铁死亡抑制剂Liproxstatin-1在制备治疗脑外伤药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种铁死亡抑制剂liproxstatin-1在制备治疗脑外伤药物中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术：

脑外伤(tbi)是青年患者死亡和长期残疾的重要原因，具有高发生率、高死亡率和高致残率的突出特点。尽管随着科学技术与诊疗的不断发展，临床采用众多手段(如手术治疗、降颅压与抗惊厥等)对tbi加以干预，但仍无法阻止继发性脑损伤的发生发展，有效的治疗方法和手段相当匮乏，尤其是缺乏药物治疗手段，严重影响患者预后。因此，充分研究脑外伤后的病理生理变化以期寻求更好的药物治疗手段已经显得刻不容缓。

铁死亡(ferroptosis)是近年来发现的一种铁依赖性氧化损伤引起的细胞死亡方式。它在形态学、生化与遗传学上均不同于自噬、凋亡、坏死程序性坏死、焦亡等细胞死亡方式，但可特异性被铁离子螯合剂抑制，故而得其名。铁死亡的启动不依赖于caspase-3(介导凋亡的重要介质)、r1p1或r1p3(介导程序性坏死的重要介质)、caspase-1或capsase-11(介导焦亡的重要分子)，但它具有线粒体皱缩的形态特征，表现为胞内铁离子与脂质活性氧簇的积累等。有些重要的蛋白或酶参与了铁死亡的发生过程，包括：胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白系统(xct)、谷胱甘肽过氧化物酶4(gpx4)、铁蛋白轻链1(fth1)、膜铁转运蛋白(ferroportin，fpn)、nadph氧化酶2(nox2)和nrf2等。

研究表明，铁死亡涉及多种人类疾病，在神经退行性疾病和脑损伤研究中发现许多含有与铁和/或氧化应激的病理细胞死亡事件的描述，因此，揭示铁死亡发生发展过程及分子机制对寻找脑外伤药物治疗方法具有重要意义。但目前鲜有文献报道铁死亡与脑外伤的关系，尤其是铁死亡在脑外伤模型中的作用机制尚不清楚。

铁死亡是一种依赖于铁和活性氧(ros)水平的调节性细胞死亡方式，表现为脂质过氧化的特征。当细胞的内源性抗氧化状态受损时，引起脂质毒性ros积累破坏膜结构进而导致铁死亡。因此，氧化应激与细胞内抗氧化水平作为脂质过氧化的重要调节剂，进而诱导这种细胞死亡方式的发生。目前发现一些亲脂性抗氧化剂可作为避免铁依赖性脂质过氧化的一种补救措施，包括维生素e、liproxstatin-1以及其他可能有效的生物活性多酚物质。尽管维生素e是天然的自由基捕获抗氧化剂(rta)，但其效果却不如从高通量筛选库中鉴定出的芳香族化合物liproxstatin-1。

在gpx4基因敲除(ko)小鼠中，腹腔注射liproxstatin-1(10mg/kg)可减轻缺血/再灌注引起的肝损伤。liproxstatin-1也可保护小鼠免受缺血性脑损害，以及缺血再灌注引起的肠损伤。

因此，liproxstatin-1是一种有效的铁死亡抑制剂。至今为止，铁死亡在脑外伤中的作用机制还不清楚，尚无liproxstatin-1在脑外伤治疗方面的报道，尤其是其对脑外伤引起的脑水肿、血脑屏障通透性与焦虑认知功能障碍的影响。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明采用一种铁死亡抑制剂liproxstatin-1于脑外伤后1h腹腔给药。探讨liproxstatin-1对脑水肿、血脑屏障通透性和神经功能(运动、学习记忆与焦虑认知)障碍的影响，并探讨其可能的作用机制。

