基于人iPSCs诱导类肝细胞及多层多孔生物反应器的生物人工肝的制作方法

本发明涉及生物人工肝技术领域，尤其涉及一种基于ipscs诱导类肝细胞及多层多孔生物反应器的生物人工肝。

背景技术：

生物人工肝（bioartificialliver，bal）是利用人源性或者动物源性肝脏细胞暂时或者部分替代体内的衰竭的肝脏功能，可以协助治疗肝衰竭或者相关肝脏疾病的一种新型肝脏支持系统。bal不仅具有肝脏解毒功能，而且可通过反应器内肝细胞达到肝脏合成、代谢、分泌等功能，有望在根本上代替肝脏的功能。近年来bal研究得到较大进展，并显示了其一定的肝脏支持作用。人类的肝癌细胞系如c3a细胞曾在美国的生物人工肝系统（elad）中使用，却有代谢功能较低的缺陷，而实验证明c3a的来源细胞hepg2实际并没有对alf小鼠的治疗效果；猪来源的原代肝细胞也曾被用在国外的amc-bal以及hepatassist系统；这些细胞来源在免疫源性上被人诟病（在临床应用后在体内发现猪抗性的igg），并具有动物来源病毒感染的风险。但是，要想完全达到体外肝脏支持替代作用，满足临床治疗需要，还有诸多问题需要解决。因此，建立高效、安全的bal支持系统，以及功能肝细胞的获得，是临床目前亟需解决的难题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种基于ipscs诱导类肝细胞及多层多孔生物反应器的生物人工肝，可有效降低异种病毒感染风险和免疫反应风险。

为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：一种基于人ipscs诱导类肝细胞及多层多孔生物反应器的生物人工肝，包括血浆分离/回输循环部分和细胞反应器/血浆成分交换双循环部分，两部分通过循环管路互相连接；

血浆分离/回输循环部分包括通过连接管路顺序相连的血液输入管、血液输入蠕动泵、肝素泵、血浆分离柱、第一压力监测仪和加热器，血液输入管与血液输入蠕动泵之间连接管路上设有排气管弹簧夹，血浆分离柱上设有血液入口、血浆出口和血细胞出口，血液入口与肝素泵的出口相连通；

细胞反应器/血浆成分交换双循环部分包括通过连接管路与血浆出口顺序相连的血浆输入蠕动泵及设置于37℃专用培养箱内的半透膜交换柱、血浆置换蠕动泵、红细胞池、膜肺、多层多孔生物反应器、第二压力监测仪和第三压力监测仪，半透膜交换柱上设有血浆下入口、血浆下侧出口、血浆上侧入口和血浆上出口，血浆下入口与血浆输入蠕动泵的出口相连通，血浆下侧出口与血浆置换蠕动泵的入口相连通，人ipscs诱导类肝细胞灌注在多层多孔生物反应器中，第二压力监测仪连通血浆上侧入口，血浆上出口连通第三压力监测仪，第三压力监测仪的出口与血细胞出口一并接入第一压力监测仪的入口，第一压力监测仪的出口依次连接加热器和血液输出管。

进一步地，所述血浆分离柱为膜型血浆分离器。

进一步地，所述半透膜交换柱为膜型血浆成分分离器，其半透膜孔径为11nm。

进一步地，所述红细胞池为装有110ml红细胞的硅橡胶袋，所述硅橡胶袋的前后端分别设有进出口，所述进出口与连接管路相连接。

进一步地，所述膜肺为膜式氧合器。

进一步地，所述连接管路采用医用级聚氯乙烯制成，其中，与血液输入蠕动泵和血浆输入蠕动泵相连的连接管路外径为13mm，其他处连接管路的外径均为5.7mm。

进一步地，所述多层多孔生物反应器包括罐体、罐盖和多层多孔平板装置，所述罐盖与罐体的上罐口螺纹连接，并通过上罐口套设的橡胶圈进一步密封，所述罐盖的上表面设置有细胞输入孔和培养液导出管，所述罐体的底部设置有培养液导入管，人ipscs诱导类肝细胞通过细胞输入孔输入罐体内，所述细胞输入孔上配设有密封盖，所述膜肺通过连接管路连通培养液导入管，所述第二压力监测仪通过连接管路连通培养液导出管，所述多层多孔平板装置上下滑动连接在罐体的内壁。

进一步地，所述多层多孔平板装置为至少一层的多孔平板，所述多孔平板包括平板、凹槽和底托，所述凹槽和底托分别环设于平板的上表面和下表面且位置正对，通过上多孔平板的底托插嵌在下多孔平板的凹槽中，上下相邻层多孔平板之间可拆卸连接，所述平板的表面均布有竖直镂空孔，所述竖直镂空孔纵向贯穿平板，所述底托为空心圆柱体，底托的侧壁设有水平镂空孔。

进一步地，所述罐体尺寸为126mm，高160mm，壁厚4mm，所述多层多孔平板装置包括50～60层多孔平板，所述多孔平板的平板采用直径120mm、厚1mm的聚碳酸酯圆形平板，所述聚碳酸酯圆形平板的外表面包被一层生长因子胶原。

