是c1-c6炔氧基。所述基团可以是端基或桥连基。
“烷氧羰基”是指-c(o)--o-烷基，其中烷基如本文所定义。所述烷基优选c1-c6烷基。实例包括但不限于甲氧羰基和乙氧羰基。所述基团可以是端基或桥连基。
“烷基亚磺酰基”可以定义为-s(o)-烷基，其中烷基如上所定义。所述烷基优选c1-c6烷基。示例性烷基亚磺酰基包括但不限于甲基亚磺酰基和乙基亚磺酰基。所述基团可以是端基或桥连基。
“烷基磺酰基”是指-s(o)2-烷基，其中烷基如上所定义。所述烷基优选c1-c6烷基。实例包括但不限于甲基磺酰基和乙基磺酰基。所述基团可以是端基或桥连基。
“氨基”是指-nh2，而“烷基氨基”是指-nr2，其中至少一个r是烷基，而第二个r是烷基或氢。术语“酰氨基”是指rc(＝o)nh-，其中r是烷基或芳基。烷基可以是例如c1-c6烷基。实例包括但不限于甲氨基和乙氨基。所述基团可以是端基或桥连基。
“烷基氨基羰基”是指烷基氨基-羰基，其中烷基氨基如上所定义。所述基团可以是端基或桥连基。
“环烷基”是指3至约30个碳原子的饱和或部分饱和的、单环或稠合或螺多环碳环，每个环通常含有3至约9个碳，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环辛基等。其包括单环系统(如环丙基和环己基)，二环系统(如萘烷)，以及多环系统(如金刚烷)。所述基团可以是端基或桥连基。
“环烯基”可以定义为含有至少一个碳碳双键的非芳族单环或多环环系统，优选地每个环具有5至10个碳原子。示例性单环环烯基环包括环戊烯基、环己烯基或环庚烯基。环烯基可以被一个或更多个取代基所取代。所述基团可以是端基或桥连基。
烷基和环烷基可以是其他基团的烷基部分上的取代基，例如但不限于烷氧基、烷基胺、烷基酮、芳基烷基、杂芳基烷基、烷基磺酰基和烷基酯取代基等。所述基团可以是端基或桥连基。
“环烷基烷基”可以定义为环烷基-烷基-基团，其中环烷基和烷基部分如之前所述。示例性单环烷基烷基包括环丙基甲基、环戊基甲基、环己基甲基和环庚基甲基。所述基团可以是端基或桥连基。
“杂环烷基”是指含有至少一个杂原子的饱和或部分饱和的单环、二环或多环环，所述杂原子选自氮、硫、氧，优选地在至少一个环中有1至3个杂原子。每个环优选地为3至10元，更优选地为4至7元。合适的杂环烷基取代基的实例包括吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、吗啉代、1，3-二氮杂环庚烷(diazapane)、1，4-二氮杂环庚烷、1，4-氧氮杂环庚烷(oxazepane)和1，4-氧硫杂环庚烷(oxathiapane)。所述基团可以是端基或桥连基。
“杂环烯基”是指上述杂环烷基但是含有至少一个双键。所述基团可以是端基或桥连基。
“杂环烷基烷基”是指杂环烷基-烷基，其中所述杂环烷基和烷基部分如之前所述。示例性杂环烷基烷基包括(2-四氢呋喃基)甲基和(2-四氢硫代呋喃基)甲基。所述基团可以是端基或桥连基。
“卤代”是指卤素取代基，例如氟代、氯代、溴代或碘代。
术语“芳基”是指从母体芳环系统的单个碳原子上移除一个氢原子得到的芳族烃基。基团可以在母体环系统的饱和或不饱和碳原子处。芳基可以具有6至18个碳原子。芳基可以具有单环(例如苯基)或多稠合(稠)环，其中至少一个环是芳族的(例如，萘基、二氢菲基、芴基或蒽基)。典型的芳基包括但不限于来自苯、萘、蒽、联苯等的基团。芳基可以是未取代的或任选被取代的，并如上文关于烷基的描述。
术语“杂芳基”在本文定义为包含1、2或3个芳环并且在芳环中含有至少一个氮、氧或硫原子的单环、二环或三环系统，其可以未取代或者被例如一个或更多个(特别是1至3个)取代基所取代，如上述定义“取代的”。杂芳基的实例包括但不限于2h-吡咯基、3h-吲哚基、4h-喹嗪基、吖啶基、苯并[b]噻吩基、苯并噻唑基、β-咔啉基、咔唑基、色满基(chromenyl)、噌啉基(cinnolinyl)、二苯并[b，d]呋喃基、呋咱基(furazanyl)、呋喃基、咪唑基、imidizolyl、吲唑基、吲嗪基(indolisinyl)、吲哚基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异
术语“杂环”是指含有至少一个杂原子的饱和或部分不饱和的环系统，所述杂原子选自氧、氮和硫，并且任选地被本文在术语“取代的”下定义的一个或更多个基团所取代。杂环可以是含有一个或更多个杂原子的单环、二环或三环基团。杂环还可以含有与环连接的氧代基(＝o)。杂环基团的非限制性实例包括1，3-二氢苯并呋喃、1，3-二氧戊环、1，4-二
本文使用的缩写“dnqd”是指dnq的类似物或衍生物。
下文描述了可以作为r1、r2、r3和r4的桥连基或端基的另外的基团。
术语“碳酸酯”可以定义为具有一般结构r′oc(＝o)or的官能团，其中r′可以是式i的三环核，而r可以如式i的变化的定义中所定义。
术语“酯”可以定义为具有一般结构rc(＝o)or′的官能团，其中r′可以是式i的三环核，而r可以如式i的变量的定义中所定义，反之亦然。
“吡啶基”可以是2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基。
术语“巯基”可以定义为具有一般结构-s-h的官能团。
术语“亚磺酰基”可以定义为具有一般结构r-s(＝o)-r′的官能团，其中r′可以是式i的三环核，而r可以如式i的变量的定义中所定义，反之亦然。
术语“磺酰基”可以定义为具有一般结构r-s(＝o)2-r′的官能团，其中r′可以是式i的三环核，而r可以如式i的变化的定义中所定义，反之亦然。
术语“己糖”可以定义为具有6个碳原子的单糖，其具有一般化学式c6h12o6，并且可以包括在1位具有醛官能团的己醛糖或在2位具有酮官能团的己酮糖。示例性己醛糖包括d形式或l形式的阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖和塔罗糖。
parp抑制剂是酶聚adp核糖聚合酶(parp)的一组药理学抑制剂。开发其用于多种适应症，包括治疗癌症。多种形式的癌症比常规细胞更依赖于parp，使得parp成为癌症疗法的有吸引力的靶标。parp-1抑制剂特别可用于与本文所述治疗联合。parp-1抑制剂可购自供应商，例如selleckchemicals。parp-1抑制剂的实例包括下表1中所列的抑制剂。
表1.parp-1抑制剂。
＊尽管报道了bsi-201是parp1抑制剂并且与β-lap或dnq确实具有协同作用，但是使用parp1敲减细胞，我们注意到了另外的协同作用，这是利用其它parp1抑制剂未观察到的。此外，与所有其他抑制剂不同，其添加并不阻止parp1par形成。我们因此推断，bsi-201不是parp1抑制剂，而是dna损伤剂，这解释了所注意到的协同作用。
＊＊与多种剂量的β-拉帕醌或dnq一起，添加多种剂量(μm)的每一种parp1抑制剂。报道的灵敏性数值代表了在与最佳剂量(即，15μm)的每一种parp1抑制剂联合的无毒剂量的β-拉帕醌(a549细胞为3μm，miapaca2细胞为2μm)或dnq(a549细胞为0.02μm，miapaca2细胞为0.025μm)下，a549nsclc细胞或miapaca-2胰腺癌细胞之存活的变化。10的值等于log1杀伤，而100的值表示log2杀伤，以此类推。在高达100μm之前，parp1抑制剂是非致死性的。
本发明的化合物和方法
本发明提供了dnq化合物β-拉帕醌及其衍生物，以及nqo1生物可活化药物在用于治疗癌症的联合疗法中的用途。dnq化合物的实例包括式(i)的化合物或者其盐或溶剂合物：
其中
r1、r2、r3和r4各自独立地为-h或-x-r；
每个x独立地为直接键或桥连基，其中所述桥连基是-o-、-s-、-nh-、-c(＝o)-、-o-c(＝o)-、-c(＝o)-o-、-o-c(＝o)-o-或者式-w-a-w-的接头，其中
每个w独立地为直接键或-n(r′)c(＝o)-、-c(＝o)n(r′)-、-oc(＝o)-、-c(＝o)o-、-o-、-s-、-s(o)-、-s(o)2-、-n(r′)-、-c(＝o)-、-(ch2)n-其中n是1-10，其中每个r′独立地为h、(c1-c6)烷基或氮保护基；并且
每个a独立地为(c1-c20)烷基、(c2-c16)烯基、(c2-c16)炔基、(c3-c8)环烷基、(c6-c10)芳基、-(och2-ch2)n-其中n是1至约20、-c(o)nh(ch2)n-其中n是1至约6、-op(o)(oh)o-、-op(o)(oh)o(ch2)n-其中n是1至约6、或者(c1-c20)烷基、(c2-c16)烯基、(c2-c16)炔基或-(och2-ch2)n-，在两个碳之间或者碳和氧之间被环烷基、杂环或芳基中断；
每个r独立地为烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、(环烷基)烷基、(杂环烷基)烷基、(环烷基)杂烷基、(杂环烷基)杂烷基、芳基、杂芳基、(芳基)烷基、(杂芳基)烷基、氢、羟基、羟烷基、烷氧基、(烷氧基)烷基、烯氧基、炔氧基、(环烷基)烷氧基、杂环烷氧基、氨基、烷基氨基、氨基烷基、酰基氨基、芳基氨基、磺酰基氨基、亚磺酰基氨基、-corx、-coorx、-conhrx、-nhcorx、-nhcoorx、-nhconhrx、-n3、-cn、-nc、-nco、-no2、-sh、-卤代、烷氧羰基、烷基氨基羰基、磺酸盐/酯、磺酸、烷基磺酰基，烷基亚磺酰基、芳基磺酰基、芳基亚磺酰基、氨基磺酰基、rxs(o)ry-、rxs(o)2ry-、rxc(o)n(rx)ry-、rxso2n(rx)ry-、rxn(rx)c(o)ry-、rxn(rx)so2ry-、rxn(rx)c(o)n(rx)ry-、甲醛(carboxaldehyde)、酰基、酰氧基、-opo3h2、-opo3z2其中z是无机阳离子、或者糖；其中rx独立地为h、oh、烷基或芳基，并且每个ry独立地为基团w；
其中任何烷基或芳基可以任选地被一个或更多个羟基、氨基、氰基、硝基或卤代基团所取代。