本发明的第一个目的是提供一种铁死亡抑制剂liproxstatin-1在制备治疗脑外伤药物中的应用。

进一步地，所述的治疗脑外伤药物为治疗脑水肿的药物。

进一步地，所述的治疗脑外伤药物为治疗血脑屏障通透性的药物。

进一步地，所述的治疗脑外伤药物为改善脑外伤引起的运动与学习记忆障碍的药物。

进一步地，所述的治疗脑外伤药物为改善脑外伤引起的焦虑和认知功能的药物。

进一步地，所述的治疗脑外伤药物为逆转脑外伤引起fth1与nrf2上调以及nox2表达下调的药物。

进一步地，所述的治疗脑外伤药物剂型为胶囊剂、片剂、口服制剂、微胶囊制剂或注射剂。

进一步地，所述的铁死亡抑制剂liproxstatin-1用于治疗脑外伤的剂量为5-15mg/kg。

进一步地，所述的铁死亡抑制剂liproxstatin-1的分子式为：c19h21cln4，分子量为340.85，ic50值为22nm。

进一步地，所述的铁死亡抑制剂liproxstatin-1的结构式为：

本发明的有益效果：

本发明公开与系统阐明了脑外伤后铁死亡相关蛋白表达与铁沉积发生的时程变化过程(从6h至14d)；同时采用铁死亡抑制剂liproxstatin-1于脑外伤后1h腹腔给药，证明了liproxstatin-1可减轻脑外伤引起的脑水肿与血脑屏障通透性；发现了liproxstatin-1对脑外伤引起的运动与学习记忆障碍具有改善效果；证明了liproxstatin-1可显著改善tbi引起的焦虑和认知功能；此外，揭示了liproxstatin-1的保护效果与逆转tbi引起fth1与nrf2上调以及nox2表达下调有关；本发明为利用liproxstatin-1作为治疗颅脑损伤的一种新型药物提供了依据。本发明研究发现一种铁死亡抑制剂liproxstatin-1的新用途：liproxstatin-1可减轻脑水肿，改善脑外伤引起的焦虑和认知功能，为脑外伤的治疗提供了新的思路，特别是对相关药物研发提供了基础。

附图说明

图1是小鼠tbi后皮质组织中的铁死亡相关蛋白表达时程改变的测试结果。

图2是小鼠tbi后脑组织中铁沉积时程改变的测试结果。

图3是脑水肿程度测量与伊文斯蓝染色的结果，以找出liproxstatin-1(以下简称为lip-1)的最佳治疗浓度以及lip-1对血脑屏障的影响。

图4是lip-1对小鼠tbi后运动与学习记忆功能障碍的影响。

图5是lip-1对小鼠tbi后焦虑和认知功能障碍的影响。

图6是lip-1对小鼠tbi后皮质组织中fth1、nox-2与nrf2表达的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明以下实施例中所涉及的分子生物学和行为学实验包括：

(1)免疫印迹实验：将分离提取的脑组织加入到含有蛋白酶抑制剂的裂解液中超声裂解，离心，匀浆后提取上清，然后利用bca测量蛋白浓度，每孔上样等量60μg蛋白样品，利用sds-page凝胶电泳分离各蛋白。然后将分离胶上的蛋白转到pvdf膜上，并将转有蛋白的pvdf膜孵育在含抗体的5％bsa稀释液体中4℃过夜，第二天经三次洗膜后，将pvdf膜室温孵育于二抗中2h。经三次洗膜后应用ecl化学发光系统检测蛋白条带，最后扫描蛋白条带，并使用imagej分析蛋白条带的灰度值。

(2)改良的perl铁染色：检测脑组织中铁的积累与分布情况。将脑组织切片浸入蒸馏水中3分钟，后放置含5％亚铁氰化钾的perl溶液中温育30分钟。使用含0.3％过氧化氢的甲醇溶液来封闭内源性过氧化物酶活性15分钟后，在pbs中洗涤三次。然后在dab中温育2分钟并使用苏木精复染。

(3)脑组织含水量测定：tbi后72h将小鼠麻醉后断头处死，去除小脑及臭球，取损伤侧半球脑组织，测湿重后，放入烤箱内(100℃)烘干24小时后重复测定至恒重。按公式脑组织含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重×100％。以脑组织水含量代表脑水肿的程度。

