一种促进三疣梭子蟹雌蟹卵黄积累与卵巢发育的方法与流程

本发明属于蟹类雌蟹卵巢发育技术领域，具体涉及一种促进三疣梭子蟹雌蟹卵黄积累与卵巢发育的方法。

背景介绍

繁育工作是所有动物养殖业中极为关键的一环，获得高质量的种苗是养殖生产的前提。其中，卵细胞的发育状况直接关系到受精卵的营养状况，进而影响子代孵化等生产关键环节，而卵黄蛋白原(vitellogenin,vg)在卵细胞发育过程所需的营养供给中起关键作用。卵黄蛋白原(vg)是一种普遍存在于卵生非哺乳动物血液中的雌性特异性蛋白，是几乎所有卵生动物中卵黄蛋白(vn)的前体(utarabhandandbunlipatanon,1996),而卵黄蛋白(vn)是卵生动物卵黄的主要成分,在十足类中主要是作为载体蛋白进入卵母细胞为胚胎和早期幼体提供必须的营养物(singhetal.,2013).

三疣梭子蟹(portunustrituberculatus)是一种重要的海洋经济动物,隶属甲壳纲(crustacea)、十足目(decapoda)、梭子蟹科(portunidae),分布于日本、韩国和中国海域(hamasakietal.,2006)，是中国重要的海水养殖蟹类。据近几年的《中国渔业统计年鉴》统计，2016年至2018年全国梭子蟹养殖产量分别是123154吨、119777吨、116256吨，可见，近年来三疣梭子蟹养殖产量逐年下降，同时由于池塘养殖亲本通常存在卵巢发育不良和生殖性能差等缺点。因此,促进三疣梭子蟹的卵巢发育的研究显得十分重要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能促进三疣梭子蟹雌蟹卵黄积累与卵巢发育的方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种茴香霉素(anisomycin)的新的用途，是用来促进三疣梭子蟹雌蟹卵黄积累与卵巢发育；

本发明还提供一种促进三疣梭子蟹雌蟹卵黄积累与卵巢发育的方法，是使用茴香霉素来促进三疣梭子蟹雌蟹卵黄积累与卵巢发育；

所述的茴香霉素，是溶解于添加有羧甲基纤维素钠的氯化钠溶液中的；

作为实施例的一种记载，其中茴香霉素在氯化钠溶液中的浓度为1-2μg/μl；羧甲基纤维素钠在溶液中的浓度为1％；氯化钠溶液的浓度为0.9％。

本发明的方法在使用茴香霉素后，三疣梭子蟹卵巢中c-junn-末端激酶(jnk)活性增强，jnk和vg基因表达显著上调，促进卵母细胞发育加速，同时卵巢中卵黄蛋白的积累得到显著增加，缩短了三疣梭子蟹卵巢发育到成熟期的时间。加速了卵母细胞内的卵黄蛋白大量积累，促进三疣梭子蟹雌蟹的卵巢发育。

附图说明

图1：实时荧光定量pcr检测到的jnk和vg基因转录水平的组织分布。每个条形代表平均值±s.e(n＝3)，注射组，空白组和对照组之间的显著差异用不同的字母表示(p<0.05)。

图2：卵巢中的c-junn-末端激酶(jnk)活性和vn含量。a是卵巢中c-junn-末端激酶(jnk)活性；b是卵巢中的卵黄蛋白(vn)的含量。每个条形代表平均值±s.e.(n＝3)。注射组，空白组和对照组之间的显著差异用不同的字母表示(p<0.05)。

图3：三疣梭子蟹雌蟹卵巢组织学切片的显微图像。a:空白组，b:对照组，c:2mg/kg激活组，d:4mg/kg激活组(100x)。ex:外源性卵黄合成期卵母细胞；fc:滤泡细胞；y:卵黄颗粒；n:细胞核；no:近成熟期卵母细胞。

具体实施方式

茴香霉素是一种有效的蛋白质合成抑制剂，它通过抑制肽基转移酶或80s核糖体系统干扰蛋白质和dna合成。茴香霉素是一种jnk激活剂，可增强磷酸化jnk。

本发明以三疣梭子蟹雌蟹为对象，将三疣梭子蟹雌蟹分为4个组，即空白组(不注射)，对照组(注射1％cmc-na)，激活剂组:按照2mg/kg的标准(其中mg指药品量，kg指三疣梭子蟹雌蟹的重量)注射茴香霉素，另外一个激活组是按照4mg/kg的标准注射茴香霉素，用微量注射器由三疣梭子蟹游泳足基膜处进行注射，每周注射一次，共注射4次,养殖一个月后，取其肝胰腺和卵巢组织，检测其jnk及vg组织表达，c-jun氨基末端激酶(jnk)活性，卵黄蛋白含量和组织切片分析细胞的发育情况，发现茴香霉素能明显加速了三疣梭子蟹雌蟹的卵黄积累，促进卵巢发育。