在一些实施方案中，当r1、r2和r3是甲基时，r4不是h或甲基。在另一些实施方案中，当r1、r3和r4是甲基时，r2的基团-x-r不是-ch2-oac。在某些实施方案中，当r1、r3和r4是甲基时，r2的r基不是酰氧基。在多个实施方案中，r1至r4不全是h。在某些实施方案中，r1至r4不全是烷基，例如未取代的烷基。在一些实施方案中，r1至r4不全是甲基。
在一些实施方案中，r1、r2、r3和r4全是(c1-20)烷基。在一些实施方案中，(c1-211)烷基是(c2-20)烷基、(c3-20)烷基、(c4-20)烷基、(c5-20)烷基或(c10-20)烷基。烷基可以是取代的，例如被羟基或磷酸基团取代。磷酸基团可以是膦酸或膦酸盐，例如锂盐、钠盐、钾盐或其他已知的膦酸盐。
r1的一个特定值是h。r2的一个特定值是h。r3的一个特定值是h。r4的一个特定值是h。
r1的一个特定值是甲基。r2的一个特定值是甲基。r3的一个特定值是甲基。r4的一个特定值是甲基。甲基可以根据上文描述的术语“取代的”进行取代。
在式(i)的一些实施方案中：
r1和r2是甲基；r3是氢；并且r4是2-甲基-丙烷；
r1和r2是甲基；r3是氢；并且r4是丁基；
r1和r4是甲基，并且r3是氢；并且r2是乙基；
r1和r2是甲基，并且r3是氢；并且r4是乙基；
r1是甲基；r3是氢；r2是丙基；并且r4是丁基；
r1和r4是甲基；r2是丙基并且r3是氢；
r1是丙基；r2和r4是甲基，并且r3是氢；
r1和r2是乙基；r3是氢；并且r2是甲基；
r1是丙基；r2是甲基；r3是氢；并且r4是丁基；
r1和r2是丙基；r3是氢；并且r4是丁基；
r1和r2是甲基；r3是氢；并且r4是c12烷基；
r1和r2是甲基；r3是氢；并且r4是叔丁基；
r1和r2是甲基；r3是氢；并且r4是羟丙基；
r1和r2是甲基；r3是氢；并且r4是3，3-二甲基丁基[-ch2ch2c(ch3)2ch3]；
r1和r2是甲基；r3是氢；并且r4是3-甲基丁基[-ch2ch2ch(ch3)ch3]；
r2和r4是甲基；r3是氢；并且r1是乙基；
r1和r2是甲基；r3是氢；并且r4是丙基；
r1和r2是甲基；r3是氢；并且r4是正戊基；
r1和r2是甲基；r3是氢；并且r4是正己基；
r1和r2是甲基；r3是氢；并且r4是异丙基；
r1和r2是甲基；r3是氢；并且r4是环辛基；
r1和r2是甲基；r3是氢；并且r4是环丙基；
r1和r2是甲基；r3是氢；并且r4是甲基环丙基；
r1和r2是甲基；r3是氢；并且r4是乙基环丙基；
r1是c12烷基；r2和r4是甲基；并且r3是氢；
r1和r4是甲基；r3是氢；并且r2是c12烷基；
r1、r2和r3是甲基；并且r4是-ch2opo3na2；
r1是-ch2opo3na2；r2和r3是甲基；并且r4是氢；
r1和r3是甲基；r2是-ch2opo3na2；并且r4是氢；
r1和r2是甲基；r3是-ch2opo3na2；并且r4是氢；
r1和r2是甲基；r3是-ch2ch2opo3na2；并且r4是氢；
r1、r2和r3是甲基；并且r4是-ch2oh；
r1是-ch2oh；r2和r3是甲基；并且r4是氢；
r1和r3是甲基；r2是-ch2oh；并且r4是氢；
r1和r2是甲基；r3是-ch2oh；并且r4是氢；或者
r1和r2是甲基；r3是-ch2ch2oh；并且r4是氢。图11和12中举例说明了本发明另外的特定化合物和式子。
在式i的某些实施方案中，r1是(c1-4)烷基。在某些情况下，r1是(c1-3)烷基。在某些情况下，r1是(c1-2)烷基。
在式i的某些实施方案中，r2是(c1-4)烷基。在某些情况下，r2是(c1-3)烷基。在某些情况下，r2是(c1-2)烷基。
在式i的某些实施方案中，r3是氢。
在式i的某些实施方案中，r4是任选地取代的(c1-10)烷基，其中所述烷基被羟基、卤素、氨基或巯基所取代。在某些情况下，r4是(c1-10)烷基、(c1-8)烷基、(c1-6)烷基或(c1-4)烷基。在某些情况下，r4是(c2-6)烷基。在某些情况下，r4是取代的(c1-10)烷基、取代的(c1-8)烷基、取代的(c1-6)烷基或取代的(c1-4)烷基，其中所述烷基被羟基、卤素、氨基或巯基所取代。在某些情况下，r4是被羟基取代的烷基。在某些情况下，r4是被卤素取代的烷基。在某些情况下，r4是被氨基取代的烷基。在某些情况下，r4是被巯基取代的烷基。
在式i的某些实施方案中，r1和r2独立地为(c1-4)烷基；r3是氢；并且r4是任选地取代的(c1-10)烷基，其中所述烷基被羟基、卤素、氨基和巯基所取代。
在式i的某些实施方案中，r1和r2独立地为(c1-2)烷基；r3是氢；并且r4是任选地取代的(c1-10)烷基，其中所述烷基被羟基、卤素、氨基和巯基所取代。
在式i的某些实施方案中，r1和r2独立地为(c1-2)烷基；r3是氢；并且r4是(c1-10)烷基。在式i的某些实施方案中，r1和r2独立地为(c1-2)烷基；r3是氢；并且r4是(c1-8)烷基。在式i的某些实施方案中，r1和r2独立地为(c1-2)烷基；r3是氢；并且r4是(c1-6)烷基。在式i的某些实施方案中，r1和r2独立地为(c1-2)烷基；r3是氢；并且r4是(c1-4)烷基。在式i的某些实施方案中，r1和r2独立地为(c1-2)烷基；r3是氢；并且r4是(c2-6)烷基。在式i的某些实施方案中，r1和r2独立地为(c1-2)烷基；r3是氢；并且r4是取代的(c1-6)烷基，其中所述烷基被羟基、卤素、氨基和巯基所取代。在式i的某些实施方案中，r1和r2独立地为(c1-2)烷基；r3是氢；并且r4是取代的(c1-4)烷基，其中所述烷基被羟基、卤素、氨基和巯基所取代。
在某些实施方案中，式i化合物是化合物87或者其盐或溶剂合物：
在某些实施方案中，式i化合物是化合物9-253或者其盐或溶剂合物：
在某些实施方案中，式i化合物是化合物9-251或者其盐或溶剂合物：
在某些实施方案中，式i化合物是化合物10-41或者其盐或溶剂合物：
在某些实施方案中，式i化合物是化合物109或者其盐或溶剂合物：
在某些实施方案中，式i化合物是化合物107或者其盐或溶剂合物：
在某些实施方案中，式i化合物是化合物9-281或者其盐或溶剂合物：
在某些实施方案中，式i化合物是化合物9-249或者其盐或溶剂合物：
在某些实施方案中，式i化合物是化合物9-255或者其盐或溶剂合物：
在某些实施方案中，式i化合物是化合物9-257或者其盐或溶剂合物：
本发明还提供了药物组合物，其包含式(i)的化合物和可药用稀释剂、赋形剂或载体。载体可以是水，例如在羟丙基-β-环糊精(hpβcd)的存在下。与在不具有hpβcd的水中的化合物溶解度相比，化合物的溶解度可以增加约100倍、约200倍、约500倍、约1000倍、约2000倍或约3000倍。国际申请no.pct/us12/59988(hergenrother等)中描述了另外的dnq化合物和方法。
至于含有一个或更多个取代基的任何上述式或基团，当然应理解的是，这样的基团不包含空间上不实际和/或合成上不可行的任何取代或取代方式。此外，本发明化合物包括由这些化合物的取代得到的所有立体化学异构体。
本文所述化合物的所选择取代基可以存在递归度(recursivedegree)。在这种情况下，“递归取代基(recursivesubstituent)”意指可以再引用其本身的另一个实例的取代基。由于这种取代基的递归性，理论上，任何给定的权利要求中可能存在很大量。医药化学和有机化学领域的普通技术人员应理解，这样的取代基的总数受到预期化合物之所期望性质的合理限制。这样的性质包括例如但不限于物理性质(如分子量、溶解度或logp)，应用性质(如对预定靶标的活性)，以及实践性质(如合成的容易性)。
递归取代基是本发明的一个预期方面。医药化学和有机化学领域的普通技术人员理解这样的取代基的通用性。在本发明权利要求中存在递归取代基的程度上，总数将如上所述确定。在一些实施方案中，递归取代基仅以如下程度存在：化合物的分子质量为约400至约1600、约450至约1200、约500至约100、约600至约800。在另一些实施方案中，递归取代基仅以如下程度存在：化合物的分子质量小于2000、小于1800、小于1600、小于1500、小于1400、小于1200、小于1000、小于900、小于800、小于750、小于700或小于约600。
具有升高的nqo1水平的实体瘤患者可以通过施用有效量的药物活性形式的dnq和/或dnqd(dnq化合物)来治疗。dnq和dnqd化合物可以是例如图11的一个式子限定的化合物，或者图12中举例说明的化合物。在图11中，其中n＝1至30，n的值可以是1或1至约30的任何整数。因此，范围1至30包括1至30的每个独立整数以及1至30中的任何一个数字至任何第二个数字的任何范围。在本文描述的每个范围中，也可以从限定的实施方案中排除范围的一部分。例如，在多个实施方案中，变量n可以是6至24，而同一式子的另一个n变量可以是1至24。
在图11的dnqd-20中，r1、r2和r3可以如上文对于式i的限定。在多个实施方案中，r1、r2和r3各自还可以独立地为c1-20烷基，或者r1、r2和r3各自可以独立地与己糖的异头(anomeric)位置连接，所述连接任选地通过接头，例如式-w-a-w-或(c1-c10)亚烷基的接头。
在图11的dnqd-27和dnqd-28中，x可以是式-w-a-w-的接头或者二价桥连基，例如二价烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基(acycloalkyl)、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、环烷基烷基、杂环烷基烷基、环烷基杂烷基、杂环烷基杂烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、炔氧基、环烷氧基、杂环烷氧基、氨基、烷基氨基、氨基烷基、酰基氨基、芳基氨基、磺酰基氨基、亚磺酰基氨基、烷氧羰基、烷基氨基羰基、磺酰基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基磺酰基、芳基亚磺酰基、氨基磺酰基或酰基，其各自可以任选地被取代。
