一种基于基因干扰载体和铁纳米粒子用于杀灭癌细胞的组合物及其应用的制作方法

本发明涉及癌症基因治疗生物
技术领域：
，具体涉及一种基于基因干扰载体和铁纳米粒子用于杀灭癌细胞的组合物及其应用。
背景技术：
：癌症是困扰人类健康和威胁人类生命的重要疾病。在于癌症的长期斗争中，人类已经发展了手术、化疗、靶向治疗、免疫治疗等多种癌症治疗手段，也取得了显著的进步，癌症生存率显著提高。但目前癌症治疗的水平，仍然于广大患者对健康和生命的期望存在很大的距离。因此，积极发展新型癌症治疗技术仍是医学领域的持续努力的目标。基因治疗是未来医学的前沿领域和技术高地，基因治疗在遗传病治疗领域取得的进展已经受到医学界的瞩目，但该技术用于癌症治疗尚没有显著突破。因此，探索癌症单基因治疗技术也发展新型癌症治疗技术的主要突破口。癌症基因治疗就是通过向癌细胞内导入遗传物质，通过遗传物质发挥治疗作用，干扰癌细胞生长或杀灭癌细胞。特别是向细胞中导入某种基因，通过表达基因产物如干扰rna或蛋白，引发癌细胞生长抑制或凋亡、坏死。基因治疗中两个问题至关重要，一是基因的选择，直接决定治疗效率；二是控制基因只在癌细胞中表达，即癌细胞特异性。相对而言，基因的选择问题不大，基于目前基因组科学对大量基因功能的研究，不少基因特别是编码干扰rna及其抑癌蛋白的基因，导入细胞后其表达产物都会或多或少产生对癌细胞的抑制作用。最关键的是如何控制基因只在癌细胞中表达，即癌细胞特异性。目前基于合成生物学原理，已经发展了一些基因开关，用于控制基因在癌细胞中的特异性表达，但这些基因控制元件构成复杂、效率较低，与应用还有较大的距离。作为细胞的基本生物学现象，程序性细胞死亡(pcd)在消除多细胞生物中不需要的或异常的细胞中起着重要作用，这对于正常发育、体内平衡以及预防过度增殖性疾病(例如癌症)至关重要。最近，作为一种新型的pcd，铁凋亡(ferroptosis)引起了越来越多的关注。斯托克韦尔(stockwell)等在2012年鉴定出铁凋亡是一种铁依赖性形式的非凋亡调控性细胞死亡。铁凋亡依赖于细胞内的铁，而不依赖于其他金属，并且在形态、生化和遗传上与其他众所周知的调控性细胞死亡类型如细胞凋亡(apoptosis)、坏死(necrosis)、坏死性凋亡(necroptosis)及自噬(autophagy)等不同。然而，铁凋亡与细胞内活性氧(ros)水平升高有关，可以通过铁螯合或细胞铁摄取的遗传抑制来阻止。通过谷胱甘肽过氧化物酶4(gpx4)失活的细胞组分可诱导铁依赖性形式的细胞死亡，因为这会导致ros在膜脂质上的积聚。尽管已证明ros可调节细胞存活，但高水平的ros会引起不可逆的细胞损伤，从而导致各种类型的癌细胞发生凋亡、自噬和坏死。到目前为止，许多研究已证实某些天然产物可通过上调ros水平而在乳腺癌中产生特定的杀伤作用，这表明ros可能介导凋亡的选择性激活，从而特异性杀伤癌细胞。当亚铁(ferrousiron，fe2+)与过氧化物和氧气一起存在时，可通过芬顿(fenton)反应生成ros。铁不仅直接参与许多与铁凋亡有关的反应，而且还负责由芬顿反应介导的ros积累，这一点已被铁摄取增加和铁螯合剂的抑制作用所证明。ros水平通常通过抗氧化剂生产和铁转运系统相结合来平衡，典型的铁转运系统包括运铁蛋白(transferrin)的摄取、铁蛋白(ferritin)的贮存和铁转运蛋白(ferroportin，fpn)。包括转铁蛋白(transferrin，tf)、转铁蛋白受体1(transferrinreceptor1，tfr1)和fpn在内的三种蛋白质在调节体内铁含量的平衡中起着关键作用。与正常细胞相比，由于癌细胞独特的生理过程，肿瘤对铁的需求特别大。利用机会性营养获取方式被认为是癌症的标志之一。大量研究表明，癌细胞倾向于上调tfr1的表达以增加铁的摄入，而下调fpn的表达以减少铁的流出并增加铁的保留。然而，在铁超载的情况下，癌细胞比正常细胞更容易积累ros，从而加剧了铁凋亡。因此，铁的调节可能为癌症提供新的治疗机会。迄今为止，fpn是哺乳动物中唯一已知的铁的细胞输出者(exporter)。最近，已发现fpn在许多癌症中失调，例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌和多发性骨髓瘤，相对于正常骨髓，白血病细胞系也与fpn表达低有关。尽管铁的吸收、储存和排除受到很好地调节，但以纳米颗粒形式施用铁仍提供了一种铁进入细胞的非自然的途径。许多研究报道铁基纳米材料由于其能够通过被动和主动靶向可聚集在肿瘤部位，以及铁在酸性溶酶体中以亚铁(fe2+)或铁(fe3+)离子释放的铁参与芬顿反应并诱导铁凋亡以杀死癌细胞。但由于铁对细胞的重要性，细胞进化出一套维持细胞内铁平衡(铁稳态)的机制和系统；在该系统的作用下，细胞对细胞内超量的铁离子会有效输出；因此，虽然有大量文献报道铁基纳米颗粒具有引起细胞铁凋亡的作用，但由于细胞铁稳态系统的作用，铁基纳米颗粒在细胞内释放的铁离子很快会被输出细胞，因而单纯用铁基纳米颗粒利用铁凋亡机制抑制癌细胞生长的作用非常有限，没有临床开发价值。技术实现要素：发明目的：针对现有癌症基因治疗及铁纳米材料诱导癌细胞铁凋亡存在的问题，本发明提出一种用于杀灭癌细胞的组合物及其应用，本发明的组合物具体是一种基于基因干扰载体和铁纳米粒子用于杀灭癌细胞的组合物，本发明还提一种基于基因干扰载体和铁纳米粒子杀灭癌细胞的新方法，该新方法由基因干扰载体和铁纳米粒子两种生物及化学材料相配合杀灭癌细胞。技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种用于杀灭癌细胞的组合物，其特征在于，包括基因干扰载体和铁纳米粒子，所述基因干扰载体为癌细胞特异性启动子dmp控制的crispr/cas13a表达载体或microrna表达载体。其中，所述crispr/cas13a表达载体所表达的cas13a-grna或所述microrna表达载体所表达的microrna可靶向抑制细胞内目标基因的表达，具体为可靶向抑制细胞内铁代谢及活性氧相关基因的表达。所述铁纳米粒子为进入细胞后可发生降解产生铁离子并导致细胞内活性氧水平升高的铁纳米材料。作为优选，铁纳米材料为二巯基丁二酸(dimethylaminosulfanilide，dmsa)修饰的四氧化三铁纳米粒子(fe3o4@dmsa)(简称fenps)。进一步地，所述癌细胞特异性启动子dmp启动子是一种nf-κb特异性启动子，由nf-κb诱骗子和最小启动子连接形成(专利申请号cn201710812983.2)，该启动子可激活其下游基因在各种癌细胞中表达，而不在正常细胞中表达(专利申请号cn201711335257.2、cn201810163823.4)；所述dmp启动子可控制crispr/cas13a或microrna表达载体在癌细胞中的特异性表达。其中，所述crispr/cas13a表达载体中由dmp启动子控制cas13a的表达，由u6启动子控制grna的表达(专利申请号202010096220.4)，所述crispr/cas13a表达载体的功能dna元件及序列如图1所示；所述microrna表达载体中由dmp启动子控制microrna的表达(专利申请号201710812983.2)；所述microrna表达载体功能dna元件及序列如图2所示(通常microrna可简写为mirna)。作为优选，所述所述crispr/cas13a表达载体(pdmp-cas13a-u6-grna；简称pdcug)的功能元件的dna序列如seqidno.1所示；所述microrna表达载体(pdmp-mir)的功能元件的dna序列如seqidno.2所示。进一步地，所述crispr/cas13a或microrna表达载体，既可以表达靶向单个基因的grna或microrna，也可以共表达靶向多个基因的grna或microrna。作为优选，所述铁代谢及活性氧相关基因主要包括fpn、lcn2、fsp1、fth1、gpx4、nrf2及slc7a11基因。进一步地，所述crispr/cas13a或microrna表达载体可表达靶向fpn、lcn2、fsp1、fth1、gpx4、nrf2及slc7a11基因的grna或microrna；其中grna可与cas13a蛋白形成复合物，而microrna可与risc形成复合物，两种复合物均可靶向切割上述基因的mrna，从而导致上述基因编码蛋白表达水平的降低。作为优选，所述靶向fpn及lcn2的grna其靶点结合序列分别为：5′-caccgcaaagtgccacatccgatctccc-3′(fpn)及5′-taactcttaatgttgcccagcgtgaact-3′(lcn2)；所述靶向fpn、lcn2、fsp1、fth1、gpx4、nrf2及slc7a11基因的microrna其靶点结合序列分别为：5′-tctacctgcagcttacatgat-3′(fpn)、5′-taatgttgcccagcgtgaact-3′(lcn2)、5′-caaacaaacaaataaagtgga-3′(fsp1)、5′-taaacaaacaaacaaataaag-3′(fsp1)、5′-atcccaagacctcaaagacaa-3′(fth1)、5′-taaggaatctggaagatagcc-3′(fth1)、5′-ttcagtaggcggcaaaggcgg-3′(gpx4)、aggaactgtggagagacggtg-3′(gpx4)、5′-tactgattcaacatactgaca-3′(nrf2)、5′-tttacacttacacagaaacta-3′(nrf2)、5′-aaatgatacagccttaacaca-3′(slc7a11)、及5′-ttgagttgaggaccagttagt-3′(slc7a11)。作为优选，所述铁纳米粒子或者铁纳米材料为dmsa修饰fe3o4纳米颗粒(fenps)或pei修饰的fe3o4纳米颗粒(fencs)。所述两种铁纳米材料可制备或者购买得到。进一步地，在基因干扰载体和铁纳米粒子共同作用下，可导致癌细胞内铁离子及活性氧水平急剧升高，诱发癌细胞发生显著的铁凋亡。其中，所述基因干扰载体可以以病毒载体或非病毒载体形式进行体内给药；所述铁纳米粒子既可以作为单独的化学材料进行体内给药，也可以同时作为基因干扰载体的纳米载体进行体内给药。作为优选，所述病毒载体为腺相关病毒(aav)，所述非病毒载体为纳米载体。进一步的，纳米载体(nanocarrier)为可结合dna的铁纳米粒子。作为优选，所述可结合dna的铁纳米粒子为聚乙烯亚胺(polyethylenimine，pei)修饰的四氧化三铁纳米粒子(fe3o4@pei)(简称fencs)。本发明所述的用于杀灭癌细胞的组合物在制备新型癌症治疗试剂中的应用。具体是指基因干扰载体和铁纳米粒子这两种生物及化学材料组合在制备新型癌症治疗试剂中的应用。具体的，所述试剂包含两种组分：基因干扰载体和铁纳米粒子；其中基因干扰载体包括dmp控制的crispr/cas13a或microrna表达载体；其中基因干扰载体既可以为质粒dna，也可以为线性dna；其中铁纳米粒子包括各种铁纳米粒子，作为优选，铁纳米粒子为fenps和fencs；其中fencs具有双重功能，既是铁纳米粒子，也是基因干扰载体(vector)的纳米载体(carrier)。本发明中，开发了一种用于杀灭癌细胞的组合物，包括基因干扰载体与铁纳米粒子以及基于基因干扰载体与铁纳米粒子的癌细胞杀灭新方法。本发明将铁基纳米材料与由nf-κb特异性启动子dmp控制的基因表达调控技术相结合。通过dmp启动子控制是crispr/cas13a和microrna这两种基因表达干扰工具，抑制癌细胞中铁代谢及活性氧(ros)相关基因的表达，配合铁纳米粒子进入细胞后降解形成铁离子并产生自由基，造成细胞内铁离子和ros水平的急剧升高，从而导致癌细胞发生显著的铁凋亡。