一种测算人体生物年龄的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种测算人体生物年龄的方法。

背景技术：

人的生长发育可用两个“年龄”来表示：即出生年龄（日历年龄）和生物年龄。生物年龄是人体健康状况的综合指数，是机体老化程度的客观表述。生物年龄一般与日历年龄不一致，它的确定有各种各样的方法和模式。例如：骨骼发育与人的生理成熟程度密切相关，骨龄是评估青少年生物年龄的重要指标之一；心肺系统的功能强烈依赖于人体的生物年龄，同时也反映着机体的健康状况；端粒体作为人体细胞染色体末端保护帽，直接反映细胞的衰老程度，也是生物年龄的重要指标之一。其中，骨龄只适用于青少年；而心肺系统功能受吸烟影响较大；端粒体长度是直接衡量体内细胞衰老程度的指标，适用面最广。

调查显示，目前中国主流城市的白领亚健康比例达76%，处于过劳状态的接近六成，真正意义上的“健康人”比例不到3%。35至50岁的高收入人群中，生物年龄超龄趋势明显加快，平均超过出生年龄10年左右。为了解身体真实衰老程度和亚健康水平，亟须解决生物年龄的测算问题。

现有技术中已有一些生物年龄测算技术，有些研究仅通过数据拟合得到方程作为所有个体计算生物年龄的依据，没有考虑到男女激素水平，重大疾病患者生理指标变化大等因素的影响；有些研究方案，只比较个体是生物年龄与出生年龄的差异就得出个体较为衰老或者年轻的结论，过于武断。综上，目前亟需一种能够较为客观、准确有效测算人体生物年龄的方法。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种测算人体生物年龄的方法，本发明方法能够较为客观、准确地测算人体生物年龄。

本发明的具体技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种测算人体生物年龄的方法，包括以下步骤：获得测算对象的端粒体绝对长度r，根据测算对象的性别和年龄对其进行分组，然后将r代入其所属性别和年龄段的模型中，获得生物年龄；所述模型根据测算对象的性别和年龄对其进行分组，每个分组设有对应的数据库和测试模型：n=(r-l)/k；

其中，n为测算对象的生物年龄；

r为测算对象的端粒体绝对长度；

斜率：

截距：

m为某性别某年龄段数据库的样本总数；i为编号；α为某编号对应样本的端粒体绝对长度；β为编号对应样本的生物年龄；

a为样本检测时的出生年龄；c为样本在后续持续跟踪检测中统计到的寿命，若无该样本的寿命信息，则使用该性别和年龄段的寿命平均值；v为样本中患有重大疾病的数量；i代表编号，bi表示某疾病的患病年限；d为数据库中某性别某年龄段样本寿命的中位值。

作为优选，所述重大疾病包括冠心病、肺功能疾病、肝功能疾病、肾功能疾病和肿瘤。

作为优选，所述m不小于500。

作为优选，不同性别和年龄段数据库的分组方法为：某一性别，对于出生年龄在0-20岁的人群，建立一个分组；对于出生年龄20岁以上的人群，每5岁进行一次分组。

第二方面，本发明提供了一种测算人体生物年龄的模型的构建方法，包括以下步骤：

1）dna杂交法检测数据库中每个样本的端粒体绝对长度。

2）实时荧光扩增pcr法检测数据库中每个样本的端粒体相对长度。

3）建立端粒体绝对长度和端粒体相对长度的换算模型和人群端粒长度数据库：统一步骤1）和步骤2）两种方法的测量结果，对于样本数量为n的群体，i为编号，根据二元加权线性回归法，建立端粒体绝对长度t关于端粒体相对长度l的标准曲线：

斜率：

截距：

拟合系数：

其中，s为所有li的平均值；q为所有ti的平均值，

该标准曲线用于筛选两种方法测试结果不一致的样本，并重新测试；最终采用拟合标准曲线r²>0.9的端粒体绝对长度，最终修正后的端粒体绝对长度重新记为α，建立不同性别各年龄段端粒体长度数据库。