在图11的dnqd-29中，每个x可以独立地为式-w-a-w-的接头或者上文对于dnqd-27和dnqd-28描述的二价桥连基；并且每个y可以独立地为：
(1)羟基、(11)乙酸盐/酯、(21)亚硝基、
(2)醛、(12)氨基、(22)吡啶基、
(3)羧基、(13)氮化物(azide)、(23)巯基、
(4)卤代甲酰基、(14)偶氮、(24)磺酸、
(5)过氧羟基、(15)氰基、(25)磺酸盐/酯、
(6)苯基、(16)异氰酸根、(26)异硫氰酸根、
(7)苄基、(17)硝酸盐/酯、(27)膦、
(8)烷基、(18)异腈、(28)磷酸盐/酯、
(9)烯基、(19)亚硝基氧基(29)卤代或
(nitrosooxy)、
(10)炔基、(20)硝基、(30)己糖。
本发明还提供了治疗具有升高的nqo1水平的肿瘤细胞之患者的方法。所述方法可以包括向具有升高的nqo1水平的肿瘤细胞的患者施用治疗有效量的式(i)的化合物或者本文所述组合物。本发明还提供了治疗具有升高的nqo1水平的肿瘤细胞的方法，其包括使所述肿瘤细胞暴露于治疗有效量的本文所述化合物或组合物，其中所述肿瘤细胞被治疗、杀死或抑制生长。肿瘤或肿瘤细胞可以是恶性肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞可以是癌细胞，例如非小细胞肺癌。
因此，本发明的方法可以用于治疗或预防多种瘤形成性病症，包括肢端色斑样黑素瘤、光化性角化病、腺癌、囊腺癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、星形细胞瘤、巴托林腺癌(bartholinglandcarcinoma)、基底细胞癌、支气管腺癌、毛细血管、类癌、癌、癌肉瘤、海绵状(cavernous)、胆管癌、软骨肉瘤(chondosarcoma)、脉络丛乳头瘤/癌、透明细胞癌、囊腺瘤、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、室管膜、上皮样、尤因肉瘤(ewing′ssarcoma)、纤维层(fibrolamellar)、局灶性结节性增生、胃泌素瘤、生殖细胞瘤、胶质母细胞瘤、胰升糖素瘤、血管母细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝细胞癌、胰岛素瘤、上皮内瘤形成、上皮内鳞状细胞瘤形成、侵袭性鳞状细胞癌、大细胞癌、平滑肌肉瘤、恶性着色斑型黑素瘤、恶性黑素瘤、恶性间皮瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、脑膜、间皮、转移癌、粘液表皮样癌、神经母细胞瘤、神经上皮腺癌、结节型黑素瘤、燕麦细胞癌、少突神经胶质、骨肉瘤、胰腺多肽、浆液性乳头状腺癌(papillaryserousadenocarcinoma)、松果体细胞、垂体瘤、浆细胞瘤、假肉瘤、肺母细胞瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、小细胞癌、软组织癌、分泌促生长素抑制素的肿瘤、鳞癌、鳞状细胞癌、亚间皮细胞(submesothelial)、表面蔓延型黑素瘤、未分化癌、眼色素层黑素瘤、疣状癌、血管活性肠多肽瘤、高度分化的癌和维尔姆斯瘤(wilm’stumor)。因此，本文所述组合物和方法可用于治疗膀胱癌、脑癌(包括颅内瘤如神经胶质瘤、脑脊膜瘤、神经鞘瘤和腺瘤)、乳腺癌、结肠癌、肺癌(sclc或nsclc)、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌。
制备本发明化合物的方法
本发明还涉及制备本发明化合物和组合物的方法。所述化合物和组合物可以通过任何适用的有机合成技术来制备。许多这样的技术是本领域中公知的。然而，许多已知技术详细描述在以下文献中：compendiumoforganicsyntheticmethods(johnwiley&sons，newyork)，第1卷，iant.harrison和shuyenharrison，1971；第2卷，iant.harrison和shuyenharrison，1974；第3卷，louiss.hegedus和leroywade，1977；第4卷，leroyg.wade，jr.，1980；第5卷，leroyg.wade，jr.，1984；和第6卷，michaelb.smith；以及标准有机参考书，例如march′sadvancedorganicchemistry：reactions，mechanisms，andstructure，第5版m.b.smith和j.march(johnwiley&sons，newyork，2001)，comprehensiveorganicsynthesis；selectivity，strategy&efficiencyinmodernorganicchemistry，第9卷中，barrym.trost主编(pergamonpress，newyork，1993印刷))；advancedorganicchemistry，partb：reactionsandsynthesis，第二版，cary和sundberg(1983)；protectinggroupsinorganicsynthesis，第二版，greene，t.w.和wutz，p.c.m.，johnwiley&sons，newyork；以及comprehensiveorganictransformations，larock，r.c.，第二版，johnwiley&sons，newyork(1999)。
以下提供了若干用于制备本发明组合物的示例性方法。这些方法旨在举例说明这些制备的性质，而不是旨在限制适用方法的范围。另外的方法和可用的技术描述在wo2013/056073(hergenrother等)中。
通常，反应条件(如温度、反应时间、溶剂、后处理程序(work-upprocedure)等)是本领域用于待进行之特定反应常见的那些。引用的参考资料以及其中引用的资料均包含对这些条件的详细描述。通常，温度为-100℃至200℃，溶剂根据所需要的条件为质子惰性的或质子的，反应时间为1分钟至10天。后处理通常由猝灭任何未反应试剂然后使在水层/有机层系统之间分配(萃取)以及分离含有产物的层组成。氧化和还原反应通常在接近室温的温度(约20℃)下进行，但是对于金属氢化物还原，通常将温度降低到0℃至-100℃。适当时还可以使用加热。对于还原来说，溶剂通常是质子惰性的，而对于氧化来说通常是质子的或质子惰性的。调整反应时间以取得期望的转变。
缩合反应通常在接近室温的温度下进行，但是对于非平衡动力学控制的缩合，降低的温度(0℃至-100℃)也是常见的。溶剂可以是质子的(常见于平衡反应)或质子惰性的(常见于动力学控制的反应)。标准合成技术(如反应副产物的共沸除去和使用无水反应条件(例如，惰性气体环境))是本领域中常见的并且在适当时应用。
保护基。术语“保护基”、“保护基团”或“pg”是指在与羟基或其他杂原子结合时阻止该基团处发生不期望的反应并且其可以通过常规化学或酶促步骤除去以恢复(reestablish)羟基的任何基团。所使用的特定可除去保护基团并不总是关键的，优选的可除去的羟基保护基团包括常规取代基，例如烯丙基、苄基、乙酰基、氯乙酰基、硫代苄基、亚苄基、苯甲酰甲基、甲基甲氧基、甲硅烷基醚(例如，三甲基甲硅烷基(tms)、叔丁基二苯基甲硅烷基(tbdps)或叔丁基二甲基甲硅烷基(tbs))以及可以在与产物的性质相容的温和条件下化学地引入到羟基官能团上并且随后通过化学或酶促方法选择性移除的任何其他基团。式(i)的r基还可以是如本文所述的保护基。
合适的羟基保护基是本领域技术人员已知的，并且更详细地公开于以下文献中：t.w.greene，protectinggroupsinorganicsynthesis；wiley：newyork，1981(″greene″)及其中引用的参考文献，以及kocienski，philipj.；protectinggroups(georgthiemeverlagstuttgart，newyork，1994)，其均通过引用并入本文。
可以使用通常已知和使用的保护基，并且任选地用于在合成过程中，即通过本发明方法制备化合物的途径或方法期间防止与被保护基团发生副反应。决定保护哪些基团、何时进行保护以及化学保护基“pg”的性质大多取决于待保护的反应的化学性质(例如，酸性、碱性、氧化性、还原性或其他条件)以及预期的合成方向。
如果化合物被多个pg取代，保护基未必是并且通常不是相同的。通常，使用pg来保护官能团(如羧基、羟基、硫代或氨基)，从而防止副反应或以其他方式促进合成效率。进行去保护以产生游离的去保护基团的顺序取决于预定合成方向和遇到的反应条件，可以如技术人员决定的以任何顺序进行。
可以保护本发明化合物的多个官能团。例如，-oh基(无论羟基、羧酸或其他官能团)的保护基包括“醚或酯形成基”。醚或酯形成基能够在本文陈述的合成方案中作为化学保护基来发挥作用。但是，如本领域技术人员理解的，一些羟基和硫代保护基不是醚或酯形成基。对于羧酸保护基以及酸的其他保护基的进一步详细描述，参见上文引用的greene的文献。这些基团例如但不限于酯、酰胺、酰肼等。
盐和溶剂合物