本发明中，首先通过dmp控制的crispr/cas13a和microrna表达载体靶向抑制两种铁代谢相关基因fpn和lcn2在三种白血病细胞kg-1a、hl60和wehi-3中的表达，配合铁纳米粒子显著提升白血病细胞内的ros水平，引发白血病细胞发生显著的铁凋亡。之后用相同的方法处理了代表10种常见实体瘤的多种癌细胞系，得到相似的结果。说明该本发明的组合物及其处理方法不仅对血液癌细胞有杀灭效果，同样对各种实体瘤癌细胞具有杀灭效果，因此，本发明的组合物及其杀灭癌细胞的方法是一种广谱性癌细胞杀灭新技术。此外，通过将dmp控制的靶向fpn和lcn2基因的crispr/cas13a和microrna表达载体包装成aav病毒，通过静脉，与同样静脉注射铁纳米粒子相配合，显著抑制了小鼠体内白血病细胞的增殖，表明在体内外均可抑制癌细胞的增殖。因此，本发明提出的基于基因干扰载体和铁纳米粒子杀灭癌细胞的组合物，其基因干扰载体和铁纳米粒子这两种生物及化学材料的组合在制备新型癌症治疗试剂中具有潜在应用价值。有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：1、与现有的已临床应用癌细胞杀灭技术相比，本发明提出了一种原理上全新的癌细胞杀灭组合物，即基因干扰强化的铁凋亡治疗(geneinterferredforroptosistherapy,gift)组合物，即基于基因干扰载体和铁纳米粒子用于杀灭癌细胞的组合物。铁基纳米颗粒已被成功地作为mri造影应用于癌症临床诊断和贫血临床治疗，但铁基纳米颗粒基于其化学本质尚未用于癌症的临床治疗。然而，已有大量的研究表明铁基纳米颗粒在细胞内溶酶体酸性环境中会发生降解释放出铁离子，进而引起细胞内ros水平升高并引发细胞凋亡。该过程与近年来广泛研究并揭示的细胞铁凋亡机理不谋而合。但由于铁对细胞的重要性，细胞进化出一套维持细胞内铁平衡(铁稳态)的机制和系统；在该系统的作用下，细胞对细胞内超量的铁离子会有效输出；因此，虽然有大量文献报道铁基纳米颗粒具有引起细胞铁凋亡的作用，但由于细胞铁稳态系统的作用，铁基纳米颗粒在细胞内释放的铁离子很快会被输出细胞，因而单纯用铁基纳米颗粒利用铁凋亡机制抑制癌细胞生长的作用非常有限，几乎没有临床开发价值。本发明发明人发现在dmsa修饰的fe3o4纳米颗粒(fenps)处理细胞时，fenps会进入细胞并在溶酶体酸性环境中发生降解，释放铁离子，导致细胞内铁离子水平升高；为了维持铁稳态，细胞会应对性升高铁离子外排相关基因的表达，其中最显著的是fpn和lcn2。本发明将fpn和lcn2作为运用铁凋亡机理杀灭癌细胞的重要靶点。认为在敲低这两个铁输出相关基因表达的情况下，用铁纳米材料处理细胞，则会造成细胞内铁离子水平的升高；由于所产生的铁离子无法被有效输出细胞，会造成细胞内铁离子的大量积累和ros的急剧升高，从而诱发细胞显著的铁凋亡，但这种机制对于正常细胞和癌细胞都会发生作用。因此，最关键的问题是如何控制只在癌细胞中抑制(或敲低)这两个铁输出相关基因的表达，而在正常细胞中不干扰这两个基因的表达。在申请人过去的研究中，设计并论证了一种癌细胞特性启动子——dmp启动子，该启动子由nf-κb诱骗(decoy)序列与最小启动子(minimalpromoter)连接而成(int.j.biochem.cell.biol.2018,95:43-52；专利申请号cn201710812983.2)，并证明了该启动子可以驱动其下游在各种癌细胞表达，而在正常细胞中不表达(humgenether.2019,30:471-484；genetherapy2020,doi:https://doi.org/10.1038/s41434-020-0128-x；专利申请号cn201711335257.2、cn201810163823.4)。因此，本发明运用dmp控制基因干扰工具如crispr/cas13和mirna在细胞内的表达，特异性地敲低铁输出相关基因fpn和lcn2在癌细胞中的表达，而不影响其在正常细胞中的表达。基于上述推理，在本发明中，提出了一种基于基因干扰载体与铁纳米粒子的癌细胞杀灭组合物。该组合物将铁基纳米材料与癌细胞特性启动子dmp控制的基因表达干扰工具相结合。在本发明中，用dmp启动子控制两种基因干扰工具crispr/cas13和mirna在细胞内的表达，构建了靶向fpn和lcn2mrna的基因敲低载体。用这些载体与一种铁纳米粒子(fenps)相配合，观察了这种组合对各种癌细胞及正常细胞的作用。结果表明，这种组合对各种癌细胞均具有显著的杀灭作用，而对正常细胞没有影响。并且证明单独的二者其一均不能对癌细胞产生显著杀灭作用，对正常细胞亦无显著影响。通过将基因敲低载体包装进aav病毒，将产生的重组病毒与fenps进行小鼠静脉注射，发现二者组合可显著抑制小鼠皮下移植瘤的生长。这些结果充分论证了该组合物和方法的可行性和可靠性。此外，通过测定细胞内铁含量、ros水平以及体内外效应基因cas13以及两种靶基因的表达，进一步论证了该组合物和方法杀灭癌细胞的机制就是本发明所设计的基因干扰强化的铁凋亡治疗(gift)。2、本发明提出的全新的组合物及其在杀灭癌细胞方面的新方法具有三个显著地优点，即癌细胞特异性、效果显著性和广谱性。本发明中，首先通过dmp控制的crispr/cas13a和mirna表达系统靶向抑制两种铁代谢相关基因fpn和lcn2在三种白血病细胞kg-1a、hl60和wehi-3中的表达，配合铁纳米粒子显著提升白血病细胞内的ros水平，引发白血病细胞发生显著的铁凋亡。之后用相同的方法处理了代表10种常见实体瘤的多种癌细胞系(共14种)，得到相似的结果。说明该组合物及其杀灭癌细胞的方法不仅对血液癌细胞有杀灭效果，同样对各种实体瘤癌细胞具有杀灭效果，因此，该组合物及其杀灭癌细胞的方法是一种广谱性癌细胞杀灭新技术。实验研究表明，各种癌细胞在本发明的组合物及其杀灭癌细胞的处理72小时后基本被全部杀灭，杀灭效果极其显著。通过对三种正常细胞(人正常肝细胞hl7702、人胚胎成纤维细胞mrc5和人胃粘膜上皮细胞ges-1)的处理，证明新组合物及其杀灭癌细胞的方法对正常细胞的生长没有显著影响，说明了新组合物及其杀灭癌细胞的方法对于的癌细胞特异性。此外，体内实验也表明，dmp控制的cas13a及microrna仅在肿瘤组织种表达，而不在正常组织中表达，说明本发明提出的包括组合物及其杀灭癌细胞的方法的癌细胞杀灭技术在体内同样具有癌细胞特异性，即只在肿瘤组织中起作用。3、本发明提出的组合物及其杀灭癌细胞的新方法用于杀灭体内癌细胞时具有灵活可行的给药方式及剂型。为了证明体内给药用于杀灭体内癌细胞的可能性和可行性。本发明进行了三批动物实验，分别尝试了以病毒载体及以铁纳米材料为非病毒载体在体内递送基因干扰载体dna。在第一批动物实验中分两次分别静脉注射raav病毒和fenps，在注射raav后的次日再注射fenps；而在第二批动物实验中，为了进一步简化了给药方式，将raav和fenps体外混合后，一次性静脉注射给药。结果表明，raav和fenps先后两次给药和二者一次性同步给药产生相似的抗肿瘤作用，这为该组合物及其杀灭癌细胞的方法的体内应用提供了一种更方便地给药方式。传统上，dna传递系统分为病毒载体介导的系统和非病毒载体介导的系统，其中非病毒途径已成为阐明基因结构、调控和功能的强大而流行的研究工具。病毒介导的基因递送系统由于其高效性，是目前体内基因治疗的主要基因递送系统，例如目前fda已批准的可用于临床治疗的几种基因治疗，以及大量临床阶段的研究，均使用aav为基因递送工具。但病毒介导的基因递送系统最重要的缺陷是潜在的免疫反应和病毒制备的长周期及高成本；此外，由于aav病毒是一种天然存在于人体内的病毒，很多个体内存在该种病毒的天然抗体及免疫记忆，限制了aav病毒在所有个体上的广泛应用。因此，在过去的十年中，大量非病毒载体系统被研究和开发。其中包括已经开发出的用于递送核酸的磁性纳米转染剂magnetofectiontm(therdeliv.2011；2:717-26)。为了克服aav载体的缺点并充分利用磁性纳米转染材料的化学特性，本发明还尝试了将铁纳米粒子作为质粒dna的纳米载体(nanocarriers)，称为铁纳米载体(fenanocarriers，fencs)，进行癌细胞抑制实验，以便进一步简化试剂制备并降低成本。本发明使用的fencs是一种聚乙烯亚胺(polyethylenimine，pei)修饰的fe3o4纳米颗粒。本发明中，磁性转染剂不仅可以用作体内dna传递的载体，而且还可以作为铁的纳米供体。第三批动物实验结果表明，荷载质粒dna的fencs(简称为fencs@dna)通过静脉注射，亦可显著敲低小鼠体内肿瘤组织中fpn和lcn2基因的表达，并显著抑制肿瘤生长。因此，本发明还发展了一种新方法抑制癌细胞生长的新剂型，该剂型及其两种组分(质粒dna和fencs)不仅可体外大规模工业化生产，而且生产周期短成本低，是最有希望用于发展新型癌症治疗药物的试剂。此外，该剂型避免了使用病毒可能造成的免疫反应，有望在所有个体上使用。4、本发明提出的基因干扰载体非常有利于本发明的组合物及其杀灭癌细胞的方法的体内应用。本发明中运用dmp控制两种基因干扰系统crispr/cas13-grna和mirna达成抑制体内外癌细胞中目的基因表达的目的，而且dmp与两种基因干扰系统配合均非常有利于新组合物及其杀灭癌细胞的方法的体内应用以及多基因同步干扰。本发明中使用目前基因治疗中最常用最安全的腺相关病毒(aav)作为基因干扰载体(vector)体内递送的载体(carrier)，但avv的缺点是其dna包装能力有限，一般不能包装超过4kb的dna片段。本发明中所采用的dmp启动子以及两种基因干扰系统crispr/cas13-grna和mirna，在运用aav进行体内递送和多基因共抑制(或敲低)应用中非常有利。例如，本发明中共表达fpn与lcn2，以及共表达其他5个靶基因(miffgns)。由于dmp启动子非常短(84bp)，而cas13可以加工自己的grna前体，在构建靶向多个基因的grna时，只需使用一个u6启动子指导一个前体rna转录，而这个前体rna可被cas13加工后形成可分别靶向多个基因或靶点的成熟grna，如本发明中的pdcug-hfl或pdcug-mfl。短小的dmp启动子与cas13a-grna的这种优点，非常有利于将可靶向多个基因或靶点的cas13表达载体(dcug)序列包装进一个avv颗粒，如本发明中的raav-dcug-hfl或raav-pdcug-mfl。本发明中使用的pdmp-mirna载体也非常有利在制作靶向多基因或多靶点的载体。本发明中使用的pdmp-mir载体中，dmp启动子只有84bp，每个mirna骨架只有341bp，hsvtkpoly(a)signal只有49bp，合计一个完整的dmp-mirna表达单元仅有474bp，这非常有利于将靶向多基因或多靶点的dmp-mirna单元串联组合，构建靶向多基因或多靶点的共表达pdmp-mirna载体，如pdmhfl或pdmmfl。这种多基因共抑制具有重要意义。本发明发现靶向多个铁代谢或ros调控相关基因(如fpn与lcn2)的grna或mirna的共表达，在杀灭癌细胞时具有显著的协同作用，能够与fenps配伍产生最大的癌细胞杀灭效果(如pdcug-hfl或pdcug-mfl、pdmhfl/pdmmfl)。5、本发明提出的新组合物及其杀灭癌细胞的方法有望解决癌细胞耐药性问题。化疗是目前癌症治疗主要疗法之一，但化疗耐药(chemoresistance)仍然是癌症治疗的巨大障碍。因此，迫切需要为不再从化疗中受益的人寻求新的治疗策略。此外，目前非常盛行的靶向疗法及免疫疗法都已经受到肿瘤耐药性的困扰。近年来，不少研究已经报道铁凋亡有望是解决肿瘤耐药的重要途径。