一种含维生素K1的药物组合物及其制备方法和用途

一种含维生素k1的药物组合物及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明涉及一种含维生素k1的药物组合物，其制备方法及其用途。


背景技术：

2.在正常的血液凝固过程中，维生素k1作为微粒体酶的辅助因子发挥着不可或缺的作用。当缺乏维生素k1时，肝脏则合成一些活性低或结构异常的凝血酶原，血液凝固迟缓造成出血。摄入不足、长期低脂饮食、严重肝病、胆道疾病、长期使用抗生素导致肠道菌群失调等均会导致成人维生素k1缺乏或利用障碍。香豆素类、水杨酸钠等药物或毒物也会导致维生素k1缺乏。
3.随着国家对毒鼠强、氟乙酰胺等剧毒的致惊厥杀鼠剂禁用，抗凝血杀鼠剂，尤其是第2代香豆素类抗凝血杀鼠剂的应用日趋广泛。由于其容易获得、用途广泛，故常常发生误服、吸入或皮肤接触引起中毒的事故。抗凝血类杀鼠剂以及抗凝血类除草剂在体内作用机制与华法林类似，其能够竞争性抑制维生素k的还原，使维生素k参与谷氨酸c-羧基形成的过程受到干扰，不能合成正常的凝血因子，阻碍正常的凝血过程。抗凝血类杀鼠剂中毒起初没有明显体征和症状，几天后表现为严重的、甚至长达数个月的出血，伴随恶心、呕吐、食欲缺乏及精神不振。杀鼠药生物半衰期长，在血清中约超过90天，在肝脏中超过10个月，所以中毒症状一旦表现出来是致命的。即使在误服相对少量(约15mg)时，若没有及时治疗也能威胁人类生命。
4.维生素k1在临床上是治疗维生素k1缺乏引起的出血的主要药物，是抗凝血杀鼠剂的特效解毒剂。我国市场上的维生素k1产品主要是维生素k1注射液，供静脉注射或肌肉注射；除此之外，尚有普通维生素k1片。目前维生素k1普通制剂在临床应用上，尤其是抗凝血杀鼠剂中毒救治中存在严重不足。由于抗凝血杀鼠剂在体内代谢极慢(如溴鼠灵人体内半衰期为243～1656h)，常需要3个月以上才能完全排出体外，因此中毒患者在出院后仍需补充维生素k1长达2个月以上。目前临床上主要应用的维生素k1注射液存在较严重的不良反应。超剂量使用、超说明书适应症范围用药和注射液中含有的合成增溶剂是维生素k1注射液严重不良反应的主要原因。而且大剂量和长时间应用维生素k1注射液也将给患者带来不便和痛苦。口服维生素k1是首选和最推荐的治疗方式。但目前维生素k1固体口服制剂来源少，且为普通片剂，每日需多次给药，长期频繁给药造成患者顺应性差，而患者的坚持不良可能导致危及生命的出血症状复发。
5.鉴于抗凝血杀鼠剂中毒治疗的特点，长效缓释制剂在减少服药次数，提高患者的顺应性；降低血药峰浓度，平稳血药浓度，降低副作用等方面具有潜在的优势，最能切合抗凝血杀鼠剂中毒临床救治的需求。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种含有维生素k1的药物组合物，该组合物利用血细胞负载维生素k1，特别是以血细胞负载载有维生素k1的药物载体，所述载有维生素k1的药物载体
可以为纳米粒、胶束、纳米乳、或脂质体的形式，在体内循环时间长，无毒，无免疫原性，能够延长维生素k1药物的半衰期，降低其毒副作用。
7.鉴于此，本发明第一方面，提供一种药物组合物，其包括血细胞和载有维生素k1的药物载体，所述载有维生素k1的药物载体包封于血细胞内或所述载有维生素k1的药物载体负载于血细胞的表面。
8.可选地，所述载有维生素k1的药物载体选自纳米粒、胶束、纳米乳或脂质体；可选地，选自纳米粒、胶束或纳米乳；可选地，为纳米粒。
9.可选地，所述血细胞选自红细胞、白细胞或血小板；可选地，所述血细胞为红细胞。
10.可选地，相对于每毫升血细胞，维生素k1的含量为0.001～2mg，可选为0.1～1mg。
11.可选地，本发明的药物组合物为维生素k1壳聚糖纳米粒-红细胞组合物，所述维生素k1壳聚糖纳米粒包封于血细胞内或负载于血细胞的表面；可选地，所述药物组合物中，以壳聚糖含量计，维生素k1壳聚糖纳米粒的浓度为0.5-1.5mg/ml。
12.本发明第二方面，提供上述第一方面所述药物组合物的制备方法，其特征在于，
13.包括如下步骤：(1)将血细胞与载有维生素k1的药物载体混合，在所述混合前和/或混合后，加入缓冲溶液调节渗透压，使血细胞预膨胀打开膜孔，使载有维生素k1的药物载体进入血细胞内；(2)加入缓冲溶液调节渗透压，使所述膜孔封闭，将载有维生素k1的药物载体包封于血细胞内；