本文所述化合物的可药用盐在本发明的范围内，包括保留了期望的药理活性并且不是生物学上不期望的酸加成盐或碱加成盐(例如，盐不是过度毒性、变态原或刺激的，并且是生物可利用的)。当化合物具有碱性基(如氨基)时，可以与无机酸(例如，盐酸、氢硼酸(hydroboricacid)、硝酸、硫酸和磷酸)、有机酸(例如，藻酸盐、甲酸、乙酸、苯甲酸、葡糖酸、富马酸、草酸、酒石酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、萘磺酸和对甲苯磺酸)或者酸性氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)形成可药用盐。当本发明化合物具有酸性基(如羧酸基)时，其可以与金属(如碱金属和碱土金属(例如，na+、li+、k+、ca2+、mg2+、zn2+))、氨或有机胺(例如，二环己胺、三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺)或者碱性氨基酸(例如，精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸)形成盐。这样的盐可以在分离和纯化所述化合物期间原位制备或者通过其游离碱或游离酸形式的纯化合物分别与合适的酸或碱单独反应并且分离由此形成的盐来制备。
本文公开的许多分子包含一个或更多个可离子化基团[可以从其移除(例如，-cooh)或向其添加(例如，胺)质子或者可以被季铵化(例如胺)的基团]。所有可能的离子形式的这样的分子及其盐旨在单独包括在本公开内容内。至于本文所述化合物的盐，本领域技术人员可以从适合于制备本发明盐的多种可用抗衡离子中选择以用于给定应用。在特定应用中，用于制备盐的给定阴离子或阳离子的选择可导致该盐的溶解度增加或减小。
本文所述化合物的合适的盐的实例包括其盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、富马盐、酒石酸盐(例如，(+)-酒石酸盐、(-)-酒石酸盐或其混合物，包括外消旋混合物)、琥珀酸盐、苯甲酸盐以及与氨基酸(如谷氨酸)的盐。这些盐可以通过本领域技术人员已知的方法制备。还包括碱加成盐，例如钠、钾、钙、铵、有机氨或镁盐或者类似盐。当本发明化合物相对地包含碱性官能团时，可以通过使这样的化合物的中性形式与足量的期望酸(纯的或在合适的惰性溶剂中)接触来获得酸加成盐。可用盐酸加成盐的实例包括衍生自无机酸(如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸(monohydrogencarbonic)、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等)的那些盐，以及衍生自有机酸(如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等)的盐。还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及有机酸(如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等)的盐。本发明的某些特定化合物还可以包含酸性官能性和碱性官能性二者，其允许所述化合物转变成碱加成盐或酸加成盐。
本发明的某些化合物可以作为非溶剂合物形式和溶剂合物(包括水合物)形式存在。一般来说，溶剂合物形式和非溶剂合物形式等效，均包含在本发明的范围内。本发明的某些化合物可以以多晶体或无定形的形式存在。一般来说，对于本发明的预期用途来说，所用的物理形式是等效的，并且预期在本发明的范围内。
术语“溶剂合物”是指具有一个或更多个与其固体结构相关的溶剂分子的固体化合物。当化合物从溶剂中结晶时，可以形成溶剂合物。当一个或更多个溶剂分子在固化后成为固体晶体基质的主要部分时，形成溶剂合物。本文所述式的化合物可以是溶剂合物，例如乙醇溶剂合物。另一种类型的溶剂合物是水合物。同样地，“水合物”是指在分子水平上具有与其固体或晶体结构密切相关的一个或更多个水分子的固体化合物。当化合物在水中固化或结晶时可以形成水合物，其中一个或更多个水分子成为固体晶体基质的主要部分。本文所述式的化合物可以是水合物。
药物组合物
以下描述了与药物和药理学实施方案有关的信息，并且由普通技术人员可获得的本领域信息进一步补充。确切的制剂、施用途径和剂量可以由医生或临床医师个人根据患者的情况选择(参见，例如fingl等，inthepharmacologicalbasisoftherapeutics，1975，ch.1)。
应注意的是，由于毒性或器官功能障碍等，主治医师知道如何以及何时终止、中断或调整施用。相反地，如果临床响应不足，主治医师也知道如何将治疗调整到更高水平(根据或排除毒性方面)。目的病症管理中的施用剂量的量级可以随待治疗病症的严重程度和施用途径而变化。病症的严重程度可以例如通过标准预后评估方法来部分地评估。此外，剂量和可能的剂量频率也可以根据情况(如患者个人的年龄、体重和响应)而变化。与上文的讨论类似的程序也可用于兽医中。
根据治疗的特定病症以及所选择的靶向方法，这样的试剂可以全身性或局部性地配制和施用。用于配制和施用的技术可以见于alfonso和gennaro(1995)以及本领域的其他地方。
所述化合物可以与可药用载体、稀释剂或赋形剂组合来向患者施用。术语“可药用”是指在合理的医学判断范围内，与合理的收益/风险比相称的适合用于与人和动物的组织接触而无过多毒性、刺激、变态反应或者其他问题或并发症的那些配体、材料、组合物和/或剂型。
短语“可药用载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐类、缓冲剂、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料等材料及其组合，如本领域普通技术人员已知(参见，例如remington′spharmaceuticalsciences，第18版mackprintingcompany，1990，第1289-1329页，其通过引用并入本文)。除了不与活性成分相容的任何常规载体，预期了其在化学治疗组合物或药物组合物中的用途。
根据是否以固体、液体或气雾剂形式施用以及这样的施用途径(例如注射)是否需要灭菌，dnqd或dnq化合物可以与不同类型的载体组合。本发明可以静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、表面、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内(intravesicularlly)、经粘膜、心包内、脐带内(intraumbilically)、眼内、经口、经表面、局部、注射、输注、持续输注，通过导管、通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞，在脂质组合物(例如，脂质体)中，或通过其他方法，或如本领域普通技术人员已知的前述的任何组合(参见，例如，remington′spharmaceuticalsciences，第18版.mackprintingcompany，1990，其通过引用并入本文)。
向患者施用的本发明组合物的实际剂量可以由物理和生理因素决定，例如体重、病症的严重程度、被治疗疾病的类型、之前的或并存的治疗性干预、患者的自发病以及施用途径。无论如何，负责施用的医生将决定用于个体对象的组合物中活性成分的浓度和合适的剂量。
当然，当向对象施用时，有效量将取决于：被治疗的特定癌症；特定癌症的基因型；癌症的严重程度；个体患者参数，包括年龄、身体状况、体型和体重、同时进行的治疗、治疗频率和施用方式。这些因素是医生公知的，并且仅通过常规实验就能确定。在一些实施方案中，根据合理的医学判断，优选地使用最高的安全剂量。
在某些实施方案中，药物组合物可以包含例如至少约0.1％的dnqd或dnq化合物。在另一些实施方案中，活性化合物可以包含例如约2％至约75％的单位重量，或约25％至约60％，以及可从其推导出的任何范围。在另一些非限制性实例中，每次施用的剂量还可包括约0.1mg/kg/体重、0.5mg/kg/体重、1mg/kg/体重、约5mg/kg/体重、约10mg/kg/体重、约20mg/kg/体重、约30mg/kg/体重、约40mg/kg/体重、约50mg/kg/体重、约75mg/kg/体重、约100mg/kg/体重、约200mg/kg/体重、约350mg/kg/体重、约500mg/kg/体重，约750mg/kg/体重，至约1000mg/kg/体重或更多，以及可从其推导出的任何范围。在可从本文所列数值推导的范围的非限制性实例中，基于上述数值，可以施用约10mg/kg/体重至约100mg/kg/体重等。
在任何情况下，组合物可以包含多种抗氧化剂以阻止一种或更多种成分的氧化。此外，通过防腐剂(如多种抗细菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合)，可以实现对微生物作用的防止。
本文所述活性物(如dnqd或dnq化合物)可以配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。可药用盐包括由无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、或氢氧化铁或有机碱如异丙胺、三乙胺、组氨酸或普鲁卡因与游离羧基形成的盐。
用于经口使用的药物制剂可以如下获得：使活性化合物与固体赋形剂组合，任选地研磨所得混合物，以及在根据需要添加合适的辅料后加工颗粒混合物，以得到片剂或糖衣丸芯(drageecore)。合适的赋形剂特别是：填充剂，例如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制备物，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。若需要，可以添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。
糖衣丸芯任选地提供有合适的包衣。为此，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地包含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶(carbopolgel)、聚乙二醇和/或二氧化钛、亮漆溶液(lacquersolution)和合适的有机容易或溶剂混合物。染料或色素可以添加至片剂或糖衣丸包衣用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