4）建立生物年龄算法模型：

4.1）对数据库中不同性别和不同年龄段的人群进行分组，并计算数据库中每个样本在该年龄段时测得的生物年龄：

a为样本检测时的出生年龄；c为样本在后续持续跟踪检测中统计到的寿命，若无该样本的寿命信息，则使用该性别和年龄段的寿命平均值；v为样本中患有重大疾病的数量；i代表编号，bi表示疾病的患病年限；d为数据库中某性别某年龄段样本寿命的中位值；

4.2）分别对于不同性别不同年龄段的样本，某性别某年龄段数据库的样本总数为m，i代表编号，以样本的生物年龄β为权重，使用加权最小二乘法求生物年龄β关于样本端粒体绝对长度α的线性方程：

斜率：

截距：

最终测算人体生物年龄的模型为n=(r-l)/k；r为测算对象的端粒体绝对长度，n为测算对象的生物年龄。

作为优选，步骤1）中，端粒体绝对长度t计算公式为：

样本进行dna杂交法获得的荧光信号条带被两端marker的荧光信号条带分成了w个小方格，其中i是每一个小方格的编号，odi是小方格内化学发光信号总强度，li是小方格位置的maker分子量。

作为优选，步骤2）中：从实时荧光pcr仪中获得目标dna端粒体区段的扩增结果ct值为t0，标准品dna端粒体区段的扩增结果ct值分别为t1,t2,t3,t4,t5；目标dna单拷贝基因区段的扩增结果ct值为b0，标准品dna单拷贝基因区段的扩增结果ct值分别为b1,b2,b3,b4,b5。

对于标准品dna端粒体区段扩增结果，以ct值为权重，使用加权最小二乘法求ct值关于dna浓度对数值的标准曲线：

斜率：

截距：

上述公式中i为编号；ci为标准品dna的模板量；ti为对应模板量dna端粒体区段的扩增结果ct值。

计算目标dna端粒体相对浓度d1=e^[(t0-b1)/a1]，e为自然常数。

对于标准品dna单拷贝基因区段扩增结果，同样以ct值为权重，使用加权最小二乘法求ct值关于dna浓度对数值的标准曲线：

斜率：

截距：

上述公式中i为编号；ci为标准品dna的模板量；bi为对应模板量dna单拷贝基因区段的扩增结果ct值。

计算样本dna单拷贝基因相对浓度d2=e^[(b0-b2)/a2]，e为自然常数。

最终求得样本dna的端粒体相对长度l=d1/d2。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：

（1）本发明提供两种体细胞端粒提长度的检测方法，分别为dna杂交法（绝对长度）和dna实时荧光扩增法（相对长度），两种方案的同时实施有助于减少只用一种测量方法检测所产生的个体检测偏差，同时本发明还建立了两种检测方案之间端粒长度的换算模型。

（2）本发明方法对样本进行性别分类，并进行大量的样本检测，筛选和过滤离群样本，获得各性别各年龄段端粒体长度的置信区间，建立端粒体长度数据库。

（3）本发明将重大疾病纳入生物年龄预测模型的因素之一，本发明团队认为，重大疾病难以治愈，在较长一段时间内对患者的健康造成持续影响。本发明通过数据库大量数据证明，将重大疾病及其患病年限作为计算因子获得的生物年龄与端粒体长度有较好的线性关系，说明重大疾病是影响端寿命的重要原因之一。

（4）本发明能准确地测算人体生物年龄，有效反映人体衰老状况。

附图说明

图1为尼龙膜杂交后曝光成像图及imagej处理后图；

图2为imagej处理后样本各方块荧光信号强度数据；

图3为多次测试建立标准曲线统一两种方法测算的端粒体长度数值；

图4为数据库中女性31-35岁端粒体长度统计值以及变化趋势；

图5为数据库中男性55-60岁部分样本端粒体长度与生物年龄数据。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