(4)血脑屏障通透性改变的测定：伊文思蓝(evansblue，eb)作为测量血脑屏障通透性的示踪剂。小鼠处死前1h均从尾静脉注射2％伊文氏蓝(2ml/kg)。术后72h，用生理盐水对小鼠进行心脏灌流，以除去未结合的染料，断头处死，迅速取脑，将其放入培养皿中，以防水分蒸发。分成出血半球和非出血半球区，称重，放入盛有3ml甲酰胺的试管中，加上橡皮塞，60℃水浴中(避光)抽提48h。加温1h后需用细棒将浮在上面的脑组织轻轻压沉，以便脑组织中eb能充分溶解出来。匀浆液于12000g，4℃，离心20min，取200μl上清液于96孔板中，于620nm处测定吸光度。按公式计算脑组织eb含量：脑组织eb含量(μg/g脑湿重)＝标准品eb含量(μg/ml)×甲酰胺量(ml)÷脑湿重(g)，求出脑组织中eb含量，以eb含量(μg/g脑湿重)代表bbb通透性的改变

(5)运动功能实验:采用运动评分(motortest)的方法于tbi后19-16天开展实验，抓住小鼠尾巴使其抓住绳索，分别从左方、右方与前方3个方向重复操作3次，两名实验人员均按照0～5评分标准进行评分，记录分数并计算平均分。

(6)水迷宫实验:在术前三天训练待测小鼠，并于tbi后9-16天开展正式实验。电脑将自动记录每只小鼠到达平台的潜伏期与轨迹，若90s小鼠未能找到平台者，可将其引至平台并保持30s以加强记忆。

(7)旷场实验：是评价实验动物在新异环境中自主行为、焦虑样情绪、探究行为与紧张度的一种方法。由于胆小的动物本性，小鼠在旷场箱内本能的靠近箱壁活动，又由于兴奋性，大鼠在适应的环境中表现为行动活跃，四处走动，因此又可以将其在中央区的活动作为其焦虑性的一个考察指标。以实验动物在新奇环境之中某些行为的发生频率和持续时间等反映实验动物在陌生环境中的自主行为与探究行为，以尿便次数反映其紧张度。在tbi后第17天进行开放旷场实验。将小鼠从其鼠笼中移出，放置在透明的有机玻璃追踪场所中进行观察。录像记录并通过软件分析5分钟内小鼠的运动总距离、平均速度、活动次数、休息时间和活动时间。

实施例1：

(1)药物配制与给药方式：参考前期研究基础与预实验结果，将lip-1(targetmol公司，货号：t2376)配制成3个浓度：5mg/kg、10mg/kg与15mg/kg。配制方法为：根据说明书，将lip-1溶解在dmso中，然后采用医用生理盐水配制至所需浓度。lip-1在tbi后1h通过腹膜注射给药，每天给药一次，直至处死前一天。

(2)动物分组：有以下五种情况：①tbi后蛋白时程变化实验，将6周龄icr小鼠随机分为八组，每组5只，分别为：sham、6h、12h、1d、2d、3d、7d和14d。②铁沉积perl铁染色实验，将6周龄icr小鼠随机分为七组，每组5只，分别为：sham、6h、12h、1d、3d、7d和14d。③脑组织含水量测定实验，将6周龄icr小鼠随机分为五组，每组6只，分别为：sham、vehicle、5mg/kglip-1、10mg/kglip-1和15mg/kglip-1。④血脑屏障通透性改变的测定与免疫印迹实验，将6周龄icr小鼠随机分为三组，每组5只，分别为：sham、vehicle、lip-1(10mg/kg)。⑤行为学测试实验，将6周龄icr小鼠随机分为三组，每组8只，分别为：sham、vehicle、lip-1(10mg/kg)。vehicle组小鼠于tbi后1h腹腔注射生理盐水，每天注射一次，直至处死前一天。。