但常规铁凋亡过程受细胞主动调控铁稳态和氧化还原稳态的影响，无法造成癌细胞发生具有癌症治疗价值水平的铁凋亡。本发明基于对癌症基因治疗及铁纳米材料生物效应的大量研究，将基因治疗技术的原理运用到铁凋亡中，提出基因干扰强化的铁凋亡疗法(gift)以及全新的组合物和杀灭癌细胞的方法。本发明实验证明所有被测试的癌细胞用新方法处理72小时后，所有癌细胞几乎被彻底杀灭。综上，本发明提供了一种由基因干扰载体和铁纳米粒子两种生物及化学材料相配伍杀灭癌细胞的组合物，其中基因干扰载体为癌细胞特异性启动子dmp控制的crispr/cas13a或microrna表达载体，该载体所表达的cas13a-grna或microrna可靶向抑制细胞内铁代谢及活性氧相关基因的表达，其铁纳米粒子进入细胞后可降解产生铁离子、升高活性氧水平，本发明在基因干扰载体和铁纳米粒子共同作用下，可导致癌细胞内铁离子及活性氧水平急剧升高，诱发癌细胞发生显著的铁凋亡。本发明的提出的基因干扰载体和铁纳米粒子组合可用于制备新型癌症治疗试剂。附图说明图1为crispr/cas13a表达载体的功能dna元件及序列示意图。为了直观地显示该载体的功能dna元件及序列，图中质粒命名为pdmp-cas13a-u6-grna，简称为pdcug。图中显示dmp控制cas13a表达，而u6启动子控制grna表达。该载体为骨架载体，用于构建靶向具体基因的crispr/cas13a表达载体。图2为microrna表达载体功能dna元件及序列示意图。图中显示dmp控制microrna的表达。该载体为骨架载体，用于构建靶向具体基因的microrna表达载体。图3为基因干扰铁凋亡疗法(gift)原理示意图，由nf-κb激活的基因表达载体和fe3o4纳米颗粒(fenps)。nf-κb激活的基因表达载体由一种nf-κb特异性启动子(dmp)和其下游的效应构成，其中nf-κb特异性启动子由nf-κb诱骗子(decoy)序列和最小启动子(minimalpromoter，mp)序列构成。(a)基于crispr/cas13a的gift原理示意图。u6-p为u6启动子；grna为grna编码序列；cas13a，cas13a编码序列。(b)基于mirna的gift原理示意图。(c)定量pcr检测不同细胞系中nf-κb的表达。***，p＜0.001。图4为fenps对细胞活力的影响示意图。(a)fenps对三种白血病细胞活力的影响。用不同浓度的fenps处理三种白血病细胞。在处理后的不同时间用cck-8测定法检测细胞活力。(b)fenp对肝癌细胞及两种正常细胞(hl7702和mrc-5)活力的影响。用不同浓度的fenps处理细胞。在处理后的不同时间用cck-8测定法检测细胞活力。图5为kg-1a细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时，然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。用各种组合的pdcug或pdm载体和fenps处理三种白血病细胞。pdcug是指dmp-cas13a-u6-grna的质粒，pdm是指dmp-mirna的质粒。所使用的质粒载体包括pdcug-nt(grna不靶向任何转录本)、pdcug-hf(grna靶向人fpn)、pdcug-hl(grna靶向人lcn2)、pdcug-hfl(grna靶向人fpn和lcn2)、pdcug-mf(grna靶向小鼠fpn)、pdcug-ml(grna靶向小鼠lcn2)、pdcug-mfl(grna靶向小鼠fpn和lcn2)、pdmneg(mirna不靶向任何转录本)、pdmhf(mirna靶向人fpn)、pdmhl(mirna靶向人lcn2)、pdmhfl(mirna靶向人fpn和lcn2)、pdmmf(mirna靶向鼠fpn)、pdmml(mirna靶向鼠lcn2)和pdmmfl(mirna靶向鼠fpn和lcn2)。用各种质粒转染细胞并培养24小时，然后在有或没有50μg/mlfenp的培养基中培养细胞72小时。在fenps处理的各时间点，将细胞用吖啶橙/溴化乙锭染色并成像。该图仅显示了质粒pdmneg、pdmhfl、pdmmfl、pdcug-nt、pdcug-hfl和pdcug-mfl联合fenps处理72小时后的代表性细胞图像。图6为hl60细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时，然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。载体注解同图5。图7为wehi-3细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时，然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。载体注解同图5。图8为三种白血病细胞gift抑制效果的细胞凋亡定量检测示意图。用各种组合的质粒载体和fenps处理细胞。fenps给药后72小时收集细胞，并用annexinv-fitc凋亡检测试剂盒及流式细胞仪检测。该图仅显示最终的统计结果。左侧每个柱状图中各个柱子代表的处理从左到右均对应于右侧注解图从上到下的各种处理。代表性的流式细胞仪图像如图9所示。所有值均是平均值±s.e.m。其中n＝3。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。图9为用流式细胞仪分析gift处理三种白血病细胞的凋亡示意图。此图显示代表性的流式细胞仪图像。图10为hepg2细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时，然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。用各种组合的pdcug或pdm载体和fenps处理细胞。使用的质粒载体包括pdcug-nt、pdcug-hf、pdcug-hl、pdcug-hfl、pdmneg、pdmhf、pdmhl和pdmhfl。用各种质粒转染细胞并培养24小时。然后将细胞用含有或不含50μg/mlfenp的培养基再培养72小时。fenps处理后的各个时间点，将细胞用吖啶橙/溴化乙锭染色并成像。图11为hl7702细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；细胞的载体转染同图10。用tnf-α(10ng/ml)诱导或不诱导细胞1小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。图12为mrc-5细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；细胞的载体转染同图10。用tnf-α(10ng/ml)诱导或不诱导细胞1小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。图13为用流式细胞仪分析gift处理hepg2、hl7702及mrc-5细胞的凋亡示意图。用各种组合的质粒载体和fenps处理细胞。fenps给药后72小时收集细胞，并通过流式细胞仪用膜联蛋白v-fitc凋亡检测试剂盒检测。该图仅显示最终的统计结果。左侧每个柱状图中各个柱子代表的处理从左到右均对应于右侧注解图从上到下的各种处理。代表性的流式细胞仪图像如图14所示。所有值均是平均值±s.e.m。其中n＝3。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p＜0.001。图14为用流式细胞仪分析gift处理hepg2、hl7702及mrc-5细胞的凋亡示意图。此图显示代表性的流式细胞仪图像。图15为hek-293t细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。图16为a549细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。图17为ht-29细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。图18为panc1细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。图19为skov3细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。图20为mda-mb-453细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。图21为c-33a细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。图22为bgc823细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。图23为sgc7901细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。图24为mgc-803细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。图25为kyse450细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。图26为kyse510细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。图27为b16f10细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。图28为hepa1-6细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。图29为dmp-cas13a/u6-grna和dmp-mir系统的敲低效果示意图。用各种载体转染细胞并培养24小时，然后在有或没有50μg/mlfenp的情况下孵育。fenps施用后48小时检测细胞。(a)mrna表达的qpcr分析。(b)蛋白质表达的蛋白质印迹分析。显示了代表性图像和定量光密度。所有值均是平均值±s.e.m。其中n＝3。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p＜0.001。图30为ros生成和铁含量的增加与gift诱导的细胞凋亡的相关性示意图。将细胞用各种质粒转染并培养24小时，然后在有或没有50μg/mlfenps的情况下再培养48小时。hl7702和mrc-5细胞在用fenps处理前先在有或没有tnf-α(10ng/ml)诱导的情况下培养1小时。fenps施用后48小时检测ros变化和铁含量。(a)ros水平的流式细胞仪分析。图中显示了荧光位移和定量的荧光强度。使用活性氧分析试剂盒将处理过的细胞用dcfh-da染色。用流式细胞仪分析荧光位移指示的ros变化。(b)各种处理下细胞的铁含量的定量检测。所有值均是平均值±s.e.m。其中n＝3。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p＜0.001。图31为用细胞仪分析gift处理细胞的ros水平示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；其中hl7702和mrc-5细胞用tnf-α(10ng/ml)诱导或不诱导1小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞48小时。收集细胞并用活性氧分析试剂盒用dcfh-da染色，用流式细胞仪分析荧光位移指示的ros变化。