总实施例

一种测算人体生物年龄的方法，包括以下步骤：获得测算对象的端粒体绝对长度r，根据测算对象的性别和年龄对其进行分组，然后将r代入其所属性别和年龄段的模型中，获得生物年龄；所述模型根据测算对象的性别和年龄对其进行分组，每个分组设有对应的数据库和测试模型：n=(r-l)/k；

其中，n为测算对象的生物年龄；

r为测算对象的端粒体绝对长度；

斜率：

截距：

m为某性别某年龄段数据库的样本总数（不小于500）；i为编号；α为某编号对应样本的端粒体绝对长度；β为编号对应样本的生物年龄；

a为样本检测时的出生年龄；c为样本在后续持续跟踪检测中统计到的寿命，若无该样本的寿命信息，则使用该性别和年龄段的寿命平均值；v为样本中患有重大疾病（冠心病、肺功能疾病、肝功能疾病、肾功能疾病和肿瘤）的数量；i代表编号，bi表示某疾病的患病年限；d为数据库中某性别某年龄段样本寿命的中位值。

作为优选，不同性别和年龄段数据库的分组方法为：某一性别，对于出生年龄在0-20岁的人群，建立一个分组；对于出生年龄20岁以上的人群，每5岁进行一次分组。

上述测算人体生物年龄的模型的构建方法包括以下步骤：

1）dna杂交法检测数据库中每个样本的端粒体绝对长度：端粒体绝对长度t计算公式为：

样本进行dna杂交法获得的荧光信号条带被两端marker的荧光信号条带分成了w个小方格，其中i是每一个小方格的编号，odi是小方格内化学发光信号总强度，li是小方格位置的maker分子量。

2）实时荧光扩增pcr法检测数据库中每个样本的端粒体相对长度：从实时荧光pcr仪中获得目标dna端粒体区段的扩增结果ct值为t0，标准品dna端粒体区段的扩增结果ct值分别为t1,t2,t3,t4,t5；目标dna单拷贝基因区段的扩增结果ct值为b0，标准品dna单拷贝基因区段的扩增结果ct值分别为b1,b2,b3,b4,b5。

对于标准品dna端粒体区段扩增结果，以ct值为权重，使用加权最小二乘法求ct值关于dna浓度对数值的标准曲线：

斜率：

截距：

上述公式中i为编号；ci为标准品dna的模板量；ti为对应模板量dna端粒体区段的扩增结果ct值；

计算目标dna端粒体相对浓度d1=e^[(t0-b1)/a1]，e为自然常数；

对于标准品dna单拷贝基因区段扩增结果，同样以ct值为权重，使用加权最小二乘法求ct值关于dna浓度对数值的标准曲线：

斜率：

截距：

上述公式中i为编号；ci为标准品dna的模板量；bi为对应模板量dna单拷贝基因区段的扩增结果ct值；

计算样本dna单拷贝基因相对浓度d2=e^[(b0-b2)/a2]，e为自然常数；

最终求得样本dna的端粒体相对长度l=d1/d2。

3）建立端粒体绝对长度和端粒体相对长度的换算模型和人群端粒长度数据库：统一步骤1）和步骤2）两种方法的测量结果，对于样本数量为n的群体，i为编号，根据二元加权线性回归法，建立端粒体绝对长度t关于端粒体相对长度l的标准曲线：

斜率：

截距：

拟合系数：

其中，s为所有li的平均值；q为所有ti的平均值，

该标准曲线用于筛选两种方法测试结果不一致的样本，并重新测试；最终采用拟合标准曲线r²>0.9的端粒体绝对长度，最终修正后的端粒体绝对长度重新记为α，建立不同性别各年龄段端粒体长度数据库。

4）建立生物年龄算法模型：

4.1）对数据库中不同性别和不同年龄段的人群进行分组，并计算数据库中每个样本在该年龄段时测得的生物年龄：

a为样本检测时的出生年龄；c为样本在后续持续跟踪检测中统计到的寿命，若无该样本的寿命信息，则使用该性别和年龄段的寿命平均值；v为样本中患有重大疾病的数量；i代表编号，bi表示疾病的患病年限；d为数据库中某性别某年龄段样本寿命的中位值。