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1

茴香霉素(anisomycin)购置于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，药品配制均以1％羧甲基纤维素钠(1％cmc-na)为助溶剂，激活剂茴香霉素的注射剂量为2mg/kg或者4mg/kg，每次注射前现用现配，药品粉剂保存于-20℃～-80℃。

首先，将羧甲基纤维素钠溶于0.9％的氯化钠溶液中，配成终浓度为1％，然后将药品粉剂(激活剂)适量加入1％cmc-na溶液中，放入水浴锅或借助超声波仪有助于药品溶解，直至药品完全融化。

以三疣梭子蟹雌蟹(体重为200±20g)为对象，将附肢健全、活力好、无机械损伤的三疣梭子蟹雌蟹分为4个组，即空白组(不注射)，对照组(注射1％cmc-na)，激活剂组:按照2mg/kg的标准(其中mg指药品量，kg指三疣梭子蟹的重量)注射茴香霉素，另外一个激活组是按照4mg/kg的标准注射茴香霉素，用微量注射器由三疣梭子蟹游泳足基膜处进行注射，每周注射一次，共注射4次,养殖完成后将4个组的三疣梭子蟹擦干水分并称重，在低温麻醉下进行活体解剖，取完整的卵巢和肝胰腺组织称重后用于测定卵巢系数gsi＝wg/w×100％,wg为卵巢重(g),w为体重(g)。将卵巢和肝胰腺组织放入冻存管后将其放入液氮罐中保存，用于后续实验。另外，将适量的卵巢组织固定于4％多聚甲醛溶液中，用于制作组织切片以便后续分析。

具体的实验结果如下：

(1)jnk及vg的表达分析

注射激活剂后，检测了jnk及vg基因在肝胰腺和卵巢中转录水平的表达。与空白组和对照组相比，jnk及卵黄蛋白原(vg)基因在肝胰腺及卵巢中均有相同的趋势，两个剂量的激活组均呈上调表达(p<0.05)。其中，2mg/kg激活组的jnk基因在肝胰腺和卵巢中的表达量分别增加了90％、1.1倍。4mg/kg激活组的jnk基因在肝胰腺和卵巢中的表达量分别增加了1.1倍、98％(图1中1a&b)。而2mg/kg激活组的vg基因在肝胰腺和卵巢中的表达量分别增加了4.9、1.2倍。4mg/kg激活组的vg基因在肝胰腺和卵巢中的表达量分别增加了4.6、1.2倍(图1中c&d)。

(2)c-junn-末端激酶(jnk)活性及vn含量的检测

酶联免疫分析(elisa)检测梭子蟹c-junn-末端激酶(jnk)活性及vn含量。结果显示：与空白组和对照组相比2mg/kg激活组和4mg/kg激活组的jnk酶活性分别增加了13％、11％(图2a)。2mg/kg激活组的vn含量增加了52％，4mg/kg激活组的vn含量增加了59％(图2b)。这说明茴香霉素促进了vn含量的积累。

(3)观察组织切片

观察组织切片发现，空白组和对照组主要为外源性卵黄合成期的卵母细胞和近成熟的卵母细胞，卵母细胞的直径分别为234-287μm和246-284μm，卵母细胞内可见大量的卵黄颗粒，两组无明显差异。激活组的卵母细胞间相互挤压呈多边形状，滤泡细胞紧在卵母细胞周围，变为细线状，卵母细胞内可见大量的卵黄颗粒，几乎充满整个卵母细胞。2mg/kg激活组和4mg/kg激活组的卵母细胞的直径分别主要集中在285-366μm和285-384μm之间(表1和表2)。特别的是4mg/kg激活组中切片的卵黄颗粒开始融合(图3d)，细胞发育更快。

表1：四个实验组卵母细胞直径分布表

a:空白组，b:对照组，c:2mg/kg激活组，d:4mg/kg激活组

表2：三疣梭子蟹卵母细胞的组织学特征表

上述结果表明茴香霉素可以有效的加速三疣梭子蟹雌蟹卵黄蛋白含量积累，促进三疣梭子蟹雌蟹的卵巢发育，具有应用的前景。