图32为体外评估raav示意图。将kg-1a、wehi-3和hl7702细胞接种到24孔板中(1×105细胞/孔)并培养12小时。然后用图中各种病毒以每细胞1×105vg的剂量转染细胞。将转染的细胞培养24小时，然后用含有或含有50μg/mlfenps培养基中再培养72小时。用吖啶橙/溴化乙锭染色并成像，平行细胞用cck-8分析细胞活力。(a)代表性细胞图像。(b)细胞活力。所有值均是平均值±s.e.m。其中n＝3。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p＜0.001。图33为用fe纳米载体(fencs)荷载各种质粒转染kg-1a细胞示意图。在转染前将细胞(1×105)接种到24孔板中培养过夜。根据制造商的说明，用fencs(0.5μg)荷载500ng各种质粒处理细胞。将转染的细胞培养24小时，然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养液再培养细胞72小时。fenps给药后24小时、48小时和72小时，所有细胞均用吖啶橙/溴化乙锭染色，并在荧光显微镜下成像。图34为用fe纳米载体(fencs)荷载各种质粒转染hepg2细胞示意图。在转染前将细胞(1×105)接种到24孔板中培养过夜。根据制造商的说明，用fencs(0.5μg)荷载500ng各种质粒处理细胞。将转染的细胞培养24小时，然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养液再培养细胞72小时。fenps给药后24小时、48小时和72小时，所有细胞均用吖啶橙/溴化乙锭染色，并在荧光显微镜下成像。图35为通过两种fe纳米载体(fencs)荷载各种质粒转染kg-1a细胞示意图。在转染前将细胞(1×105)接种到24孔板中培养过夜。用荷载各种质粒的50μg/mlfencs(fencs-1和fencs-2)处理细胞。将所有细胞再培养72小时。fencs给药后24小时、48小时和72小时，所有细胞均用吖啶橙/溴化乙锭染色，并在荧光显微镜下成像。将pdmfl与fencs-1/fencs-2按说明书混合，形成荷载质粒pdmfl的fencs-1/fencs-2(表示为fencs-1@pdmfl/fencs-2@pdmfl)。将fencs-1@pdmfl/fencs-2@pdmfl立即添加到细胞中或放置24小时(以fencs-1@pdmfl24h/fencs-2@pdmfl24h表示)后添加到细胞中。fencs-1/fencs-2表示两种fencs。图36为基于病毒载体的gift的体内抗肿瘤作用示意图。(a)第一批及第二批动物实验的肿瘤照片。(b)治疗前后的肿瘤体积变化。(c)各种组织中病毒dna的丰度。(d)各种组织中cas13amrna的qpcr检测的ct值。(e)各种组织中fpnmrna的相对表达量(rq)。(f)各种组织中lcn2mrna的相对表达量(rq)。所有值均是平均值±s.e.m。其中n＝3。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p＜0.001。图37为基于荷载质粒的铁纳米粒子的gift的体内抗肿瘤作用示意图。(a)第三批动物实验的肿瘤照片。(b)治疗前后的肿瘤体积变化。(c)各种组织中质粒dna的丰度。(d)各种组织中cas13amrna的qpcr检测的ct值。(e)各种组织中fpnmrna的相对表达量(rq)。(f)各种组织中lcn2mrna的相对表达量(rq)。所有值均是平均值±s.e.m。其中n＝3。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p＜0.001。图38为kg-1a细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。处理细胞的质粒包括pdmhfsp1-1(mifsp1-1)、pdmhfsp1-2(mifsp1-2)、pdmhfth1-1(mihfth1-1)、pdmhfth1-2(mifth1-2)、pdmhgpx4-1(migpx4-1)、pdmhgpx4-2(migpx4-2)、pdmhnrf2-1(minrf2-1)、pdmhnrf2-2(minrf2-2)、pdmhslc7a11-1(mislc7a11-1)及pdmhslc7a11-2(mislc7a11-2)(括号内为每种载体的简称)。图39为hepg2细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。处理细胞的质粒同图38。图40为hl7702细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。处理细胞的质粒同图38。图41为bgc823细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。处理细胞的质粒同图38。图42为ges-1细胞的gift抑制实验示意图。用图中各种质粒转染细胞，培养24小时；然后用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色细胞并成像。处理细胞的质粒同图38。图43为靶向其他基因的gift的体外抗肿瘤作用示意图。用靶向5个基因(fsp1、fth1、gpx4、nrf2及slc7a11)的pdmp-mir载体，包括pdmhfsp1-1(mifsp1-1)、pdmhfsp1-2(mifsp1-2)、pdmhfth1-1(mihfth1-1)、pdmhfth1-2(mifth1-2)、pdmhgpx4-1(migpx4-1)、pdmhgpx4-2(migpx4-2)、pdmhnrf2-1(minrf2-1)、pdmhnrf2-2(minrf2-2)、pdmhslc7a11-1(mislc7a11-1)及pdmhslc7a11-2(mislc7a11-2)(括号内为每种载体的简称)，转染5种细胞，24小时后；用含有或不含有50μg/mlfenps的培养基再培养细胞72小时。再不同时间点用cck-8分析细胞活力。所有值均是平均值±s.e.m。其中n＝3。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p＜0.001；****，p＜0.0001。图中每种处理的三个数据柱从左到右依次为24小时、48小时和72小时的检测数据。具体实施方式以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例基因干扰铁凋亡疗法(gift)抑制体内外癌细胞生长1.材料与方法1.1.载体构造诱骗子最小启动子(dmp)是一种化学合成的包含nf-κb应答序列和最小启动子序列的nf-κb特异性启动子，被克隆到pmd19-tsimple(takara)中，得到pmd19-t-dmp。通过pcr从pc013-twinstrep-sumo-hulwcas13a(addgene)中扩增得到人密码子优化的cas13a编码序列，将扩增产物克隆到pmd19-t-dmp中，获得pmd19-t-dmp-cas13a。化学合成u6启动子序列及由bbsi限制性位点分隔的cas13a的指导rna(guiderna，grna)的直接重复序列(directrepeatsequence)，将二者分别克隆到pmd19-t-dmp-cas13a中，获得pdmp-cas13a-u6-grna(简称为pdcug)，其功能元件的dna序列如seqidno.1和图1所示，该载体为构建靶向不同基因(x)转录本的表达载体pdcug-x的骨架载体。通过chopchop(http://chopchop.cbu.uib.no/)设计靶向无转录本(nt)、人或鼠铁转运蛋白(fpn)和lipocalin2(lcn2)转录本的grna。化学合成包含28bpgrna靶标特异性区域和两个侧翼bbsi位点的互补寡核苷酸，使其退火成双链寡核苷酸，然后通过bbsi酶切及连接酶连接，克隆到pdcug中。连接反应(10μl)由10单位bbsi酶(neb)、600单位t4dna连接酶(neb)、1×t4dna连接酶缓冲液、1nm双链寡核苷酸和50ngpdcug组成。连接反应在pcr循环仪上运行如下温控程序：37℃5分钟和16℃10分钟10个循环、37℃30分钟和80℃5分钟。产生的质粒分别命名为pdcug-nt、pdcug-hfpn/pdcug-mfpn、pdcug-hlcn2/pdcug-mlcn2。因人与小鼠基因序列的不同，分别构建了靶向人fpn(hfpn)和lcn2(hlcn2)基因，以及小鼠fpn(mfpn)和lcn2(mlcn2)基因的载体(h，human；m，mouse)。此外，还构建了可同时表达(即共表达)靶向fpn和lcn2基因的pdcug载体，称为pdcug-hfl/pdcug-mfl。表1中列出了靶向所有目的基因的cas13agrna。表1.cas13a的grna靶点序列名称引导序列(5′→3′)pfshumanfpnguidecaccgcaaagtgccacatccgatctcccthumanlcn2guidetaactcttaatgttgcccagcgtgaactcmousefpnguidettattccagttattgctgatgctcccattmouselcn2guidettggtcggtggggacagagaagatgatgtnotranscriptguidetagattgctgttctaccaagtaatccatn/a用dmp启动子替换pcmv-mir载体中的cmv启动子，构建通用mirna表达载体pdmp-mir，其功能元件的dna序列如seqidno.2和图2所示。其中pcmv-mir为发明人实验室之前构建(int.j.biochem.cell.biol.2018,95:43-52)，其中含有cmv启动子和其下游的mir骨架序列。使用block-ittmrnaidesigner(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)程序设计靶向人或鼠fpn和lcn2的mirna，并由sangonbiotech合成对应的寡核苷酸。将合成的寡核苷酸变性再退火，获得双链寡核苷酸，然后将其与用bsmbi切割的线性pdmp-mir载体连接，产生靶向fpn和lcn2基因的mirna表达载体，分别命名为pdmp-mir-hfpn/pdmp-mir-mfpn(简称为pdmhf/pdmmf)和pdmp-mir-hlcn2/pdmp-mir-mlcn2(简称为pdmhl/pdmml)(注意：说明书下文及说明书附图中在载体名称间使用符号“/”，表示“或”的意思)。通过pcr扩增检测载体，并通过dna测序验证。此外，还构建了可同时表达(即共表达)靶向fpn和lcn2的mirna表达载体，被命名为pdmp-mir-hfpn-dmp-mir-hlcn2/pdmp-mir-mfpn-dmp-mir-mlcn2(简称为pdmhfl/pdmmfl)。以相似的方式，根据质粒pcdnatm6.2-gw/emgfp-mir-neg的序列合成并制备mir-neg双链寡核苷酸，将其连接到pdmp-mir载体中，产生pdmp-mir-neg(简称为pdmneg)，该载体作为阴性对照载体。其靶点序列及用于构建靶向个基因pdmp-mir载体的化学合成的寡核苷酸序列见表2。使用相同的方法设计并构建靶向其他5个基因的pdmp-mir载体，分别为fsp1、fth1、gpx4、nrf2及slc7a11；并针对每个基因分别设计靶向两个靶点的mirna。