(3)小鼠tbi模型建立步骤如下：选用健康雄性icr小鼠(体重20-25克)，用4％水合氯醛(3.5mg/g)腹腔麻醉，固定于立体定位仪上采用无菌技术进行后续操作。取头正中切口，切口长约1cm，剥离左侧顶骨骨膜。使用颅骨钻钻一骨窗(直径5mm)，确保骨瓣中心位于前囟后3.0mm与左2.7mm，暴露硬脑膜并使其完整。然后使用国际公认的动物脑皮质定量打击系统(美国amscieninstruments公司)，能够使不同压力的压缩空气瞬间冲击脑皮质，建立不同程度tbi损伤模型。

(4)对各组小鼠进行相关试验测试，测试结果见图1至图6所示。

(5)图1反映了各组小鼠在颅脑损伤后不同时间点的铁死亡相关蛋白表达的时程变化，图1a为xct、gpx4、fth1、nox2与fpn的蛋白条带，图1b为上述五种蛋白表达的统计图。结果表明，脑外伤后铁死亡相关蛋白表达均呈时程性改变，其中xct与fpn蛋白表达在tbi后12h达到高峰，gpx4与nox2于1d达高峰，而fth1于3d达到表达高峰。

(6)图2是各组小鼠在颅脑损伤后不同时间点的铁沉积情况。tbi后随着时间推移，于tbi后第三天出现铁染色阳性细胞，7天铁沉积达到高峰，14天有好转。

(7)图3a通过检测脑水肿程度变化情况，以找出lip-1的最佳给药浓度。tbi后1h分别腹腔注射5mg/kg、10mg/kg和15mg/kg三种浓度的lip-1，并于tbi后3d进行脑组织含水量测定，发现三种浓度的lip-1均能减轻tbi引起的脑水肿，而10mg/kg腹腔注射具有最佳的治疗效果。

(8)为评估nas对tbi后血脑屏障(bbb)破坏的影响，图3b伊文思蓝染色结果显示tbi后能导致bbb通透性的破坏，lip-1(10mg/kg)给药后能明显减轻bbb通透性。

(9)图4采用运动功能评分与水迷宫实验评估tbi后lip对小鼠运动与学习记忆功能的影响。与sham相比，小鼠tbi后1-7天出现运动功能(图4a)、tbi后14-16天学习记忆功能障碍(图4b)。与vehicle组相比，lip-1给药后小鼠运动、平衡功能增强(图4a)和水迷宫试验潜伏期缩短(图4b)。

(10)图5反映lip-1可显著改善小鼠tbi后的焦虑和认知障碍。图5a为tbi后小鼠运动总距离明显增加，而lip-1给药后运动总距离减少。图5b反映tbi后vehicle对照组小鼠的运动平均速度明显增加，而lip-1治疗后小鼠运动平均速度明显降低。图5c为vehicle对照组小鼠的活动次数在tbi后明显减少，而lip-1给药组的活动次数明显增加。图5d反映tbi后vehicle对照组小鼠的休息时间有明显的下降趋势，lip-1给药后有明显改善。图5e显示tbi后vehicle对照组小鼠的活动时间增加，而经lip-1治疗得以恢复。

(11)图6为lip-1逆转tbi后fth1、nox2与nrf2表达水平。图6a为fth1、nox2、nrf2的蛋白条带，图6b为上述三种蛋白表达的统计图。结果表明，tbi后3天fth1与nrf2蛋白表达水平明显上调，而nox2蛋白表达水平明显下调。lip-1处理能明显逆转tbi后上述蛋白的表达水平。

上述实验结果表明：脑外伤后铁沉积出现的时间晚于铁死亡相关蛋白的表达时间；铁死亡抑制剂lip-1腹腔给药后能减轻脑水肿与血脑屏障通透性，并改善脑外伤引起的运动、学习记忆与焦虑认知功能障碍；lip-1抑制脑外伤后铁死亡的发生与nrf2的上调。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。