4.2）分别对于不同性别不同年龄段的样本，某性别某年龄段数据库的样本总数为m，i代表编号，以样本的生物年龄β为权重，使用加权最小二乘法求生物年龄β关于样本端粒体绝对长度α的线性方程：

斜率：

截距：

最终测算人体生物年龄的模型为n=(r-l)/k；r为测算对象的端粒体绝对长度，n为测算对象的生物年龄。

实施例1

1）dna杂交法检测端粒体绝对长度

步骤一、基因组酶切。在200μl微量离心管中加入：5ug的dna样品并补水至17μl，3μl限制性内切酶（hinfi、rsai，10u/ul），5ul5x酶切缓冲液。然后加一滴矿物油覆盖，稍离心后置于56℃水浴3小时。

步骤二、电泳。样本分别取8ul与2ul的5x上样缓冲液均匀混合，4ul含地高辛标记的marker（200-20000bp），12ul无核酸酶水，4ul上样缓冲液均匀混合。样本与marker均取10ul上样，marker加在样品泳道两侧。

加入1xtae缓冲液后，以5v/cm运行凝胶，直到溴酚蓝色跟踪染料与起始孔分离约10cm（总时间2-4小时）。

步骤三、将凝胶浸没在0.2m的盐酸溶液（溶液2）中进行脱嘌呤处理，并在15至25℃下浸泡5-10分钟，直到胶内溴酚蓝染色变为黄色。

用无菌水冲洗凝胶两次后将凝胶浸没在0.1m的氢氧化钠溶液中，在15至25℃下摇床2×15分钟，接下来再重复上次操作1次。

取一磁盘架上一洗净玻璃板，在磁盘中倒入适量的转膜缓冲液（20xssc），在玻璃板搭成盐桥。依胶大小裁好尼龙膜，做好标记，正面向下，紧贴于胶上，防止有气泡产生，接着两张同样大小的滤纸。然后再堆积若干吸水纸，最后上方放置一块玻璃板，板上加一500g左右的重物。转膜16-20小时后，将尼龙膜取下，胶染色，观察转膜效果。将膜用2xssc浸泡20分钟，滤纸吸干尼龙膜上液体后放在烘箱中烘2小时（80℃）。

步骤四、预杂交。启动杂交炉，杂交管装入杂交液20ml并预热至42℃。尼龙膜完成2小时烘烤后用2×ssc浸泡，完成浸泡后将尼龙膜装入含有预热杂交液的管中以42℃预杂交30-60分钟，进行封膜处理，期间杂交炉温和转动保证尼龙膜完全封闭。

步骤五、杂交。另以同样温度预热5ml杂交液，并加入1ul端粒体探针。待尼龙膜完成预杂交后，向杂交管内再加入含有端粒体探针的杂交液在42℃下温和搅拌杂交孵育3小时。

步骤六、洗膜。取出尼龙膜，在2xssc溶液中漂洗5min，然后按照下列条件洗膜：

用洗涤缓冲液i（2xssc/0.1%sds）洗涤膜两次（每次在15至25℃下温和搅拌洗涤5分钟）；

用预热的洗涤缓冲液ii（0.2×ssc/0.1%sds）在热水浴（每次在50℃下温和搅拌15-20分钟，每次洗涤15-20分钟）中洗涤膜两次；

在100ml1x洗涤缓冲液（500ml灭菌的马来酸缓冲液中加1.5ml的tween－20再过滤得到）中温和搅拌，冲洗1-5分钟；

在100ml新鲜制备的1x封闭液（1x顺丁烯二酸缓冲液10倍稀释10x封闭溶液得到）中孵育，在15至25℃下温和搅拌30分钟；

用50-100ml含有地高辛抗体的1x封闭溶液中孵育，在15至25℃下温和搅拌30分钟；

用1x洗涤缓冲液（100ml/次）洗涤膜两次（在15至25℃下轻轻搅拌2x15分钟）；

用100ml1x检测缓冲液（称取tris－base3.0285g，氯化钠1.461g，加水溶解，用1m盐酸调节ph值至9.5，定容至250ml。121℃灭菌20min）孵育膜2-5分钟。