所构建的载体分别被命名为pdmhfsp1-1、pdmhfsp1-2、pdmhfth1-1、pdmhfth1-2、pdmhgpx4-1、pdmhgpx4-2、pdmhnrf2-1、pdmhnrf2-2、pdmhslc7a11-1及pdmhslc7a11-2。其靶点序列及用于构建靶向个基因pdmp-mir载体的化学合成的寡核苷酸序列见表2。表2.用于构建靶向不同基因pdmp-mirna载体的寡核苷酸名称序列(5′→3′)humanmir-fpn-ftgctgtctacctgcagcttacatgatgttttggccactgactgacatcatgtactgcaggtagahumanmir-fpn-rcctgtctacctgcagtacatgatgtcagtcagtggccaaaacatcatgtaagctgcaggtagacmurinemir-fpn-ftgctgtatacagactcactgatttgcgttttggccactgactgacgcaaatcagagtctgtatamurinemir-fpn-rcctgtatacagactctgatttgcgtcagtcagtggccaaaacgcaaatcagtgagtctgtatachumanmir-lcn2-ftgctgtaatgttgcccagcgtgaactgttttggccactgactgacagttcacggggcaacattahumanmir-lcn2-rcctgtaatgttgccccgtgaactgtcagtcagtggccaaaacagttcacgctgggcaacattacmurinemir-lcn2-ftgctgtcaagttctgagttgagtcctgttttggccactgactgacaggactcatcagaacttgamurinemir-lcn2-rcctgtcaagttctgatgagtcctgtcagtcagtggccaaaacaggactcaactcagaacttgacmir-neg-ftgctgaaatgtactgcgcgtggagacgttttggccactgactgacgtctccacgcagtacatttmir-neg-rcctgaaatgtactgcgtggagacgtcagtcagtggccaaaacgtctccacgcgcagtacatttchumanmir-fsp1-1-ftgctgcaaacaaacaaataaagtggagttttggccactgactgactccactttttgtttgtttghumanmir-fsp1-1-rcctgcaaacaaacaaaaagtggagtcagtcagtggccaaaactccactttatttgtttgtttgchumanmir-fsp1-2-ftgctgtaaacaaacaaacaaataaaggttttggccactgactgacctttatttttgtttgtttahumanmir-fsp1-2-rcctgtaaacaaacaaaaataaaggtcagtcagtggccaaaacctttatttgtttgtttgtttachumanmir-fth1-1-ftgctgatcccaagacctcaaagacaagttttggccactgactgacttgtctttggtcttgggathumanmir-fth1-1-rcctgatcccaagaccaaagacaagtcagtcagtggccaaaacttgtctttgaggtcttgggatchumanmir-fth1-2-ftgctgtaaggaatctggaagatagccgttttggccactgactgacggctatctcagattccttahumanmir-fth1-2-rcctgtaaggaatctgagatagccgtcagtcagtggccaaaacggctatcttccagattccttachumanmir-gpx4-1-ftgctgttcagtaggcggcaaaggcgggttttggccactgactgacccgcctttcgcctactgaahumanmir-gpx4-1-rcctgttcagtaggcgaaaggcgggtcagtcagtggccaaaacccgcctttgccgcctactgaachumanmir-gpx4-2-ftgctgaggaactgtggagagacggtggttttggccactgactgaccaccgtctccacagttccthumanmir-gpx4-2-rcctgaggaactgtggagacggtggtcagtcagtggccaaaaccaccgtctctccacagttcctchumanmirnrf2-1-ftgctgtactgattcaacatactgacagttttggccactgactgactgtcagtattgaatcagtahumanmir-nrf2-1-rcctgtactgattcaatactgacagtcagtcagtggccaaaactgtcagtatgttgaatcagtachumanmir-nrf2-2-ftgctgtttacacttacacagaaactagttttggccactgactgactagtttctgtaagtgtaaahumanmir-nrf2-2-rcctgtttacacttacagaaactagtcagtcagtggccaaaactagtttctgtgtaagtgtaaachumanmir-slc7a11-1-ftgctgaaatgatacagccttaacacagttttggccactgactgactgtgttaactgtatcattthumanmir-slc7a11-1-rcctgaaatgatacagttaacacagtcagtcagtggccaaaactgtgttaaggctgtatcatttchumanmir-slc7a11-2-ftgctgttgagttgaggaccagttagtgttttggccactgactgacactaactgcctcaactcaahumanmir-slc7a11-2-rcctgttgagttgaggcagttagtgtcagtcagtggccaaaacactaactggtcctcaactcaac通过pcr从paav-dcug-nt/hfl/mfl和paav-dmneg/dmhfl/dmmfl中分别扩增dcug-nt/hfl/mfl和dmneg/dmhfl/dmmfl序列。使用mlui(上游)和xbai(下游)限制位点，将dcug-nt/hfl/mfl和dmneg/dmhfl/dmmfl序列克隆到paav-mcs(vpk-410，stratagene)中，分别构建paav-dcug-nt/hfl/mfl和paav-dmneg/dmhfl/dmmfl载体。1.2.纳米粒子、细胞与培养dmsa包覆的fe3o4磁性纳米粒子(fenps)和聚乙烯亚胺(polyethylenimine，pei)修饰的四氧化三铁纳米粒子(fencs)购自南京东纳生物科技有限公司。本发明中使用的细胞包括kg-1a(人急性髓细胞性白血病细胞)、hl60(人淀粉样细胞性急性白血病细胞)、wehi-3(小鼠急性单核细胞白血病细胞)、hepg2(人肝癌细胞)、a549(人类肺癌细胞)、ht-29(人结肠癌细胞)、c-33a(人宫颈癌细胞)、skov3(人卵巢癌细胞)、panc-1(人胰腺癌细胞)、mda-mb-453(人乳腺癌细胞)、bgc-823/mgc-803/sgc-7901(人胃腺癌细胞)、kyse450/kyse510(人食道癌细胞)、hepa1-6(小鼠肝癌细胞)、b16f10(小鼠黑色素瘤细胞)、hek-293t(人类胎儿肾细胞)、hl7702(人正常肝细胞)、mrc5(人胚胎成纤维细胞)和ges-1(人正常胃粘膜上皮细胞)。三种白血病细胞系kg-1a、hl60和wehi-3用imem培养基(gibco)培养。hek-293t、hepg2、hepa1-6、c-33a、panc-1、mda-mb-453、b16f10、mrc-5、ges-1细胞用dmem培养基(gibco)培养。a549、ht-29、skov-3、bgc-823/mgc-803/sgc-7901、kyse450/kyse510和hl7702细胞用rpmi1640培养基(gibco)培养。三种培养基均添加10％的胎牛血清(hyclone)、100单位/ml的青霉素(thermofisherscientific)和100μg/ml的链霉素(thermofisherscientific)。将细胞在含有5％co2的潮湿培养箱中于37℃孵育。1.3.fenps的细胞毒性作用确定纳米粒子的最佳剂量。fenp的体外细胞毒性通过使用cck-8分析进行。将kg-1a、hl60、wehi-3、hepg2、hl7702和mrc-5细胞分别以5000细胞/孔的密度接种到96孔板中。将细胞培养过夜并用各种浓度(0μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml)的fenps处理多次。每种处理均使用六组细胞进行，每组进行四次重复。在处理后的不同时间点(0d、1d、2d、3d、4d和5d)将10μlcellcountingkit-8(cck-8)溶液(bs350b，biosharp)添加到每个孔中。在37℃下再孵育1小时后，使用酶标仪(biotek)测量450nm处的光密度。1.4.用基因调控工具和fenps处理细胞按照制造商的说明，使用lipofectamine2000(thermofisherscientific)用质粒转染细胞。简而言之，在转染前将细胞(1×105个细胞/孔)接种到24孔板中过夜。然后用500ng各种质粒转染细胞，包括pdcug-nt、pdcug-hfpn/pdcug-mfpn、pdcug-hlcn2/pdcug-mlcn2、pdcug-hfl/pdcug-mfl、pdmneg、pdmhf/pdmmf、pdmhl/pdmmfl。将转染的细胞培养24小时，然后在有或没有50μg/mlfenps的情况下孵育，再将细胞培养72小时。对于hl7702和mrc5，在用fenps处理之前，将细胞先在有或没有tnf-α(10ng/ml)的情况下培养1小时。fenps施用后24h、48h和72h，所有细胞均按照制造商的说明用吖啶橙/溴化乙锭染色。细胞在荧光显微镜(ix51，奥林巴斯)下成像，以观察活细胞和死细胞的数量。为了量化细胞凋亡，在施用fenps后72小时收集细胞，并根据制造商的说明使用annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒(美国，bd)进行检测。细胞的荧光强度用cytoflexlx流式细胞仪(beckman)定量。1.5.活性氧生产分析如步骤1.4所述，用fenps处理细胞。简而言之，将细胞接种在24孔板(1×105个细胞/孔)中，培养过夜。然后用500ng各种质粒转染细胞，包括pdcug-nt、pdcug-hfl/pdcug-mfl、pdmneg和pdmhfl/pdmmfl。将转染的细胞培养24小时，然后在有或没有50μg/ml的fenps孵育的情况下再培养48小时。根据制造商的说明，使用活性氧分析试剂盒(beyotime)将处理过的细胞用2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(dcfh-da)染色。在cytoflexlx流式细胞仪(beckman)上分析，荧光位移指示ros变化。1.6.铁含量测定细胞处理同步骤1.5。fenps给药48小时后，通过细胞完全消化确定细胞内铁。用pbs(ph7.0)洗涤细胞，收集并计数。然后通过离心沉淀细胞，重悬于50μl5m盐酸中，并在60℃下孵育4小时。再次离心细胞，并将上清液转移至96孔板。在每个孔中加入50μl新鲜制备的检测试剂(0.08％k2s2o8、8％kscn和3.6％hcl溶于水)，将微孔板在室温下孵育10分钟。