在其中组合物是液体形式的实施方案中，载体可以是溶剂或分散介质，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、脂质(例如，甘油三脂、植物油、脂质体)及其组合。适当的流动性可以通过以下方式维持，例如使用包衣，如卵磷脂；通过分散在载体(如液体多元醇或脂质)中，保持所需的颗粒大小；使用表面活性剂，例如羟丙基纤维素(hpc)；或者这些方法的组合。在许多情况下，优选包含等张剂，例如糖类、氯化钠或其组合。
通过并入合适溶剂所需量的活性化合物与根据需要的多种上文列举的其他成分然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入到含有基础分散介质和/或其他成分的无菌载剂中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、分散体或乳剂的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥技术或冷冻干燥技术，其产生活性成分加上来自其之前的无菌过滤液体介质的任何另外期望成分的粉末。若需要，液体介质应当是适当缓冲的，并且在注射之前，首先用足够的盐或葡萄糖使液体稀释物等渗。
组合物在制备和储存条件下应当是稳定的，并且储存时应当抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用。因此，优选的组合物具有大于约5，优选的约5至约8，更优选的约5至约7的ph。应理解的是，内毒素污染应最低保持在安全水平，例如，小于0.5ng/mg蛋白质。
在一些特定实施方案中，通过在组合物中使用延缓吸收的试剂(例如单硬脂酸铝、明胶或其组合)，可以使可注射组合物具有延长的吸收。
用于体内施用的dnq化合物的制剂
通过lc-ms测量dnq在ph7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的水溶解度。将dnq在pbs中进行声处理(sonicate)30分钟，然后通过0.45μm注射器过滤器过滤除去未溶解的固体，并滤液通过lc-ms进行分析(λ＝275nm，负模式esi-tof)。通过将dnq声处理1、5、10和30分钟来确定最佳声处理时间。尽管1、5和10分钟之间的dnq溶液浓度大幅增加，但是10分钟和30分钟之间只有很小的差异。在30分钟声处理期间，将水浴升温到45℃(过滤前将样品冷却到室温)。通过将dnq在甲醇中溶解到500μm的浓度并且将该储液在80：20的水：甲醇中稀释产生1-100μm的校准曲线。所述校准曲线(通过uv吸光度测量)在该范围内是线性的；1μm接近于检测极限。测量dnq在pbs中的溶解度为115μm。溶液为非常浅的黄色。
由于dnq差的水溶解度，我们研究了使用常用赋形剂2-羟丙基-β-环糊精(hpβcd)来提高dnq的溶解度。在不存在hpβcd的情况下，dnq的溶解度在强碱溶液中显著提高，并且当ph返回到中性时dnq沉淀。但是，在足够量的hpβcd的存在下，当ph返回到中性时dnq并不沉淀。dnq在hpβcd中的这种相同的中性溶液不能直接制备(即，不进行ph调节)。这表明dnq化合物在碱中去质子，并且这种去质子的分子与hpβcd形成了紧密的复合物，其足够稳定以防止随着ph降低而质子化。dnq上唯一可以在含水碱中适当去质子化的质子是n-h。尽管未测量dnq的n-h键的酸度，但是已经测量了dnq的衍生物并且发现pka为8.0。
配制hpβcd中的dnq化合物的方案如下：将dnq化合物在ph7.4pbs中的20％hpβcd溶液中浆化，然后通过添加10mnaoh使ph升高以诱导dnq化合物的溶解。通过小心地添加1mhcl使ph返回到ph7.5至8.0。通过这种方法可以制备3.3mmdnq化合物的溶液，其稳定至少24小时。这代表与单独pbs相比dnq的溶解度提高30倍。我们最初选择20％hpβcd溶液。但是，我们发现，将β-lap配制成40％hpβcd溶液以用于人临床试验，并且我们利用dnq的试验表明dnq的浓度随着hpβcd的浓度线性提高，因此40％hpβcd溶液将允许产生6.6mmdnq和其他dnq化合物的溶液。
联合疗法
本文所述活性成分(例如，式(i)化合物)还可组合其他活性成分使用。这样的组合基于待治疗病症、成分的交叉反应性以及组合的药理学特性来选择。例如，当治疗癌症时，组合物可以与其他抗癌化合物组合(例如，紫杉醇或雷帕霉素)。
还可以使本发明化合物与一种或更多种其他活性成分在单一剂型中组合以用于向患者同时或按顺序施用。联合疗法可以作为同时或按顺序的方案实施。当按顺序施用时，组合可以在两个或更多个施用中施用。
联合疗法可以提供“协同效应”和“协同作用”，即当活性成分一起使用时取得的效果大于分别使用化合物的所得效果的总和。当活性成分如下时可以取得协同作用：(1)共配制以及在组合制剂中同时施用或递送；(2)作为分开的制剂交替或平行递送；或(3)以其他方案。在交替治疗中递送时，当在例如分开的片剂、丸剂或胶囊中或通过不同注射器中的不同注射按顺序施用或递送化合物时，可以获得协同作用。通常，在交替疗法中，按顺序(即，连续)施用有效剂量的每一活性成分，而在联合疗法中，一起施用有效剂量的两种或更多种活性成分。协同的抗癌作用表示大于组合中的单独化合物预期的纯粹叠加作用的抗癌作用。
联合疗法在美国专利no.6,833,373(mckearn等)中有进一步的描述，其包括添加可以与本文所述化合物组合的另外的活性剂，以及可以利用本文所述化合物治疗的另外的癌症和其他病症类型。
因此，本发明的一个方面是可用于与其他试剂或治疗方法(优选另一癌症治疗)组合的dnqd或dnq。dnqd或dnq可以通过间隔数分钟至数周在另一试剂治疗之前或之后。在向细胞分开施加其他试剂和表达构建体的实施方案中，通常要确保每次递送时间之间有意义的时间段没有流逝，以使得试剂和表达构建体将依然能够在细胞上发挥有利的联合作用。例如，在这种情况下，考虑了可使细胞、组织或器官以二、三、四或更多种形态基本同时(即，小于约1分钟内)与活性剂接触。在另一些方面，可以在施用活性剂之前和/或之后的以下时间内施用一种或更多种试剂：约1分钟、约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约9小时、约12小时、约15小时、约18小时、约21小时、约24小时、约28小时、约31小时、约35小时、约38小时、约42小时、约45小时，至约48小时或更久。在另一些实施方案中，可以在施用活性剂之前和/或之后的以下时间内施用试剂：约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约8天、约9天、约12天、约15天、约16天、约18天、约20天，至约21天。然而在一些情况下，可能希望显著延长治疗的时间段，此时单独施用之间间隔数星期(例如，约1、约2、约3、约4、约6或约8周或更久)。
向患者施用本发明的化学治疗组合物将根据施用化学治疗剂的一般方案进行，并考虑毒性(如有的话)。预计根据需要重复治疗周期。还预期可以将多种标准疗法或辅助的癌症疗法以及手术干预与所述活性剂组合来应用。这些疗法包括但不限于化学疗法、放射疗法、免疫疗法、基因疗法和手术。
化学疗法
癌症疗法还可以包括与基于化学和放射二者的治疗的多种联合疗法。联合的化学疗法包括使用化学治疗剂，例如顺铂、依托泊苷、伊立替康、camptostar、拓扑替康、紫杉醇、多西他赛、埃博霉素、泰索帝、他莫昔芬、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、替莫唑胺、环磷酰胺、sch66336、r115777、l778，123、bms214662、iressatm(吉非替尼)、tarcevatm(盐酸厄洛替尼)、egfr的抗体、gleevectm(伊马替尼)、甘乐能(intron)、阿糖胞苷、阿霉素、环磷酰胺、吉西他滨、尿嘧啶氮芥、氮芥、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三乙撑蜜胺、三亚乙基硫代磷胺(triethylenethiophosphoramine)、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲霉素、达卡巴嗪、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、喷托他丁(pentostatine)、长春花碱、长春新碱、长春地辛、博来霉素、阿霉素、更生霉素、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、光辉霉素、脱氧助间型霉素、丝裂霉素c、l-天冬酰胺酶、替尼泊苷、17α-炔雌醇、己烯雌酚、睾酮、泼尼松、氟甲睾酮、丙酸甲雄烷酮、睾内酯、醋酸甲地孕酮、甲基泼尼松龙、甲睾酮、泼尼松龙、去炎松、氯烯雌醚、羟孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、醋酸甲羟孕酮、亮丙瑞林、氟他胺、托瑞米芬、戈舍瑞林、卡铂、羟基脲、安吖啶、甲基苄肼、米托坦、米托蒽醌、左旋咪唑、诺维本(navelbene)、阿那曲唑、来曲唑、卡培他滨、reloxafine、droloxafine、六甲蜜胺、阿瓦斯汀、赫赛汀、百克沙、velcade、zevalin、三氧化二砷、希罗达(xeloda)、长春瑞滨、卟吩姆钠(porfimer)、erbituxtm(西妥昔单抗)、脂质体、噻替派、六甲蜜胺、美法仑、曲妥珠单抗、lerozole、氟维司群、依西美坦、氟维司群、ifosfomide、利妥昔单抗、c225、campath、卡铂、丙卡巴肼、二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲(nitrosurea)、更生霉素、道诺霉素、阿霉素、博来霉素、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素、依托泊苷(vp16)、他莫普芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫杉醇、吉西他滨、诺维本、法呢基蛋白转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春花碱和氨甲喋呤，或者前述物质的任何类似物或衍生变体。