进一步地，所述凹槽和底托在平板的上表面和下表面上下对应地分别环设内外2圈，每圈设6个或8个或11个凹槽和底托在平板中心的外周均匀分布，所述凹槽为直径11mm、深0.8mm的圆柱形凹槽，所述底托为直径11mm、高2mm的圆环形底托，所述竖直镂空孔和水平镂空孔均为直径2mm的圆孔。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1）本发明通过37℃专用培养箱控制生物人工肝血液流动全程37℃，保持了血液、细胞最佳状态所需温度，通过红细胞池、膜肺提供细胞所需氧气，从而保证血液、细胞所需的温度和供氧，提供生物人工肝效能；

2）本发明采用人源性细胞（人ipscs诱导类肝细胞）可降低异种病毒感染风险；

3）本发明通过多层多孔生物反应器的层数调整可有效调节细胞数量、增加有效交换面积，通过底托的水平镂空孔将流动液体辐射式均匀与细胞接触，降低流速对细胞的损伤，提高液体交换效率，充分进行物质交换；通过平板外表面生长因子胶原被覆聚碳酸酯包被降低剪切力、促进细胞黏附3d聚集生长、提高生物相容性；通过液体在多层多孔生物反应器内由下至上逆向流动促进液体交换效率；同时罐体容积大、承载细胞量多，可满足临床需求；

4）本发明通过半透膜交换柱进行物质交换，有效降低免疫反应风险。

附图说明

图1为本发明的生物人工肝整体结构示意图；

图2为图1的多层多孔生物反应器结构示意图：；

图3为图2多层多孔平板装置的多孔平板侧视图；

图4为图3的多孔平板俯视图。

其中的附图标记为：血液输入管1、血液输入蠕动泵2、肝素泵3、血浆分离柱4、血液入口4-1、血浆出口4-2、血细胞出口4-3、第一压力监测仪5、加热器6、排气管弹簧夹7、血浆输入蠕动泵8、37℃专用培养箱9、半透膜交换柱10、血浆下入口10-1、血浆下侧出口10-2、血浆上侧入口10-3、血浆上出口10-4、血浆置换蠕动泵11、红细胞池12、膜肺13、多层多孔生物反应器14、罐体14-1、罐盖14-2、多层多孔平板装置14-3、平板14-31、凹槽14-32、底托14-33、竖直镂空孔14-34、水平镂空孔14-35、生长因子胶原14-36、细胞输入孔14-4、培养液导出管14-5、培养液导入管14-6、第二压力监测仪15、第三压力监测仪16、血液输出管17。

具体实施方式

为了使本领域技术领域人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明的实施例作进一步详细描述。

如图1～4所示，一种基于人ipscs诱导类肝细胞及多层多孔生物反应器的生物人工肝，包括血浆分离/回输循环部分和细胞反应器/血浆成分交换双循环部分，两部分通过循环管路互相连接，连接管路采用医用级聚氯乙烯制成；

血浆分离/回输循环部分包括通过连接管路顺序相连的血液输入管1、血液输入蠕动泵2、肝素泵3、血浆分离柱4、第一压力监测仪5和加热器6，血液输入管1与血液输入蠕动泵2之间连接管路上设有排气管弹簧夹7，血浆分离柱4为膜型血浆分离器（可购自旭化成可乐丽医疗株式会社），血浆分离柱4上设有血液入口4-1、血浆出口4-2和血细胞出口4-3，血液入口4-1与肝素泵3的出口相连通；

细胞反应器/血浆成分交换双循环部分包括通过连接管路与血浆出口4-2顺序相连的血浆输入蠕动泵8及设置于37℃专用培养箱9内的半透膜交换柱10、血浆置换蠕动泵11、红细胞池12、膜肺13、多层多孔生物反应器14、第二压力监测仪15和第三压力监测仪16，其中，与血液输入蠕动泵2和血浆输入蠕动泵8相连的连接管路外径为13mm，其他处连接管路的外径均为5.7mm，半透膜交换柱10为膜型血浆成分分离器，其半透膜孔径为11nm（可购自川澄化学工业株式会社），半透膜交换柱10上设有血浆下入口10-1、血浆下侧出口10-2、血浆上侧入口10-3和血浆上出口10-4，血浆下入口10-1与血浆输入蠕动泵8的出口相连通，血浆下侧出口10-2与血浆置换蠕动泵11的入口相连通，红细胞池12为装有110ml红细胞的硅橡胶袋，硅橡胶袋的前后端分别设有进出口，血浆置换蠕动泵11出口与红细胞池12进口通过连接管路相连通，膜肺13为膜式氧合器（可购自威高集团有限公司），红细胞池12出口与膜肺13入口通过连接管路相连通，多层多孔生物反应器14包括罐体14-1、罐盖14-2和多层多孔平板装置14-3，罐体14-1尺寸为126mm，高160mm，壁厚4mm，罐盖14-2与罐体14-1的上罐口螺纹连接，并通过上罐口套设的橡胶圈进一步密封，多层多孔平板装置14-3上下滑动连接在罐体14-1的内壁（类似压衣片和洗衣桶内壁的连接关系），罐盖14-2的上表面设置有细胞输入孔14-4和培养液导出管14-5，罐体14-1的底部设置有培养液导入管14-6，人ipscs诱导类肝细胞通过细胞输入孔14-4输入罐体14-1内，细胞输入孔14-4上配设有密封盖，膜肺13通过连接管路连通培养液导入管14-6，第二压力监测仪15通过连接管路连通培养液导出管14-5，多层多孔平板装置14-3上下滑动连接在罐体14-1的内壁（类似压衣片和洗衣桶内壁的连接关系），第二压力监测仪15一端通过连接管路连接培养液导出管14-5，第二压力监测仪15另一端通过连通管路连接血浆上侧入口10-3，血浆上出口10-4连通第三压力监测仪16，第三压力监测仪16的出口与血细胞出口4-3一并接入第一压力监测仪5的入口，第一压力监测仪5的出口依次连接加热器6和血液输出管17并最终与人体连通。