使用酶标仪(biotek)测量490nm处的吸光度。用fecl3标准溶液生成的标准曲线归一化后获得的吸光度确定铁含量。铁报告为每个细胞的平均铁含量，以平均值除以每个样品中的细胞数计算。每个实验设置三个重复孔，重复至少六次。1.7.蛋白质印迹分析将细胞接种到6孔板中(2×105个细胞/孔)，并生长过夜。用1000ngpdcug-nt、pdcug-hfl、pdmneg和pdmhfl质粒dna分别转染每孔中的细胞。转染后48小时，根据制造商的说明，使用磷蛋白提取试剂盒(sa6034-100t，signalwayantibody，美国)制备全细胞提取物。通过sds-page解析蛋白裂解物(20μg/样品)，并使用使用westernblot(wb)检测目标蛋白，wb中检测目标蛋白所用的抗体分别为：gapdh兔单克隆抗体(ab181602，abcam，uk)、slc40a1兔多克隆抗体(ab58695，abcam，英国)、lipocalin-2兔多克隆抗体(ab63929，abcam，英国)。第二抗体为irdye800cw标记的山羊抗兔igg(licor)。pvdf印迹膜使用odyssey红外荧光成像系统(licor)成像并定量分析荧光强度。1.8.病毒准备将hek293t细胞接种到75cm2烧瓶中(5×106个细胞/瓶)，并培养过夜。然后按照制造商的说明使用lipofectamine2000转染细胞，转染dna为两种辅助质粒和一种paav质粒，其中两种辅助质粒为phelper和paav-rc(stratagene)，paav质粒包括paav-dcug-nt、paav-dcug-hfl/paav-dcug-mfl、paav-dmneg及paav-dmhfl/paav-dmmfl。转染后将细胞再培养72小时。然后按文献(genetherapy，2020,doi:10.1038/s41434-020-0128-x)所述方法收集病毒并进行纯化。使用引物aav-f/r通过qpcr确定aav的滴度(表3)。将定量的病毒等分并保存在-80℃备用。获得的病毒被命名为raav-dcug-nt、raav-dcug-hfl/raav-dcug-mfl、raav-dmneg和raav-dmhfl/raav-dmmfl。1.9.病毒评估将kg-1a、wehi-3和hl7702细胞接种到24孔板中(1×105个细胞/孔)，并培养12小时。然后以每个细胞1×105vg的病毒剂量，分别用raav-dcug-nt、raav-dcug-hfl/raav-dcug-mfl、raav-dmneg和raav-dmhfl/raav-dmmfl转染细胞。将转染的细胞培养24小时，然后在有或没有50μg/mlfenps的情况下孵育再培养细胞72小时。用吖啶橙/溴化乙锭对所有细胞进行染色并成像。使用cck-8测定法(bs350b，biosharp)检测细胞活力。1.10.基于铁纳米载体(fencs)的gift抑制癌细胞为了验证pei修饰的fe3o4铁纳米粒子(fencs)是否可以作为基因干扰载体的运载工具将基因干扰载体导入细胞，并同作为基因运载工具的铁纳米粒子一起发挥gift抑制癌细胞的作用，进行了两种细胞实验。为了将作为基因运载工具的铁纳米粒子与上文中用到的普通铁纳米粒子(fenps)进行区分，将作为基因运载工具的铁纳米粒子定义为铁纳米载体(fencs)。实验中使用了两个批次的fencs，分别称为fencs-1和fencs-2。第一种基于fencs的gift抑制癌细胞实验中，按照制造商的说明，将各种质粒(包括pdcug-nt、pdcug-hfl、pdmneg和pdmhfl)与fencs-1混合(1μgdna/μgfencs-1)，制备荷载质粒dna的fencs，即fencs-1@pdcug-nt、fencs-1@pdcug-hfl、fencs-1@pdmneg和fencs-1@pdmhfl。将细胞接种到24孔板中(1×105个细胞/孔)，培养过夜。之后用含有或不含有0.5μg荷载质粒dna的fencs及单独的质粒dna处理每孔细胞24小时；之后再用含有或不含有50μg/mlfenps的培养液继续培养细胞72小时。在不同时间点(24小时、48小时和72小时)用吖啶橙/溴化乙锭对不同处理的细胞进行染色并成像。第二种基于fencs的gift抑制癌细胞实验中，按照制造商的说明，将两种质粒(pdmneg和pdmhfl)与fencs-1及fencs-2混合(1μgdna/μgfencs-1)，制备荷载质粒dna的fencs，即fencs-1@pdmhfl和fencs-2@pdmhfl。将制备的fencs-1@pdmhfl和fencs-2@pdmhfl立即用于处理细胞或室温放置24小时后再处理细胞。将细胞接种到24孔板中(1×105个细胞/孔)，培养过夜。之后再用含有或不含有50μg/mlfencs(单独的fencs或荷载质粒dna的fencs)的培养液继续培养细胞72小时。在不同时间点(24小时、48小时和72小时)用吖啶橙/溴化乙锭对不同处理的细胞进行染色并成像。1.11.动物研究从中国常州卡文斯实验动物有限公司(changzhoucavenslaboratoryanimalco.ltd；china)购买平均体重为20g的四周龄balb/c雌性小鼠。本发明中的所有动物实验均遵循东南大学动物护理和使用委员会(中国南京)的准则和道德规范。荷瘤小鼠模型的建立方法为：将1×107个wehi-3细胞皮下移植到balb/c雌性小鼠大腿内侧；饲养1周后，用精密卡尺测量在体测量肿瘤大小。使用公式v＝(ab2)/2计算肿瘤体积，其中a是肿瘤最长直径，b是肿瘤最短直径。考虑到如果所有实验组都在同一时间进行，所需的动物和细胞数量则太大而难以管理，因此将动物实验分三批进行。在第一批动物实验中，将荷瘤小鼠随机分为六个治疗组(pbs，n＝6；fenps，n＝6；raav-dcug-nt，n＝6；raav-dcug-nt+fenps，n＝6；raav-dcug-mfl，n＝6；raav-dcug-mfl+fenps，n＝7)(n为小鼠只数)。每组小鼠分别静脉内注射pbs(ph7.0)、raav-dcug-nt、raav-dcug-nt、raav-dcug-mfl、raav-dcug-mfl。所有病毒的注射剂量均为1×1010vg/小鼠。第二天，对其中三个组(fenps、raav-dcug-nt+fenps和raav-dcug-mfl+fenps)的小鼠分别静脉注射fenps，剂量为3mg/kg体重。fenps注射后第7天，对小鼠实施安乐死并拍照，然后剥离肿瘤，如上所述测量和计算肿瘤大小。解剖小鼠，采集各种组织(包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肿瘤组织)，液氮冻存。在第二批动物实验中，将荷瘤小鼠随机分为五个治疗组(fenps，n＝6；raav-dmneg，n＝6；raav-dmmfl，n＝7；raav-dmneg+fenps，n＝7；raav-dmmfl+fenps，n＝6)。然后每组小鼠分别静脉内注射fenps、raav-dmneg、raav-dmmfl、raav-dmneg+fenps、raav-dmmfl+fenps。所有病毒和fenps的注射剂量同第一批动物实验，但在本批动物试验中，首先将raav(1×1010vg/小鼠)与fenps(3mg/kg体重)混合，再一次性静脉注射小鼠。注射后第7天，对小鼠实施安乐死并拍照，然后剥离肿瘤，如上所述测量和计算肿瘤大小。解剖小鼠，采集各种组织，液氮冻存。在第三批动物实验中，将荷瘤小鼠随机分为六个治疗组(pbs，n＝6；fencs，n＝6；paav-dmneg+fencs，n＝6；paav-dmmfl+fencs，n＝7；paav-dcug-nt+fencs，n＝6；paav-dcug-mfl+fencs，n＝7)。然后每组小鼠静脉内分别注射pbs(ph7.0)、fencs、paav-dmne+fencs、paav-dmmfl+fencs、paav-dcug-nt+fencs、paav-dcug-mfl+fencs。不同质粒和fencs的剂量分别为2mg/kg体重和3mg/kg体重。fencs注射后第7天，对小鼠实施安乐死并拍照，然后剥离肿瘤，如上所述测量和计算肿瘤大小。解剖小鼠，采集各种组织，液氮冻存。1.12.定量pcr根据制造商的说明，使用trizoltm(invitrogen)从fenps孵育48小时后的细胞或小鼠组织中分离总rna。根据制造商的说明，使用fastkingrt试剂盒(tiangen)制备cdna。使用tianamp基因组dna试剂盒(tiangen)从小鼠的各种组织中提取基因组dna(gdna)。使用hieffqpcrsybrgreenmastermix(yeasen)通过qpcr从cdna和gdna扩增目标基因。在abisteponeplus(appliedbiosystems)上评估每种处理的三份样品。将相对的mrna转录水平与gadph内部参考进行比较，并根据以下方程式计算为相对量(rq)：rq＝2–δδct。将病毒dna丰度相对于gadph内部参照物进行标准化，并根据以下公式进行计算：rq＝2–δct。cas13amrna表达水平显示为ct值。所有实验一式三份进行，并重复至少三遍。使用引物human/murinerela-f/r和human/murinegapdh-f/r通过定量pcr(qpcr)检测细胞中nf-κbrela/p65的表达。将结果以gapdh归一化，并通过2-δct方法进行分析。根据解链曲线分析，所有qpcr引物均具有扩增特异性，其序列见表3。表3.qpcr引物1.13.统计分析所有数据均以平均值±标准误差表示。并使用graphpadprism软件(graphpadsoftware)进行统计分析和作图。使用变异分析和学生t检验(student’st-test)对数据进行统计处理。p<0.05的差异被认为具有统计学意义。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p＜0.001。2.结果2.1.基因干扰铁凋亡疗法(gift)的原理和流程图3a和3b示意性地说明了基因干扰铁凋亡疗法(gift)的原理。gift由转录因子nf-κb激活的基因表达调控载体和fe3o4纳米颗粒(fenps)组成。nf-κb激活的基因表达调控载体由一个启动子dmp和下游效应基因构成，其中dmp启动子由一个nf-κb诱骗子序列和一个最小启动子序列构成。dmp是一种nf-κb特异性启动子，由于nf-κb是一种在炎症和癌症中被过度激活的转录因子，因此在nf-κb过度活化的癌细胞中，dmp可被nf-κb激活，驱动其下游效应基因的表达，而在正常细胞因无nf-κb表达，dmp启动子不能被激活，其下游效应基因也不表达。因此，dmp启动子是一种癌细胞特异性激活的启动子。当dmp控制的crispr/cas13a或mirna基因表达干扰系统转染到癌细胞中时，过度活化的nf-κb将与dmp结合以驱动cas13a或mirna的表达，所表达的cas13a蛋白可与u6启动子激活表达的grna组装成cas13a/grna复合物，而mirna经加工后risc复合物结合，cas13a-grna与mirna-risc复合物均可靶向降解目标mrna，抑制或敲低目标基因在癌细胞中的表达。本发明中，选择了和铁代谢相关的两个基因，即fpn和lcn2，为靶基因。fpn和lcn2在细胞内的功能均与铁的细胞外排相关，因此，通过降低这两种基因在癌细胞中的表达，可阻止细胞对fenps进入细胞后产生的大量铁离子的主动外排，造成铁离子堆积，引发细胞内ros水平显著升高，进而导致癌细胞发生显著的铁凋亡。而在正常细胞中，不能产生两种基因的干扰系统cas13a-grna或mirna，其表达不受影响，细胞可主动外排fenps进入细胞后产生的铁离子，维持铁稳态，从而对正常细胞不产生影响。