14.或者，包括如下步骤：采用静电作用、化学交联作用、标记后亲和作用或脂质插入的方法，将载有维生素k1的药物载体负载于血细胞表面；
15.可选地，将血细胞进行分子标记或基团修饰，和/或将载有维生素k1的药物载体进行分子标记或者基团修饰，然后将血细胞与载有维生素k1的药物载体混合，使载有维生素k1的药物载体负载于血细胞表面。
16.本发明第三方面，提供一种药物组合物，其特征在于，包括血细胞和维生素k1，该药物组合物包括：将维生素k1溶解于二甲基亚砜(dmso)溶剂中，然后再与血细胞进行混合的制备步骤；
17.可选地，该药物组合物采用如下制备步骤：
18.(1)将维生素k1溶解于二甲基亚砜(dmso)中；(2)然后与血细胞进行混合，在与血细胞进行混合前和/或混合后，加入缓冲溶液调节渗透压，使血细胞预膨胀打开膜孔，使维生素k1进入血细胞内；(3)加入缓冲溶液调节渗透压，使所述膜孔封闭，将维生素k1包封于血细胞内。
19.可选地，所述血细胞选自红细胞、白细胞或血小板；可选地，所述血细胞为红细胞。
20.可选地，在第(2)步中，将维生素k1溶解于dmso中的溶液与血细胞进行混合后，混合物中dmso的体积百分数为10％至16％，可选为10％至14％，可选为10-12％。
21.可选地，相对于每毫升血细胞，维生素k1的含量为0.001～2mg，可选为0.1～1mg。
22.本发明中，所述血细胞的体积以压积血细胞的体积计。
23.本发明第四方面，提供上述药物组合物在制备用于治疗或预防各种原因引起的维生素k1依赖性凝血因子过低导致的凝血障碍的药物、抗凝血药或抗凝血杀鼠剂中毒的解毒药物、预防或治疗伴有凝血功能改变的梗阻性黄疸(如胆、胰疾病)的药物中的用途。
24.有益效果：
25.本发明提供一种含有维生素k1的药物组合物，以血细胞负载维生素k1，特别是以血细胞负载载有维生素k1的药物载体，所述载有维生素k1的药物载体可以为纳米粒、胶束、纳米乳、或脂质体的形式。该药物组合物使得维生素k1的半衰期延长，有效减少给药频率，有利于患者的维持治疗并提高患者的顺应性，可降低并平稳血药浓度，减少药物浓度过高或波动导致的毒副作用。
附图说明
26.图1为实施例4中维生素k1壳聚糖纳米粒-红细胞组合物的扫描电镜照片；
27.图2为实施例5中维生素k1壳聚糖纳米粒的透射电镜照片；
28.图3为实施例5中维生素k1壳聚糖纳米粒-红细胞组合物的扫描电镜照片；
29.图4为试验例2中的pbs浓度与溶血比率曲线图；
30.图5为试验例3中维生素k1血浆药物浓度-时间曲线图。
具体实施方式
31.下面将结合实施例和试验例对本发明进行说明。应该理解，下列实施例和试验例仅用于示例性地说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例和试验例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
32.实施例1：红细胞的收集
33.采集全血于肝素钠真空管内，1300
×
g离心除去上清液以及中间的白细胞、血小板等，下层红细胞加入4倍体积的无菌生理盐水溶液轻轻混匀，850
×
g 5min离心洗涤三次，除去上清后即得洗涤后的压积红细胞，静置于4℃冰箱内备用。
34.实施例2：维生素k1纳米乳-红细胞组合物的制备
35.称取维生素k1原料药，加入吐温80以及peg-400(维生素k1：吐温80：peg-400＝1:2:1；质量比)，涡旋混合20min。取上述溶液适量(0.5ml)加入无菌生理盐水溶液(50ml)中，边加边搅拌，即可获得自乳化纳米乳溶液，纳米乳粒径约40nm。
36.取适量实施例1下压积红细胞，加入等体积上述纳米乳溶液，混合均匀。加入适量蒸馏水调节体系渗透压至150mosm
·
kg-1
，4℃静置载药20min。加入1.5mol
·
l-1
的氯化钾溶液调节渗透压至等渗，轻轻混匀后于37℃孵育30min重新封闭红细胞。
37.实施例3：维生素k1胶束-红细胞组合物的制备
38.取0.2mmol的epc(卵磷脂)溶于3.8ml的氯仿溶液，加入20mg维生素k1原料药于通风橱内搅拌混匀5min，30℃减压除去氯仿。于700rpm磁力搅拌条件下逐滴加入含0.24mmol甘氨胆酸的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.3)8ml，磁力搅拌4h，0.22μm滤膜挤压过滤三次，得澄清的维生素k1胶束溶液，粒径约10nm。取适量以低渗nacl溶液稀释。