实施例中，多层多孔平板装置14-3为至少一层的多孔平板，多孔平板包括平板14-31、凹槽14-32和底托14-33，凹槽14-32和底托14-33分别环设于平板14-31的上表面和下表面且位置正对，通过上多孔平板的底托14-33插嵌在下多孔平板的凹槽14-32中，上下相邻层多孔平板之间可拆卸连接，平板14-31的表面均布有竖直镂空孔14-34，竖直镂空孔14-34纵向贯穿平板14-31，底托14-33为空心圆柱体，底托14-33的侧壁设有水平镂空孔14-35。

进一步地，多层多孔平板装置14-3由50～60层多孔平板组成，多孔平板的平板14-31采用直径120mm、厚1mm的聚碳酸酯圆形平板，聚碳酸酯圆形平板的外表面包被一层生长因子胶原14-36。

进一步地，凹槽14-32和底托14-33在平板14-31的上表面和下表面上下对应地分别环设内外2圈，每圈设6个或8个或11个凹槽14-32和底托14-33在平板14-31中心的外周均匀分布，凹槽14-32为直径11mm、深0.8mm的圆柱形凹槽，底托14-33为直径11mm、高2mm的圆环形底托，竖直镂空孔14-34和水平镂空孔14-35均为直径2mm的圆孔。

使用本发明的基于人ipscs诱导类肝细胞及多层多孔生物反应器的生物人工肝时，首先通过多层多孔生物反应器14的细胞输入孔14-4将人ipscs诱导类肝细胞通过无菌操作缓慢输注罐体14-1内，然后打开37℃专用培养箱9培养4小时，待细胞稳定粘附，病人使用时，将患者血液引出体外后，通过血液输入管1进入生物人工肝系统，血浆分离柱4将血液中的血细胞与血浆分离，分离后的血浆经过血浆置换蠕动泵11进入37℃专用培养箱9内与半透膜交换柱10连通，进入半透膜交换柱10的血浆通过血浆置换蠕动泵11与红细胞池12、膜肺13相连接并由培养液导入管14-6进入多层多孔生物反应器14，多层多孔平板装置14-3优选50～60层多孔平板组成，且层数可调，每层液体可以通过底托14-33侧壁的水平镂空孔14-35呈放射状流入平板14-31周围，液体充分交换，平板14-31采用与人ipscs诱导的类肝细生物相容性较好的聚碳酸酯圆形平板，且外表面包被一层生长因子胶原14-36，有利于细胞聚集成团黏附，3d培养充分发挥功能，从而可进行血浆中有毒物质与多层多孔生物反应器14中有效成分物质交换，多层多孔生物反应器14的培养液导出管14-5与第二压力监测仪15连接将循环液体通过血浆上侧入口10-3连接至半透膜交换柱10，半透膜交换柱10的血浆上出口10-4与第三压力监测仪16连接后出入37℃专用培养箱9，与血浆分离柱4的血细胞出口4-3输出的血细胞汇合后连接第一压力监测仪5、加热器6后经过血液输出管17与人体相连通。

本发明的基于人ipscs诱导类肝细胞及多层多孔生物反应器的生物人工肝采用人源性细胞，避免异种病毒感染，显著提高生物相容性，促进细胞3d培养，充分发挥类似在体培养功能（培养后白蛋白分泌保持在70μg/116个细胞/天，氨清除率保持在25μmol/116个细胞/天，尿素合成率为10μg/116个细胞/天，葡萄糖代谢率为120μmol/116细胞/天）；将流动液体辐射式均匀与细胞接触，降低流速对细胞的损伤，提高液体交换效率，充分进行物质交换；容积大并且承载细胞量多，满足临床需求（承载细胞量达到1111）；通过半透膜交换柱10的半透膜进行物质交换，有效降低免疫反应（半透膜孔径为11nm，未检测出hbv、hiv等病毒，igg，igm免疫抗体水平未出现明显的升高或下降，显示了良好的病毒和免疫安全性）；37℃专用培养箱9、红细胞池12和膜肺13保证血液、细胞所需的温度和氧供，提供生物人工肝效能。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。