2.2.癌细胞及正常细胞中nf-κbrela的表达nf-κb在几乎所有类型的肿瘤细胞中均被广泛激活。由于细胞内nf-κb的活性对于本发明是否可行至关重要，因此，首先使用定量pcr检测了三种白血病细胞(kg-1a、hl60和wehi-3)、其他15种癌细胞(包括hek-293t、hepg2、a549、ht-29、c-33a、skov3、panc-1、mda-mb-453、bgc-823/mgc-803/sgc-7901、kyse450/kyse510、hepa1-6及b16f10)以及两种人正常细胞系(hl7702和mrc5)中nf-κbrela/p65的水平。结果表明，在所有癌细胞系中均检测到不同水平的nf-κbrela/p65表达，但在正常细胞系(mrc-5和hl7702)中未检测到nf-κbrela/p65表达(图3c)。因此，nf-κb特异性启动子dmp可用于驱动效应基因在癌细胞中的特异性表达。2.3.fenps对细胞的体外作用为了评估fenps的细胞毒性作用，将三种白血病细胞(包括kg-1a、hl60和wehi-3)、一种实体瘤细胞hepg2以及两种人正常细胞(hl7702和mrc5)用各种浓度的fenps孵育5天，并在在处理后的不同时间点，使用cck-8分析细胞活力，建立细胞生长曲线。结果显示，在孵育时间内，fenps在低于50μg/ml时，对所有六种细胞系均无明显的细胞毒性作用(图4)，但当剂量大于50μg/ml时，fenps对正常细胞hl7702和mrc-5的生长产生显著影响(图4b)。此外，癌细胞对fenps的耐受性更强，100μg/ml的fenps处理对两种人白血病细胞(kg-1a和hl60)均未产生显著影响(图4a)，但对及小鼠白血病细胞wehi-3及人肝癌细胞hepg2已经产生显著的毒性(图4b)。因此，将50μg/ml作为fenps安全剂量用于进一步的研究，该剂量相当于在啮齿动物中静脉注射3mg·kg-1的剂量。2.4.基因干扰铁凋亡疗法(gift)的体外抗肿瘤作用首先考察了gift对白血病细胞的抑制作用。用各种质粒载体包括pdcug-nt、pdcug-hfpn/pdcug-mfpn、pdcug-hlcn2/pdcug-mlcn2、pdcug-hfl/pdcug-mfl、pdmneg、pdmhf/pdmmf、pdmhl/pdmml和pdmhfl/pdmmfl载体在24孔板中分别转染三种白血病细胞(kg-1a、hl60和wehi-3)。转染后24小时，转染后24小时，将细胞用含有活不含有50μg/mlfenps的培养液再分别24小时、48小时和72小时，用吖啶橙/溴化乙锭双染色检测细胞死活，并在72小时时间点收集平行处理的细胞，定量检测细胞凋亡。结果显示，通过与载体pdcug-hfpn/pdcug-mfpn、pdcug-hlcn2/pdcug-mlcn2、pdcug-hfl/pdcug-mfl、pdmhf/pdmmf、pdmhl/pdmml及pdmhfl/pdmmfl的组合，fenps使三种白血病细胞均发生显著凋亡(图5、图6、图7)；且这种杀灭作用呈现明显的时间依赖性(图5、图6、图7)。但单独的每种质粒、fenps以及阴性质粒(pdcug-nt及pdmneg)与fenps的组合，均在任何处理时间内未对所有细胞产生显著影响(图5、图6、图7)。更重要的是，在两种基因干扰载体(pdcug-hfl/pdcug-mfl和pdmhfl/pdmmfl)共表达时，fenps产生了最强的癌细胞杀灭作用(图5、图6、图7)，显示出两种基因共干扰的协同作用。此外，用流失细胞定量检测细胞的凋亡也显示与吖啶橙/溴化乙锭双染色检测相同的结果(图8、图9)。之后，考察了gift对实体瘤细胞的抑制作用。用各种质粒载体包括pdcug-nt、pdcug-hfpn、pdcug-hlcn2、pdcug-hfl、pdmneg、pdmhf、pdmhl和pdmhfl载体在24孔板中分别转染人肝癌细胞hepg2。转染后24小时，将细胞用含有活不含有50μg/mlfenps的培养液再分别24小时、48小时和72小时，用吖啶橙/溴化乙锭双染色检测细胞死活，并在72小时时间点收集平行处理的细胞，定量检测细胞凋亡。结果显示，通过与载体pdcug-hfpn、pdcug-hlcn2、pdcug-hfl、pdmhf、pdmhl及pdmhfl的组合，fenps均使hepg2细胞发生显著凋亡(图10)；且这种杀灭作用同样呈现明显的时间依赖性(图10)。但单独的每种质粒、fenps以及阴性质粒(pdcug-nt及pdmneg)与fenps的组合，均在任何处理时间内未对hepg2细胞产生显著影响(图10)。同样，在两种基因干扰载体(pdcug-hfl和pdmhfl)共表达时，fenps产生了最强的癌细胞杀灭作用(图10)，同样显示出两种基因共干扰的协同作用。为了考察gift的癌细胞特异性，用于处理hepg2相同方式处理了两种人正常细胞hl7702和mrc5。结果表明，所有载体单独或与fenps组合时，都未对两种产生显著影响(图11、图12)，这与这两种正常细胞中未检测到nf-κb表达(图3c)的结果是一致的。为了进一步观察nf-κb激活对gift发挥必不可少的作用，首先用pdcug-hfl及pdmhfl分别转染这两种细胞，之后用nf-κb激活剂tnf-α处理两种细胞，再用fenps处理两种细胞。结果发现这两种正常细胞也被gift显著杀灭(图11、图12)。表明只有nf-κb激活，gift才能发挥杀灭癌细胞的作用。此外，用流失细胞定量检测细胞的凋亡也显示与吖啶橙/溴化乙锭双染色检测相同的结果(图13、图14)。在hek-293t细胞中也观察到只有nf-κb激活gift才发挥作用。hek-293t细胞是一经过种病毒转染可表达大t抗原的人胚胎肾细胞，这种细胞虽然不被认为是一种癌细胞，但其nf-κb表达却被显著激活(图3c)，因此，pdcug-hfl及pdmhfl载体与fenps的组合同样对这种细胞产生了显著的杀灭作用(图15)。为了考察gift机制是否具有杀灭癌细胞的广谱性，用相同的处理方法处理了代表人类及小鼠不同癌肿的多种癌细胞，包括a549、ht-29、c-33a、skov3、panc-1、mda-mb-453、bgc-823/mgc-803/sgc-7901、kyse450/kyse510、hepa1-6、b16f10。由于在三种白血病细胞及人肝癌细胞hepg2细胞实验中共表达载体产生了最显著的癌细胞杀灭作用，仅将pdcug-hfl/pdcug-mfl和pdmhfl/pdmmfl载体用于更多癌细胞的实验。结果表明，pdcug-hfl/pdcug-mfl及pdmhfl/pdmmfl载体与fenps组合时，对各种癌细胞都产生了显著地杀灭作用(图16～图28)；且这种杀灭作用同样呈现明显的时间依赖性(图16～图28)。同样，单独的每种载体、fenps以及阴性质粒(pdcug-nt及pdmneg)与fenps的组合，均在任何处理时间内未对所有细胞产生显著影响(图16～图28)。为了评估dmp-cas13a-u6-grna(pdcug)和dmp-mir(pdmp-mir)两种工具的敲除效果。通过qpcr检测了fpn和lcn2基因的表达水平。结果表明，在癌细胞kg-1a、hl60和hepg2细胞中，靶向grna/mirna均显著下调了靶mrna的水平(图29a)。然而，在正常细胞hl7702细胞中未发现变化，进一步表明了dmp启动子的nf-κb特异性及癌细胞特异性(即仅在癌细胞中起作用)。为了进一步探索效应基因在癌细胞中的特异性表达，在上述四种细胞中检测了各种处理下cas13amrna的表达水平。结果表明cas13a仅在转染了pdcug-hfl与pdmhfl的癌细胞kg-1a、hl60和hepg2中均出现表达(图29a)；但在所有处理下的正常细胞hl7702中均未检测到cas13amrna(图29a)。这些结果表明，基于dmp的基因表达系统可以在癌细胞而不是正常细胞中被激活，这导致了效应基因仅在癌细胞中的特异性表达。之后，通过蛋白质印迹(wb)检测了fpn和lcn2的蛋白质水平。结果显示fpn和lcn2蛋白的表达在转染靶向质粒(pdmhfl和pdcug-hfl)的癌细胞kg-1a、hl60和hepg2中被显著抑制(图29b)。铁基纳米材料可通过fenton反应上调ros水平，从而在癌症中产生特定的杀伤作用。为了研究fenton反应是否在本发明的共培养物中发生并探究gift诱导癌细胞凋亡的潜在机制，通过测量了在三种白血病kg-1a、hl60和wehi-3以及一种实体瘤细胞hepg2在各种质粒(pdcug-hfl、pdcug-nt、pdmhfl及pdmneg)与fenps组合处理下细胞内活性ros水平和细胞内铁含量。结果表明，三种白血病细胞和hepg2在所有含有fenps的处理中，细胞内ros水平均发生增高(图30a；图31)，特别是当用pdcug-hfl及pdmhfl载体与fenps组合处理时，四种癌细胞中的ros水平急剧升高(图30a；图31)，这与上述检测表明的相同处理下这些癌细胞发生显著凋亡相一致(图8；图13)。细胞内铁含量检测表明，四种癌细胞在所有含有fenps的处理中，细胞内铁含量均发生增高(图30b)，特别是当用pdcug-hfl及pdmhfl载体与fenps组合处理时，四种癌细胞中的铁含量急剧升高(图30b),这与上述检测表明的相同处理下四种癌细胞中ros水平急剧升高相一致。说明癌细胞中铁外排相关靶基因fpn和lcn2的表达抑制与fenps相结合时，可造成细胞内铁含量急剧升高，从而引发细胞内ros水平的急剧升高，最终导致癌细胞的大量凋亡。这表明gift杀灭癌细胞的机制就是本发明设计的基因干扰放大的铁凋亡。2.5.基于病毒载体的gift体外抗肿瘤作用(评价病毒载体)为了确定fenps与pdmp-cas13a-u6-grna或pdmp-mirna的组合是否会影响体内肿瘤的生长。将dmp-cas13a-u6-grna和dmp-mirna包装到aav载体中，构建重组病毒raav-dcug-nt、raav-dcug-hfl/raav-dcug-mfl、raav-dmneg和raav-dmhfl/raav-dmmfl。用重组病毒感染三种细胞kg-1a、wehi-3和hl7702，之后在用含有或不含有fenps培养液再培养细胞72小时。结果表明，与两种非靶向raavs(raav-dcug-nt和raav-dmneg)相比，两种靶向raavs(raav-dcug-hfl/mfl和raav-dmhfl/dmmfl)与fenps的组合处理，引起kg-1a和wehi-3细胞的显著凋亡。而单独的raav-dcug-nt和raav-dmneg病毒、fenps以及raav-dcug-nt和raav-dmneg病毒与fenps的组合未显著影响这两种白血病细胞的生长(图32)。而在hl7702细胞中，所有病毒与fenps的单独或组合处理，均未引起明显的凋亡(图32)。2.6.基于铁纳米载体(fencs)的gift抑制癌细胞(评价纳米铁载体)为了探讨是否可用铁纳米粒子作为基因载体，将基因载体与铁纳米粒子合二为一，作为一种试剂实现gift处理，选择了一种pei修饰的fe3o4(fencs)作为dna转染剂，并将其定义为铁纳米载体(fencs)。运用两个批次的fencs(fencs-1和fencs-2)的进行两种gift抑制癌细胞实验。第一种基于fencs的gift抑制癌细胞实验中，用fencs-1荷载四种质粒(pdcug-nt、pdcug-hfl、pdmneg和pdmhfl)，制备成荷载质粒dna的fencs(fencs@dna)，获得fencs-1@pdcug-nt、fencs-1@pdcug-hfl、fencs-1@pdmneg和fencs-1@pdmhfl。