放射疗法。另一些造成dna损伤并且已经广泛使用的因素包括通常所说的γ射线、x射线和/或直接递送放射性同位素到肿瘤细胞。还预期了其他形式的dna损伤因素，例如微波和uv辐照。最可能的是所有这些因素对dna、dna前体、dna的复制和修复以及染色体的装配和维持造成宽范围的损伤。x射线的剂量范围从以50至200伦琴的每日剂量持续延长的一段时间(例如，3至4周)到2000至6000伦琴的单剂量。放射性同位素变化的剂量范围非常宽，并且取决于同位素的半衰期、所发射辐射的强度和类型以及赘生细胞的摄取。当用于细胞时，本文使用的术语“接触”和“暴露”描述治疗构建体和化学治疗剂或放射治疗剂被递送到靶细胞或者直接与靶细胞并列放置的过程。为了达到细胞杀伤或停滞，将这两种试剂以有效杀伤细胞或阻止其分裂的组合量递送至细胞。
免疫疗法。免疫治疗通常依赖于免疫效应细胞和分子的应用以靶向和破坏癌细胞。免疫效应物可以是例如对于肿瘤细胞表面的一些标志物具有特异性的抗体。单独抗体可以充当治疗的效应物，或者其可以募集其他细胞来实际影响细胞杀伤。抗体还可以与药物或者毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白a链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并且仅充当靶向剂。或者，效应物可以是携带有与肿瘤细胞靶标直接或间接相互作用之表面分子的淋巴细胞。多种效应细胞包括细胞毒性t细胞和nk细胞。
因此，免疫疗法可以与基因疗法一起用作联合疗法的一部分。下面将讨论联合疗法的一般方式。一般来说，肿瘤细胞必定带有某负责靶向的标志物，即，不存在于其他大部分细胞上的标志物。存在许多肿瘤标志物，并且这些中的任何可适合于本发明背景下的靶向。常见的肿瘤标志物包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿肿瘤相关抗原、胎抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、tag-72、hmfg、sialyllewis抗原、muca、mucb、plap、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erbb和p155。
基因疗法。在另一个实施方案中，第二治疗是第二基因疗法，其中在第一化学治疗剂之前、之后或同时施用治疗性多核苷酸。结合编码基因产物的载体来递送化学治疗剂将对靶组织具有联合的抗增殖作用。
手术。约60％的患有癌症的人将进行一些类型的手术，包括预防性、诊断性或分期、治疗性及缓解性手术。治疗性手术是一种癌症治疗，其可以与其他疗法结合使用，例如本发明的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法。治疗性手术包括切除，其中将全部或一部分癌组织物理地移除、切除和/或破坏。肿瘤切除是指物理移除肿瘤的至少一部分。除了肿瘤切除之外，手术治疗包括激光手术、冷冻手术、电手术和显微控制的手术(mohs手术)。还预期了可将本发明与移除浅表癌、初癌或附带量的正常组织相结合来使用。
本领域普通技术人员将理解，在本发明的实践中，可以使用具体示例的那些以外的原材料、生物材料、试剂、合成方法、纯化方法、分析方法、测定方法和生物学方法，而不依赖于过度实验。任何这些材料和方法的所有本领域已知的功能等同物也旨在包括在本发明中。所使用的术语和表述被用作描述性术语而非限制性，这样的术语和表述的使用并未旨在排除示出和描述的特征或其一部分的任何等同物，但是应承认的是，在本发明要求保护的范围内，可能有多种修改。因此，应理解的是，尽管已经通过一些优选实施方案和任选特征示例性地公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文公开的理念进行修改和变化，并且这样的修改和变化也被认为在由所附权利要求限定的本发明的范围内。
以下实施例旨在举例说明以上发明，而不应解释为限制其范围。本领域技术人员将容易认为，实施例暗示了许多可以实施本发明的其他方式。应理解的是，可以进行许多变化和修改而依然保持在本发明的范围内。通过以下非限制性实施例可以更好地理解本发明。
方案和实施例中使用的缩写可能包括以下：
a549＝腺癌人肺泡基底上皮细胞
atp＝三磷酸腺苷
β-lap＝β-拉帕醌
dhe＝二氢乙锭
dnq＝脱氧尼博醌
dnqd＝脱氧尼博醌的任何类似物或衍生物
elisa＝酶联免疫吸附测定
h＝小时
h596＝[nci-h596]人肺腺鳞状癌细胞系
ht1080＝灵长类纤维肉瘤细胞系
ld50＝具有50％概率造成死亡的致死剂量
ld90＝具有90％概率造成死亡的致死剂量
ld100＝具有100％概率造成死亡的致死剂量
mcf-7＝人乳腺腺癌细胞系
mda-mb-231＝人乳腺癌细胞系
mia-paca2＝胰腺癌细胞系
mins＝分钟
nadh＝烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
nqo1＝nad(p)h：醌氧化还原酶1
nsclc＝非小细胞肺癌细胞
ocr＝氧消耗率
p53＝肿瘤阻抑蛋白
pc-3＝人前列腺癌细胞系
ros＝活性氧物质
±se＝标准误
sirna＝小干扰核糖核酸
shrna＝小发夹核糖核酸
μm＝微摩尔
nm＝纳摩尔
μmol＝微摩尔
实施例
实施例1.对于胰腺癌的肿瘤选择性治疗，碱基切除修复的抑制协同地增强β-拉帕醌介导的细胞死亡
用parp1抑制剂阻断dna碱基切除(ber)或ssb修复过程可以明显提高功效，并显著降低针对过表达nqo1+的癌症(如胰腺癌)的nqo1生物可活化药物的所需剂量。为了证明这些方法，体外进行了实验以从机理上示出，相比于nqo1-或shrna敲减的胰腺癌细胞，抑制ber或ssb修复与nqo1生物可活化药物对nqo1+胰腺癌细胞具有协同作用。此外，进行实验以优化meox或parp1抑制剂来增强nqo1生物可活化药物的体内功效。因此，联合疗法可作为使用dna修复抑制剂(例如，ber和parp1抑制剂)的肿瘤特异性方法。
本实施例证明了nqo1生物可活化药物对于胰腺癌以及其他过表达nqo1的癌症的肿瘤特异性功效，并且证明了目前受限的用于癌症疗法的“合成致死”方法以外的parp1抑制剂的“肿瘤特异性”。
检查了添加甲氧胺(meox)和β-lap对于过表达nqo1的胰腺癌细胞的协同作用。meox+β-lap协同作用导致：a.增加了亚致死剂量β-lap的致死性，减少了肩形区域(shoulder，dq)，提高了致死性(do)并且诱导nqo1+的凋亡(tunel+)，但是不诱导nqo1-miapaca-2胰腺癌细胞的凋亡；b.仅在肿瘤细胞中增加了dna损伤的形成；c.atp水平明显损失，并且很少恢复；以及d.明显阻抑糖酵解。因此，meox增强了parp1的超活化并且对β-lap的细胞杀伤具有协同作用。在shrna-xrcc1敲减细胞中观察到了类似结果。但是，ogg1敲减细胞具有对β-lap的抗性。在机理上，数据表明parp1检测meox-ap修饰位点或ssb，允许parp1超活化和对细胞死亡具有协同作用。因为meox是非毒性剂，所以试剂的组合可以提供用于治疗胰腺癌以及其他过表达nqo1的实体癌的疗法。
图1示出了与相关正常组织相比，胰腺瘤中nqo1和过氧化氢酶的表达。因此，与肿瘤组织相比，过氧化氢酶在正常组织中显著过表达。与正常组织相比，胰腺癌中nqo1：过氧化氢酶的比是nqo1生物可活化药物(如β-lap和dnq)之功效的主要决定因素(图2)。特别地，在高nqo1：过氧化氢酶比的存在下，nqo1生物可活化药物通过肿瘤特异性dna损伤来杀伤，从而诱导parp1超活化和独特的程序化坏死细胞死亡。肿瘤特异性致死性不依赖于p52状态、bax/bak损失、致癌基因活化状态、细胞周期状态和低氧。
nqo1是β-lap细胞毒性的主要决定因素，通过shrna-nqo1敲减来抑制nqo1的功能保护了在β-lap暴露后免于细胞死亡(图3)。β-lap诱导的dna损伤是nqo1依赖性和肿瘤特异性的，被nqo1shrna敲减显著降低(图4)。另外，nqo1生物可活化药物导致对糖酵解的明显抑制和atp的损失，其可抑制dna修复(图5)。
改变ber或ssb修复可以以肿瘤选择性方式增强nqo1生物可活化药物的功效。sirna介导的ogg1糖基化酶的敲减赋予β-lap治疗的胰腺癌细胞对β-拉帕醌的抗性(图6)，但是，nqo1生物可活化药物以肿瘤特异性方式造成ssb和碱基损伤，因此其可用于使dna修复抑制剂具有肿瘤选择性(图7)。parp1抑制剂与nqo1生物可活化药物具有协同作用以增强在nqo1+癌细胞(如胰腺癌细胞)中的功效(图8)。此外，nqo1生物可活化药物的致死性被meox增强，并且伴随着代谢作用(图9)。此外，β-拉帕醌对miapaca-2肿瘤异种移植物具有显著的抗肿瘤功效，如通过图10中示出的临床前研究数据说明。
因此，本实施例及其支持数据示出，nqo1生物可活化药物诱导dna碱基损伤和单链dna断裂，并且示出抑制碱基切除修复(ber)增强β-lap介导的胰腺癌选择性致死性。此外，抑制parp1活性增强β-lap对nqo1+胰腺癌的功效。最后，使用nqo1生物可活化药物(如图11之式的化合物和图12的特定化合物)，提供了对dna修复抑制剂的肿瘤选择性用途，并且nqo1生物可活化药物导致明显作用，例如阻抑葡萄糖代谢。