步骤七、膜显像。丢弃检测缓冲液，通过将膜的dna面朝上放置在吸水纸上，从膜上除去多余的液体，但不要让膜干燥。然后立即将湿膜，dna面朝上放置在打开的杂交袋上，并快速滴加约40滴（约3ml）底物溶液，在15至25℃下孵育膜5分钟。

显像仪提前打开对镜头进行预冷，当膜完成孵育后，将膜置于镜头下显影对样本进行成像。

步骤八、端粒体长度计算。

计算方法：绝对端粒体长度根据以下公式定义：

样本进行dna杂交法获得的荧光信号条带被两端marker的荧光信号条带分成了w个小方格，其中i是每一个小方格的编号，odi是小方格内化学发光信号总强度，li是小方格位置的maker分子量。该公式考虑了来自较大荧光印迹的较高信号强度，这是由于端粒特异性杂交探针导致的多重杂交引起的。

使用imagej软件对样本进行信号处理并计算样本端粒体长度，操作流程如下：

用网格覆盖扫描图像的每个样品通道（图1）。网格的各个方块的高度决定了绝对端粒体长度计算的分辨率。通常，建议每个泳道使用30个方格左右。

对于背景扣除，在每个泳道中选择几个网格，把没有找到端粒特异性信号的网格代表该泳道中的背景。来自这些正方形的信号应被平均并从每个含有端粒dna的正方形中减去。

对于每个含有端粒dna的正方形，确定信号（odi）和相应的长度li，其中odi是该正方形内的总信号强度，li是在该正方形的中点处的分子量。

使用公式计算绝对端粒体长度。

依照上述方法对图例样本进行数据分析，得到以下各种样品的绝对端粒体长度：样品1：7.05kbp，样品2：3.62kbp，样品3：4.21kbp,样品4：10.22kbp（如图2所示）。

2）实时荧光扩增pcr法检测端粒体相对长度

步骤一、使用nanodrop对dna样本模板量进行定量，再将dna样本稀释至c3模板量左右，并同时稀释梯度模板量分别为c1、c2、c3、c4、c5的dna标准品，置于pcr仪中以95℃变性10min。

步骤二、将dntps、引物、dna聚合酶、荧光染料、扩增反应促进剂等试剂按一定比例混合获得扩增缓冲液。

步骤三、将待测样本与扩增缓冲液在96孔反应板或384孔反应板上充分混合。

步骤四、使用实时荧光定量pcr仪设置扩增程序，对反应板中基因组dna的端粒体区段进行扩增。

步骤五、重复步骤四，对基因组dna中的一个单拷贝基因区段进行扩增。

步骤六、分析扩增反应结果，计算相对端粒体长度：

反应完成后从实时荧光pcr仪中获得目标dna和标准品dna端粒体区段扩增结果ct值分别为：t0,t1,t2,t3,t4,t5；单拷贝基因区段的扩增结果ct值分别为:b0,b1,b2,b3,b4,b5。