用这些fencs-1@dna先处理血液癌细胞kg-1a进行dna转染，之后再用50μg/mlfenps再处理细胞，在不同时间点用吖啶橙/溴化乙锭染色法检测细胞生长。结果表明，单独的fenps及fencs@dna处理细胞，均未对细胞生长产生显著影响(图33)；但当用fencs-1@pdcug-hfl和fencs-1@pdmhfl与fenps共同处理细胞时，细胞发生显著的时间依赖性死亡(图33)，而用fencs-1@pdcug-nt和fencs-1@pdmneg与fenps共同处理细胞时，也不会对细胞生长产生显著影响(图33)。运用同样方法还处理了实体瘤细胞hepg2，取得相似的结果(图34)。说明用铁纳米粒子作为基因转染剂也可以将基因干扰载体导入细胞，产生gift抑制癌细胞的效果。此外，本试验还表明fencs-1虽然也是纳米铁，但由于使用的剂量有限，单独使用fencs-1@pdcug-hfl和fencs-1@pdmhfl处理两种癌细胞均未对其生长产生影响。显然，在上述实验中使用两种体纳米粒子(fenps和fencs)比较繁琐，本发明尝试去除fenps，单独使用fencs并提高其剂量，观察是否也能gift抑制癌细胞的作用。因此，在第二种基于fencs的gift抑制癌细胞实验中，将两种质粒(pdmneg和pdmhfl)分别与fencs-1及fencs-2混合，制备fencs@dna，获得fencs-1@pdmhfl和fencs-2@pdmhfl。用制备的fencs-1@pdmhfl和fencs-2@pdmhfl按50μg/ml的剂量处理白血病细胞kg-1a。结果表明，单独的fencs及dna处理细胞，均未对细胞生长产生显著影响(图35)；但当用fencs-1@pdmhfl和fencs-2@pdmhfl处理细胞时，细胞发生显著的时间依赖性死亡(图35)。为了进一步考察fencs@dna的稳定性，即dna会否从fencs上短时间内脱落，影响体内转染细胞的效率，将制备好的fencs-1@pdmhfl和fencs-2@pdmhfl放置24小时(fencs@dna静脉注射后到达癌细胞有一定的时间)，之后再用于处理细胞。结果表明，放置后荷fencs@dna对对癌细胞仍有相似的杀灭效果(图35)。2.7.gift的体内抗肿瘤作用动物实验：对balb/c雌性小鼠移植wehi-3细胞，共进行三批动物实验。第二批动物实验中进行了基于raav-dcug-mfl的肿瘤抑制实验。对六组荷瘤小鼠进行了不同的治疗处理，包括pbs、fenps、raav-dcug-nt、raav-dcug-nt+fenps，raav-dcug-mfl和raav-dcug-mfl+fenps。结果表明，raav-dcug-mfl+fenps治疗组产生显著的抑瘤效果，而其他各治疗组均未产生显著的抑瘤效果(图36a和图36b)。第二批动物实验中我进行了基于raav-dmmfl的肿瘤抑制实验。对五组荷瘤小鼠进行了不同的治疗处理，包括fenp、raav-dmneg、raav-dmmfl、raav-dmneg+fenps和raav-dmmfl+fenps。结果表明，raav-dmmfl+fenps治疗组产生显著的抑瘤效果，而其他各治疗组均未产生显著的抑瘤效果(图36a和图36b)。第三批动物实验中，考察了基于铁纳米粒子直接荷载质粒dna的肿瘤抑制实验。该实验中用一种基于氧化铁纳米材料的dna转染试剂fencs进行体内dna递送。对六组荷瘤小鼠进行了不同的治疗处理，包括pbs、fencs、paav-dmneg+fencs、paav-dmmfl+fencs、paav-dcug-nt+fencs和paav-dcug-mfl+fencs。结果表明，荷载两种靶向质粒(paav-dcug-mfl和paav-dmmfl)的fencs显著抑制了肿瘤生长受到了显著抑制，而单独的fencs与荷载两种非靶向质粒(paav-dcug-nt和paav-dmneg)的fencs未产生显著地肿瘤生长抑制(图37a和图37b)。为了进一步证明raav载体在体内的肿瘤特异性表达，检测了三批动物实验中各种组织中的raavdna(第一、第二批动物实验)和paavdna(第三批动物实验)的丰度，以及cas13a和靶基因的表达。qpcr检测表明，raavdna和paavdna再各种组织中均有不同程度分布，但在肿瘤组织中分布水平最高，其次为肝脏(图36c、图37c)。qpcr检测还表明，cas13amrna仅在肿瘤组织中出现，即cas13a仅在肿瘤组织中有表达(图36d、图37d)；此外，两个靶基因fpn和lcn2的在各种组织中均有不同程度的表达，但fpn基因在肝脏和肾脏组织中表达最高，而lcn2基因在肿瘤组织中表达最高(图36e和36f、图37e和图37f)。经各种治疗处理后，这两个靶基因的表达仅在肿瘤中被含有raav-dcug-mfl、raav-dmmfl、paav-dcug-mfl和paav-dmmfl的处理显著下调(图36e和图36f、图37e和图37f)。这些结果说明在体内dmp控制的cas13a及mirna仅在肿瘤组织被激活表达，从而敲低了靶基因仅在肿瘤组织中的表达，反映了dmp启动子在体内的肿瘤特异性激活。2.8.靶向其他基因的gift体外抑制癌细胞生长为了进一步考察靶向其他基因的gift是否也具有相似的抗肿瘤作用，也为了进一步gift杀灭肿瘤细胞的机制，设计并构建靶向其他5个基因的pdmp-mir载体，分别为fsp1、fth1、gpx4、nrf2及slc7a11，并针对每个基因分别设计靶向两个靶点的mirna。所构建的载体分别被命名为pdmhfsp1-1、pdmhfsp1-2、pdmhfth1-1、pdmhfth1-2、pdmhgpx4-1、pdmhgpx4-2、pdmhnrf2-1、pdmhnrf2-2、pdmhslc7a11-1及pdmhslc7a11-2。所选择的上述5个基因都与细胞铁代谢、ros调控及铁凋亡密切相关，其中gpx4与fsp1是铁凋亡相关基因、fth1为参与细胞内铁离子储存的铁蛋白编码基因、nrf2是一种氧化还原相关转录因子、slc7a11是参与细胞内还原剂谷胱甘肽合成的胱氨酸膜输入蛋白。fth1有利于储存细胞内多余的铁离子，以维持细胞内铁稳态；slc7a11向细胞内输入胱氨酸以便细胞合成谷胱甘肽，以利清除细胞内ros；我们推测利用靶向这些基因的pdmp-mir载体敲低它们在癌细胞中的表达，有利于在fenps处理细胞时，增加细胞内铁离子含量、增加ros水平，从而有利于促进细胞铁凋亡。通过选择一种白血病细胞kg-1a、两种实体瘤细胞hepg2(人肝癌细胞)和bgc823(人胃癌细胞)，以及两种对应的人正常细胞hl7702(人正常肝细胞)和ges-1(人正常胃粘膜上皮细胞)测试上述载体。通过对处理不同时间点细胞的吖啶橙/溴化乙锭染色成像及cck-8法测定细胞活力，结果表明，单独每种载体对上述5种细胞生长均没有显著影响(图38～图42)，而当它们与fenps组合使用时，对3种癌细胞(kg-1a、hepg2、bgc823)均产生时间依赖性显著杀灭作用(图38～图40)，但对两种正常细胞均没有显著影响(图41、图42)。阴性对照载体pdmneg单独或与fenps组合时，对上述5种细胞的生长均没有显著影响(图38～图42)。此外，还进行了5种基因pdm载体的共转染(miffgns)试验，发现这种共转染即使在没有fenps的情况下，就能够显著抑制3种癌细胞(kg-1a、hepg2、bgc823)的生长(图38～图40)，而对正常细胞没有影响(图41、图42)；但当这种共转染在fenps存在时，产生了对癌细胞极其显著的杀灭作用，其效果超过了每种载体单独与fenps组合对癌细胞的杀灭作用(图38～图40)。说明5种基因具有协同作用。用cck8法测定各种处理下各种细胞的活力，结果与吖啶橙/溴化乙锭染色结果一致，同时更清楚地表明5种基因具有显著的协同作用(图43)。序列表<110>东南大学<120>一种基于基因干扰载体和铁纳米粒子用于杀灭癌细胞的组合物及其应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>4246<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagag60ataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtaga120aagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcat180atgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaagga240cgaaacaccgatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacgggtcttcgagaaga300cctggatccggcctaactggccggtaccgggaatttccggggactttccgggaatttccg360gggactttccgggaatttcctagagggtatataatggaagctcgacttccaggtcgacgc420gtaagcttgccaccatgccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcag480ccatgaaagtgaccaaggtcgacggcatcagccacaagaagtacatcgaagagggcaagc540tcgtgaagtccaccagcgaggaaaaccggaccagcgagagactgagcgagctgctgagca600tccggctggacatctacatcaagaaccccgacaacgcctccgaggaagagaaccggatca660gaagagagaacctgaagaagttctttagcaacaaggtgctgcacctgaaggacagcgtgc720tgtatctgaagaaccggaaagaaaagaacgccgtgcaggacaagaactatagcgaagagg780acatcagcgagtacgacctgaaaaacaagaacagcttctccgtgctgaagaagatcctgc840tgaacgaggacgtgaactctgaggaactggaaatctttcggaaggacgtggaagccaagc900tgaacaagatcaacagcctgaagtacagcttcgaagagaacaaggccaactaccagaaga960tcaacgagaacaacgtggaaaaagtgggcggcaagagcaagcggaacatcatctacgact1020actacagagagagcgccaagcgcaacgactacatcaacaacgtgcaggaagccttcgaca1080agctgtataagaaagaggatatcgagaaactgtttttcctgatcgagaacagcaagaagc1140acgagaagtacaagatccgcgagtactatcacaagatcatcggccggaagaacgacaaag1200agaacttcgccaagattatctacgaagagatccagaacgtgaacaacatcaaagagctga1260ttgagaagatccccgacatgtctgagctgaagaaaagccaggtgttctacaagtactacc1320tggacaaagaggaactgaacgacaagaatattaagtacgccttctgccacttcgtggaaa1380tcgagatgtcccagctgctgaaaaactacgtgtacaagcggctgag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