实施例2.dnq化合物和β-拉帕醌数据和疗法
与β-拉帕醌相比，ib-dnq(dnq-87；图12)以低得多的剂量作用，并且与母体dnq化合物的剂量相当。如图13中所示，其以nqo1依赖性方式对乳腺癌以及三阴性乳腺癌细胞有效。不同于β-拉帕醌(β-lap)，dnq87的功效以nqo1依赖性方式提高并且治疗窗较大(图14)。如图15中所示，dnq87造成细胞死亡，其可以被双香豆素、过氧化氢酶和bapta-am(钙螯合剂)阻断(a)，以降序并且符合提出的nqo1生物可活化药物造成的细胞死亡途径(b)。(c)通过par-parp1形成测量的dnq87暴露造成的parp1超活化，其通过μ-钙蛋白酶介导的p53切割(c)和细胞死亡期间parp1非典型切割成～60kda蛋白水解片段(d)来凸显。通过γ-h2ax、ser1981处atm的磷酸化和位点thr1892处的dna-pkc的磷酸化的监测，dnq87还以延迟的方式造成dna损伤(dna双链断裂)(图16)。这些数据还表明，dsb修复抑制剂还可用于增加dnq87。重要地，碱洗脱示出了大量的dna碱基损伤和dna单链断裂，而通过中性彗星实验评估的相同细胞未示出dna损伤。
在过表达nqo1的人乳腺癌细胞中，通过p-atm和p-h2ax监测的dsb形成被延迟，并且仅在parp1超活化后发生。ib-dnq(dnq-87；图12)造成大量h2o2形成，导致dna碱基和单链断裂，其被保护dna并且刺激碱基切除和dna单链断裂修复的parp1快速识别。只有当parp1被其超活化耗尽时，才能注意到dna双链断裂(参见图17)。图18示出了使用双香豆素在过表达nqo1的mcf-7人乳腺癌细胞中模拟正常组织的dnq87治疗窗。如图19所示，暴露于nqo1生物可活化药物造成大量的8-氧代鸟嘌呤水平，水平等于500μmh2o2暴露。优先检测8-氧代-鸟嘌呤(8-og)的糖基化酶ogg1的敲减导致对nqo1生物可活化药物(如β-拉帕醌)的明显抗性。a)β-拉帕醌暴露造成大量形成8-氧代鸟嘌呤。b，c)示出了两个单独的实验。使mia-paca2胰腺癌细胞暴露于sirna乱序或ogg1特异性的sirna24小时，然后用β-拉帕醌以指定的剂量处理细胞2小时。然后通过进行集落形成能力测定来测量存活，并且用所使用的β-拉帕醌剂量作图。
表达nqo1的细胞产生高水平的h2o2，其未被过氧化氢酶清除，这是因为其在癌细胞中降低的水平。相比之下，正常组织具有低nqo1水平，并且如果通过暴露于药物产生了h2o2，水平升高的过氧化氢酶清除这种试剂的专性(obligate)ros。因此正常组织受到保护(参见图2)。通过dnqβ-拉帕醌或其各自类似物产生的dna损伤的知识允许用于增加致死性的新的和不明显的策略。相反地，由于缺少肿瘤选择性，dna修复抑制剂通常是失败的。nqo1依赖性dna损伤仅在特定实体瘤中产生，导致特定dna碱基损伤(例如，8-氧代鸟嘌呤)，其通过无效dna修复过程导致parp1超活化。这种损伤的知识导致增加nqo1生物可活化药之肿瘤特异性致死性的两种单独策略：(a)使用dna无嘌呤/无嘧啶(ap位点)修饰剂(如甲氧胺(meox))，其目前处于临床试验中；和(b)使用parp1抑制剂，其阻止其超活化，但是也阻止癌细胞中dna单链的修复以及之后无效ber修复以及dna复制造成的dna双链断裂的修复。因为我们之前已经获得了数据表明parp1超活化是nqo1生物可活化药物的致死性所需的，所以抑制parp1活性以实现协同作用是意料之外的结果。通过增强的parp1超活化和通过(a)中使用meox的机制的程序化细胞死亡使细胞死亡，而通过b中使用parp1抑制剂概述的策略的正常凋亡使细胞死亡(参见图7)。
如图20中所示，甲氧胺增加β-拉帕醌诱导的致死性。a，向暴露于β-拉帕醌的细胞添加非致死剂量的甲氧胺(mx或meox)导致miapaca2胰腺癌细胞的协同致死性。b和c，甲氧胺(meox)是ap位点修饰化学物质，通过相对存活和atp损失测量其至＞100mm是无毒的。与nqo1生物可活化药物组合的最佳浓度为6-12mm。图21举例说明了原理研究的证据。a.甲氧胺(meox)增强miapaca2胰腺癌细胞中β-拉帕醌(β-lap)诱导的致死性。b.添加meox修饰了ap位点，并且因此降低了β-lap+meox暴露细胞中ap位点形成的信号。meox剂量为12mm，β-lap剂量为6μm。c，d.xrcc1是能够进行碱基切除修复(ber)的骨架蛋白。xrcc1的消除造成升高的ap位点和dna单链断裂，parp1可以在此结合并且变得活化/超活化。xrcc1的敲减(c)增加β-拉帕醌处理的致死性。
如图22中所示，添加无毒剂量的甲氧胺(meox)极大增强暴露于亚致死剂量的β-拉帕醌(2μm)的miapaca-2细胞中的dna损伤。a)通过添加无毒剂量的甲氧胺(meox)，通过γ-h2ax监测的dna双链断裂(dsb)被极大增加。meox，12mm；nqo1抑制剂双香豆素，50μm；β-拉帕醌剂量，指定或2μm。对于miapaca2细胞，2-2.5μm是亚致死的，6μm是致死的。h2o2剂量为500μm，24、时。所有处理持续24、时。将细胞用meox处理2×，作为2小时预处理，然后适当时与β-lap组合处理2小时。
甲氧胺的预处理和共处理阻止暴露于nqo1生物可活化药物(如β-拉帕醌(β-lap))的miapaca-2胰腺癌细胞中atp恢复响应(图23)。a，通过meox和xrcc1敲减阻止了atp恢复响应，推测通过增强的parp1超活化。b，向β-lap-处理的miapaca2细胞添加meox阻止了atp恢复。c，钙螯合剂bapta-am阻止meox协同的atp损失。以6μm使用bapta-am。d，添加meox增强了nad+损失，符合增强的parp1超活化。
添加甲氧胺(meox)阻止以致死剂量和亚致死剂量β-lap处理的miapaca-2细胞中的atp恢复响应(图24)。致死剂量的β-拉帕醌为6μm和4μm，而3.0μm和2.5μm是亚致死剂量的β-拉帕醌(β-lap)。
丙酮酸甲酯(mp)阻抑β-拉帕醌诱导的细胞死亡(图25)。尽管该作用可能是由于tca循环的恢复，mp也是显著的氧自由基(活性氧物质，ros)清除剂。
添加甲氧胺减弱了mp作用，推测是由于需要较少初始ros(h2o2)以产生不可修复的(以及meox修饰的)ap位点(图26)。β-lap剂量为指定的，以1或5mm使用mp，并且以12mm使用meox。
甲氧胺(meox)加速parp1超活化诱导的nad+/atp损失，进一步加速β-拉帕醌暴露的miapaca-2细胞中的修复(图27)。a.β-拉帕醌增加miapaca2细胞中的耗氧率(ocr)。致死剂量的β-lap造成明显的ocr峰，随后损失所有的代谢能力。亚致死剂量的β-lap造成随着时间ocr始终升高。这两种响应都是nqo1介导的。b.与亚致死剂量的β-lap组合地添加meox增加了ocr率，其类似于致死剂量的β-拉帕醌(4μm)，推测是由于parp1超活化造成的nad+和atp的损失。
nqo1生物可活化药物的处理阻抑了miapaca2细胞中的糖酵解(图28)。葡萄糖利用(a)和乳酸产生(b)二者均被阻抑。用12mm甲氧胺(meox)和dnq87共处理a549nsclc细胞2小时(图29)并且测量相对存活(如huang等，cancerres.，2012中)。
parp1的抑制增加了nqo1生物可活化药物的肿瘤选择性致死性。parp1抑制剂增加了nqo1生物可活化药物的致死性(图30)。将miapaca-2细胞用图30中所示抑制剂处理2小时，然后用dnq+抑制剂(全部为15μm)处理2小时。然后洗涤细胞并且使其生长7天，如huang等，cancerres.，2012，72(12)，3038-3047中所示评估相对存活，所述文献还提供了可并入到本文所述方法中的另外的可用方法和技术。除bsi-201以外的所有抑制剂均抑制par形成。进一步的分析示出bsi-201不是有效的parp1抑制剂，但是造成dna损伤，这是该抑制剂与nqo1生物可活化药物(dnq(示出的)或β-lap)具有协同作用的机理。图31示出了用于确定a549nsclc细胞中单独parp1抑制剂之非致死剂量的数据。图32示出了获得的parp1抑制剂ag014699的数据。
ag014699增加a549nsclc细胞中β-拉帕醌的nqo1依赖性致死性(图33)。a，对照以证明单独药物对brca1-/-capan-1细胞的合成致死性，而其他brac1野生型癌细胞(a549和miapaca-2细胞)完全抗parp1抑制剂。b，证明ag014699抑制响应于β-lap的parp1超活化。c，与β-lap组合的ag014699的协同致死性，其受到nqo1抑制剂双香豆素的阻止。d，与β-lap组合的ag014699的剂量响应，并且其通过添加双香豆素逆转。
parp1敲减增加三阴性mda-mb-231(231)乳腺癌细胞中β-拉帕醌的致死性(图34)。a.我们开发的稳定的parp1shrna敲减细胞(bentle等，jbc2006)。western印迹证明细胞表达或缺失nqo1中的稳定敲减。b.证明parp1敲减细胞中par-parp1形成的明显减少。注意到dna双链断裂比parp1野生型细胞中早得多地发生。c.在长期存活测定中，parp1敲减使细胞对β-lap变得敏感。尽管parp1敲减阻抑β-lap诱导的程序化坏死(bentle等，jbc2006)，长期结果是没有parp1的细胞不能修复由nqo1生物可活化药物(例如，β-lap)所产生的dna损伤，并且这些损伤转变成dsb，其最终通过规律的胱天蛋白酶介导的途径造成细胞死亡。d.向parp1敲减的231细胞添加ag014699并不显著增加其由β-lap诱导的致死性。除了bsi-201以外的所有parp1抑制剂表现出类似的响应。
mcf-7乳腺癌细胞中的parp1敲减也增加β-lap致死性(图35)。a、b.过表达nqo1的mcf-7细胞中parp1的敲减极大增加β-lap致死性。注意到双香豆素(dic)的nqo1抑制通过阻断nqo1生物活化来阻止协同作用。