39.取适量实施例1的压积红细胞，加入4倍体积的低渗nacl溶液，调节渗透压至150mosm
·
kg-1
，于4℃预膨胀20min，580
×
g离心除去上清。加入等体积的上述稀释后的维生素k1胶束溶液，4℃静置载药20min。加入1.5mol
·
l-1
的氯化钾溶液调节渗透压至等渗，轻轻混匀后于37℃孵育30min重新封闭红细胞。
40.实施例4：维生素k1壳聚糖纳米粒-红细胞组合物的制备
41.称取10mg壳聚糖粉末，加入100ml 0.1m的hcl溶液，搅拌使之溶解，过滤后得壳聚糖溶液。于壳聚糖溶液中缓慢滴加维生素k1与epc的乙醇溶液(epc 20mg，维生素k
1 3mg)1ml，磁力搅拌1h。于16000rpm离心30min除去游离的药物等，获得维生素k1壳聚糖纳米粒，粒径约130nm，zeta电位为+17.9mv。
42.取实施例1压积红细胞200μl，加入以无菌生理盐水重悬的维生素k1壳聚糖纳米粒1.5mg/ml溶液1000μl，37℃孵育30min。所得组合物的扫描电镜照片见图1。
43.实施例5：维生素k1壳聚糖纳米粒-红细胞组合物的制备
44.称取适量壳聚糖粉末，以0.5mg/100ml的乙酸溶液溶解制备0.5mg
·
ml-1
的壳聚糖溶液，取该溶液10ml加入0.5m的naoh溶液调节ph至4.0，逐滴加入2mg
·
ml-1
的维生素k1乙醇溶液1.5ml，搅拌均匀后缓慢滴加2mg
·
ml-1
的三聚磷酸钠溶液0.83ml，室温搅拌30min。16000rpm离心30min，除去上清液，即得淡黄色的壳聚糖纳米粒，粒径约300nm，zeta电位为+25.7mv，其投射电镜照片见图2。
45.取实施例1压积红细胞200μl，加入以无菌生理盐水重悬的维生素k1壳聚糖纳米粒溶液1000μl，37℃孵育30min，得到的维生素k1壳聚糖纳米粒-红细胞组合物中，以壳聚糖的含量计，维生素k1壳聚糖纳米粒的浓度为1.0mg/ml。所得组合物的扫描电镜照片见图3。
46.实施例6：维生素k
1-红细胞组合物的制备
47.称取维生素k1原料药，将维生素k1溶解于二甲基亚砜(dmso)中，配制成2mg
·
ml-1
的维生素k1溶液。取上述溶液适量，以适量血浆溶液进行稀释，混匀后加入蒸馏水调节渗透压至150mosm
·
kg-1
。
48.取适量实施例1下压积红细胞，加入4倍体积的低渗nacl溶液，于4℃预膨胀20min，580
×
g离心除去上清。加入等体积的上述维生素k1药物溶液(维生素k1浓度为50μg/ml)，4℃静置载药20min。加入1.5mol
·
l-1
的氯化钾溶液调节渗透压至等渗，轻轻混匀后于37℃孵育30min重新封闭红细胞。经测定载药量为74.48μg/毫升红细胞，包封率为9.81％。
49.实施例7：维生素k1壳聚糖纳米粒-红细胞组合物的制备
50.取实施例1的压积红细胞1ml，重悬于9ml pbs中(含5mm葡萄糖)。取biotin-nhs溶解于90％的二甲基亚砜中，配制成浓度为100mg/ml的biotin-nhs溶液。取5μl biotin-nhs溶液加入红细胞悬液中，于37℃孵育1h。生理盐水洗涤3次即得biotin标记的红细胞。
51.取biotin-nhs溶解于dmf中，配制成1mg/ml的溶液。边搅拌边逐滴加入1％壳聚糖溶液。室温搅拌反应20h。装入透析袋，多次透析去除未反应biotin-nhs。冷冻干燥即得biotin-壳聚糖。然后按照实施例5的方法，不同的是将实施例5所用的壳聚糖粉采用biotin-壳聚糖替换，制备biotin标记的维生素k1壳聚糖纳米粒。
52.取biotin标记的红细胞200μl，加入以无菌生理盐水重悬的biotin标记的维生素k1壳聚糖纳米粒溶液1000μl，37℃孵育30min。
53.实施例8：维生素k1plga纳米粒-红细胞组合物的制备
54.取dspe-peg-plga 20mg、维生素k
1 1mg溶解于2ml丙酮中，边搅拌边逐滴加入5ml pbs溶液。加入完毕继续搅拌1h。于旋转蒸发仪上减压去除丙酮。经0.45μm滤膜过滤即得维生素k
1-plga纳米粒。
55.取实施例1的压积红细胞200μl，加入1ml维生素k
1-plga纳米粒，混合均匀，于37℃孵育1h。