对于标准品dna端粒体区段扩增结果，以ct值为权重，使用加权最小二乘法求ct值，关于dna浓度对数值的标准曲线：

斜率：

截距：

上述公式中i为编号；ci为标准品dna的模板量；ti为对应模板量dna端粒体区段的扩增结果ct值；

计算目标dna端粒体相对浓度d1=e^[(t0-b1)/a1]，e为自然常数；

对于标准品dna单拷贝基因区段扩增结果，同样以ct值为权重，使用加权最小二乘法求ct值关于dna浓度对数值的标准曲线：

斜率：

截距：

上述公式中i为编号；ci为标准品dna的模板量；bi为对应模板量dna单拷贝基因区段的扩增结果ct值；

计算样本dna单拷贝基因相对浓度d2=e^[(b0-b2)/a2]，e为自然常数；

最终求得样本dna的端粒体相对长度l=d1/d2。

按上述检测方法进行实验操作，设定dna标准品模板量分别为18ng、9ng、4.5ng、2.25ng、1.125ng、0ng（阴性控制）的标准曲线，dna样本经浓度测定稀释后加入模板量均为4.5ng。经pcr扩增得到达到荧光信号阈值时各样本的循环数（ct值），通过标准曲线性拟合后带入样本数据计算得到样本单拷贝基因/端粒体的相对浓度，两数据比值即为该样本的端粒体相对长度。

3）建立端粒长度换算模型和人群端粒长度数据库

步骤一：统一两种方法的测量结果。对于样本数量为n的群体，i为编号，根据二元加权线性回归法，建立端粒体绝对长度t关于端粒体相对长度l的标准曲线：

斜率：

截距：

拟合系数：

其中，s为所有li的平均值；q为所有ti的平均值，

该标准曲线用于筛选两种方法测试结果不一致的样本，并重新测试。

最终采用拟合标准曲线r²>0.9的端粒体绝对长度，最终修正后的端粒体绝对长度重新记为α，建立不同性别各年龄段端粒体长度数据库（如图3所示，其中，r1²为第一次测试结果的拟合系数，r2²为过滤后重测结果的拟合系数。r1²=0.7899，r2²=0.9036）。

步骤二：跟踪30年收集数千余份中国地区各年龄段不同性别人群不同年龄阶段的生物样本，并精确测定其端粒体长度，建立黄种人端粒体长度数据库。数据库中女性31-35岁年龄段端粒体长度统计值如图4所示。

4）建立生物年龄算法模型

步骤一：对于出生年龄20岁以上的人群，以5岁来分组（男性0-20岁、男性20-25岁、…、男性60-65岁；女性0-20岁、女性20-25岁、…、女性60-65岁；单个分组样本总数大于500）根据数据库人群的寿命和相关疾病计算每个样本在该年龄段时测得的生物年龄β。

以男性20-25岁为例，a为样本检测时的出生年龄；c为样本在后续持续跟踪检测中统计到的寿命，若无该样本的寿命信息，则使用该性别和年龄段的寿命平均值；v为样本中患有重大疾病的数量；i代表单个疾病编号，bi表示疾病的患病年限；d为数据库中某性别某年龄段样本寿命的中位值。以该年龄段样本寿命的中位值d为权重，使用多元加权线性回归标准误差的算法计算该样本的生物年龄：

步骤二：分别对于不同性别每个年龄段的样本，样本总数为m，以样本的生物年龄β为权重，使用加权最小二乘法求生物年龄β关于样本端粒长度α的线性方程：

斜率：

截距：

实际测算对象的端粒体绝对长度为r，则求得其生物年龄n=(r-l)/k。

以数据库中的两个样本为例，检测端粒体长度，统计的疾病和寿命数据以及计算获得的生物年龄如下表所示：

为了验证本发明模型的准确性，以男性55-60岁样本为例，数据库中男性55-60岁部分样本的端粒体长度与出生年龄和生物年龄的关系如图5所示（其中，r3²为样本端粒体长度与出生年龄的拟合系数，r4²为样本端粒体长度与生物年龄的拟合系数。r3²=0.0024，r4²=0.9051）。可见：单看出生年龄与端粒长度的关系，基本呈散乱分布，线性趋势不明显；而使用本发明例的模型计算的生物年龄与所测端粒体长度变化趋势吻合线性关系，即：随着生物年龄变大，端粒体长度逐渐缩短。因此，使用本发明能通过检测端粒体长度准确测算人体生物年龄，有效评估样本的衰老程度。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。