用无毒剂量的β-lap+无毒剂量的ag014699处理的nqo1+h596nsclc细胞以切割的胱天蛋白酶-3形式示出凋亡迹象(图36)。sts星形孢菌素(1μm，1小时)作为阳性对照。活性形式的胱天蛋白酶3是印迹靠下的带。
parp1shrna稳定敲减增加了致死性(a)，但是由于parp1超活化的阻抑(损失)而阻抑atp损失(b)(图37)。
如图38中所示，β-lap诱导的atp损失被parp1shrna稳定敲减或添加ag014699所阻止，即使β-lap和parp1损失或抑制之间发生协同致死性。图39至42示出了miapaca-2中的研究以及一些dnq组合parp1抑制剂的数据。
图43示出了体内dc3胶束的药物代谢动力学分析和靶标评估。a，dc3和β-lap(由dc3转化)的血液浓度。使用两区室药物代谢动力学模型计算药物代谢动力学参数(例如，t1/2)。b，dc3和β-lap(由dc3转化)的肿瘤浓度。图44示出了体内dnq衍生物par-parp1的形成。下表2-1中示出了mdt初步研究数据。
表2-1dnq衍生物的最大耐受剂量(mtd)的初步研究。
nod/scid：每只小鼠中注射1百万个3ll-luc细胞，并且在iv两天后开始。
＊初步实验表明了在nod/scid中的新的实用mtd，iv，每隔一天1×，注射5次。
将a459nsclc细胞用15μmag014699处理2小时，然后如所指定的暴露于同样浓度的ag014699+多种浓度的dnq872小时(图45)。然后洗涤细胞使得没有药物并且如前所述进行相对存活测定(huang等，cancerres.，2012)。用无毒剂量的β-lap以这种方式处理的细胞表现出增强的dna损伤形成，相当于致死剂量的β-lap(8μm，2小时)形成的dna损伤(图46)。
过氧化氢酶比计算。图1示出了与相关正常组织相比，匹配的(n＝59)(a、b)以及分批的人胰腺肿瘤中的nqo1/过氧化氢酶水平。重要地，nqo1是“生物活性的”作为酶底物的dnq，β-拉帕醌及其类似物所需的，而过氧化氢酶是已知的可以针对这些药物进行保护的一种抗自由基清除酶。注意nqo1比在肿瘤组织中非常高，而在相关正常组织(e、h)中很低。图47示出乳腺癌肿瘤中nqo1/过氧化氢酶的比升高，但是在相关正常组织(c、f)中低。与相关正常组织相比，三阴性(er-，pr-和hr-)人乳腺癌细胞也具有升高的nqo1水平。图48示出与相关正常组织相比，非小细胞肺癌(nsclc)中nqo1水平也升高(n＝105)(a)，而过氧化氢酶在正常组织中升高且在nsclc肿瘤中被发现为较低的水平(b)。与相比于正常组织的胰腺癌和乳腺癌类似，肿瘤中nqo1/过氧化氢酶的比升高，而在正常组织中发现较低水平。注意在前列腺癌中nqo1的水平也升高(dong等，cancerres.，2010)，但是在该特定研究中未评估过氧化氢酶的水平。图49的数据提供了在人nsclc患者样品中，与正常组织相比肿瘤中nqo1/过氧化氢酶比的确认。
实施例3.药物剂型
以下制剂举例说明了可用于治疗性或预防性施用本文所述制剂的化合物(例如，dnq或dnq化合物，或者β-lap或β-lap衍生物)、本文具体公开的化合物、其可药用盐或溶剂合物或者本文所述化合物的组合(下文称为“化合物x”)的代表性药物剂型：
这些制剂可以通过药物领域中公知的常规过程来制备。应理解的是，上述药物组合物可以根据公知的药物技术改变以适应不同量和类型的活性成分‘化合物x’。气雾剂剂型(vi)可用于结合标准计量剂量喷雾器来使用。本文所述化合物还可以与递送系统(如纳米颗粒、胶束或脂质体)组合来递送。此外，特定成分和比例是为举例说明目的。根据目的剂型的期望特性，成分可以改变成合适的等同物，并且比例可以改变。
本文所使用的术语和表述被用作描述性术语而非限制性，这样的术语和表述的使用并未旨在排除示出和描述的特征或其一部分的任何等同方案，但是应承认的是，在本发明要求保护的范围内，可能有多种修改。因此，应理解的是，尽管已经通过一些优选实施方案、示例性实施方案和任选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文公开的理念进行修改和变化，并且这样的修改和变化也被认为在由所附权利要求限定的本发明的范围内。本文提供的特定实施方案是本发明的可用实施方案的实例，并且对于本领域技术人员来说明显的是，其可以使用本说明书示出的装置、装置组件、方法步骤的大量的变化形式来实施。本领域技术人员将承认，可用于本发明的方法和装置可以包括大量的任选组件和处理元件以及步骤。
尽管已经参考本发明的某些实施方案描述了本发明，但是其他实施方案也是可能的并且不脱离本发明。尽管本文的描述包括了许多特征，但是其不应解释为限制本发明的范围，而仅是提供了对本发明的一些当前的优选实施方案的举例说明。因此，所附权利要求的精神和范围不应限制于本文包括的任何特定实施方案的描述。在语言上或等效地落入权利要求的含义内的所有实施方案均旨在包括在权利要求中。此外，上述优点未必是本发明仅有的优点，并且未必预期利用本发明的每个实施方案将能够实现所有描述的优点。
贯穿本申请的所有参考文献例如专利文献(包括授予或授权的专利或等同方案)、专利申请公开和非专利文献或其他来源的资料均通过引用以其整体并入本文，如同分别地通过引用并入一样，其各自引用程度为至少部分地不与本申请的公开内容不一致(例如，对于至少部分不一致的参考文献，通过引用除了所述参考文献的部分不一致部分以外内容来并入)。本文引用的参考文献通过引用并入以指示其出版日或申请日以来的本领域状况，并且旨在使该信息在需要时可以用于本文以排除现有技术中的特定实施方案。例如，当一般性地要求保护化合物时，应理解的是，在本申请人的发明之前，本领域中已知的和可获得的化合物，包括在本文引用的参考文献中提供的能够授权的公开内容的化合物，均未旨在包括在本文要求保护的化合物之内。
鉴于可以应用本公开内容的原理的许多可能实施方案，应承认，举例说明的实施方案仅是本公开内容的实例，而不应解释为限制本发明的范围。相反，本公开内容的范围由所附权利要求限定。因此，我们要求这些权利要求的范围和精神之内的本发明的所有情况。
以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的一部分并入此处：
1.与以下试剂组合的nqo1生物可活化药物用于在具有癌细胞的患者中杀伤癌细胞或抑制癌细胞生长的用途：a)碱基切除修复(ber)酶抑制剂，b)聚(adp-核糖基)聚合酶i(parp1)抑制剂，或c)ap碱基修饰药物。
2.与第二试剂组合的nqo1生物可活化药物用于制备用于在具有癌细胞的患者中杀伤癌细胞或抑制癌细胞生长之药剂的用途，其中所述第二试剂是a)碱基切除修复(ber)酶抑制剂，b)聚(adp-核糖基)聚合酶i(parp1)抑制剂，或c)ap碱基修饰药物，其中所述药剂包含有效致死量或抑制量的所述nqo1生物可活化药物和所述第二试剂。
3.根据项1所述的用途，其中所述癌细胞具有错误的dna修复过程所造成的碱基切除修复(ber)缺陷或者脆弱性。
4.根据项3所述的用途，其中所述ber缺陷或脆弱性包括x射线交叉互补1基因/蛋白质/酶或xrcc1基因/蛋白质/酶的水平缺陷。
5.根据项1所述的用途，其中所述nqo1生物可活化药物与碱基切除修复(ber)酶抑制剂组合使用。
6.根据项1所述的用途，其中所述nqo1生物可活化药物与聚(adp-核糖基)聚合酶i(parp1)抑制剂组合使用。
7.根据项1所述的用途，其中所述nqo1生物可活化药物与ap碱基修饰药物组合使用。
8.根据项5所述的用途，其中所述nqo1生物可活化药物是β-拉帕醌或dnq化合物。
9.根据项6所述的用途，其中所述nqo1生物可活化药物是β-拉帕醌或dnq化合物。
10.根据项7所述的用途，其中所述nqo1生物可活化药物是β-拉帕醌或dnq化合物。
11.根据项1至5、7至8或10中任一项所述的用途，其中所述碱基切除修复(ber)酶抑制剂或所述ap碱基修饰药物是甲氧胺。
12.根据项1至10中任一项所述的用途，其中所述nqo1生物可活化药物是β-拉帕醌前药，例如dc-3或者其苯环类似物。
13.根据项1至10中任一项所述的用途，其还包括施用dna损伤剂。
14.根据项1至10中任一项所述的用途，其还包括另外的化学治疗剂或放射疗法。
15.根据项1至10中任一项所述的用途，其中所述癌细胞具有升高的nqo1水平。
16.根据项15所述的用途，其中所述癌细胞为实体瘤的形式。
17.根据项16所述的用途，其中所述癌细胞为非小细胞肺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞或结肠癌细胞。
18.根据项1所述的用途，其中所述nqo1生物可活化药物是图12中所示化合物。
19.根据项1所述的用途，其中所述nqo1生物可活化药物是：
或者其盐或溶剂合物。
20.根据项11所述的用途，其中所述nqo1生物可活化药物是：
或者其盐或溶剂合物。
21.根据项1所述的用途，其中所述nqo1生物可活化药物是β-拉帕醌，并且所述碱基切除修复酶抑制剂是甲氧胺。
22.根据项1所述的用途，其中所述nqo1生物可活化药物是dnq或dnq-87，并且所述碱基切除修复酶抑制剂是甲氧胺。
23.杀伤癌细胞或抑制癌细胞生长的方法，其包括使癌细胞与有效致死量或抑制量的nqo1生物可活化药物和碱基切除修复(ber)酶抑制剂的组合接触，从而杀伤所述癌细胞或抑制所述癌细胞生长。
24.杀伤癌细胞或抑制癌细胞生长的方法，其包括使癌细胞与有效致死量或抑制量的nqo1生物可活化药物和聚(adp-核糖基)聚合酶i(parp1)抑制剂的组合接触，从而杀伤所述癌细胞或抑制所述癌细胞生长。
25.杀伤癌细胞或抑制癌细胞生长的方法，其包括使癌细胞与有效致死量或抑制量的nqo1生物可活化药物和ap碱基修饰药物的组合接触，从而杀伤所述癌细胞或抑制所述癌细胞生长。
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