56.试验例1：磷酰丝氨酸暴露量测定
57.在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(ps)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而细胞发生凋亡早期，膜ps由脂质膜内侧翻向外侧。ps暴露量越大，代表红细胞所受损伤越大，红细胞活性越低。因此，检测ps暴露量能够考察药物对红细胞的损害程度。按实施例5方法，制备不同浓度(以壳聚糖含量计)的维生素k1壳聚糖纳米粒(cs-nps)的载药红细胞。采用酶联免疫吸附试验法测定ps暴露量。以不加维生素k1壳聚糖纳米粒溶液，按照载药方法处理的红细胞作为对照组(a)；以未经任何处理的正常红细胞(实施例1的压积红细胞)作为空白组(b)。结果如下表所示。
[0058][0059]
由结果可知，对照组(a)的ps浓度与空白组(b)相比没有明显变化，这表明载药方法的处理过程基本未对红细胞造成明显损伤。cs-nps的浓度在1.5mg/ml以下时可维持红细胞的活性不发生明显变化。
[0060]
试验例2：渗透脆性试验
[0061]
红细胞活性的一个评价指标是渗透脆性，其用于表征红细胞对因环境渗透压改变而引起的溶血的抵抗能力。取实施例5制备的维生素k1壳聚糖纳米粒-红细胞组合物(载药红细胞)进行渗透脆性测定，以未经任何处理的正常红细胞(实施例1的压积红细胞)作为空白对照组。取pbs缓冲溶液加适量蒸馏水稀释，分别配制成浓度(v/v)为1.00、0.68、0.60、0.56、0.52、0.48、0.44、0.40、0.36、0.32、0.28、0.24、0.16、0.08、0的pbs溶液。取上述系列浓度的pbs溶液5ml，加入载药红细胞或空白红细胞100μl，于37℃孵育20min后离心除去红细胞，以pbs缓冲溶液为空白在540nm处测定吸光度，计算溶血比例。结果如图4所示。
[0062]
实验结果表明，载药对红细胞的渗透脆性没有明显影响。其中，与未经处理的红细胞相比，在pbs浓度(v/v)为1～0.52范围内，载药红细胞渗透脆性与未经处理的红细胞基本一致。
[0063]
试验例3：大鼠药动学试验
[0064]
试验方法：sd大鼠，雄性，8只，随机分为2组。其中一组为载药红细胞组：按实施例5的方法进行载药，测定红细胞载药量。另一组为维生素k1注射液(遂成药业股份有限公司)组。尾静脉注射载药红细胞或维生素k1注射液，给药剂量为500μg/只。于给药前和给药后2min、5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h，于眼眶取血0.5ml。3000rpm离心10min分离血浆，以格列本脲为内标，hplc-ms/ms测定血浆维生素k1浓度。
[0065]
试验结果：图5显示的是维生素k1血浆药物浓度-时间曲线图，其中，左图为注射液
组，右图为载药红细胞组。
[0066]
由图5可见，注射液组给药后维生素k1血浆药物浓度高达数千ng/ml，随后迅速下降，至24h后已检测不到药物。而载药红细胞组给药后维生素k1血浆药物浓度维持在较低水平可达5天之久。以上结果表明：本发明的维生素k1药物组合物可以大大延长药物作用的时间。另一方面，血药浓度大大降低并维持平稳，有助于降低过高血药浓度造成的药物毒副作用，并且平稳药效。
[0067]
对比实施例1：维生素k
1-红细胞组合物的制备
[0068]
采用实施例6相同的方法，所不同的是，将维生素k1分别溶解于乙醇、乙腈、丙酮等有机溶剂中。
[0069]
在上述实施例6和对比实施例1制备维生素k
1-红细胞组合物的过程中，如下表所示：当有机溶剂分别采用乙醇、乙腈和丙酮时，红细胞中加入等体积的维生素k1溶液后，有机溶剂体积百分数约大于10％时，红细胞即发生不同程度的溶血，即对红细胞膜及其活性造成损害。而当有机溶剂为dmso时，其体积百分数约为16％时，才发生轻度溶血。
[0070][0071]
注：-：未溶血；+：轻度溶血；++：中度溶血；+++：重度溶血。
[0072]
并且，当有机溶剂分别采用乙醇、乙腈和丙酮时，有机溶剂的体积百分数低于12％时，在稀释制备低渗药物溶液的过程中药物会析出形成沉淀。而有机溶剂采用dmso时，有机溶剂的体积百分数为10％，在稀释制备低渗药物溶液的过程中药物未出现析出沉淀的现象。