一种新型药载纳米水凝胶及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物纳米材料技术领域，具体涉及一种新型药载纳米水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

纳米水凝胶作为药物载体具有很广阔的应用前景，纳米技术的不断发展催动了纳米凝胶向多功能化发展。纳米凝胶在装载治疗剂的同时也可以装载一些功能化纳米粒子，这大大提升了纳米凝胶的应用价值。

大多数纳米凝胶作为药物载体由于其高度水合的亲水性微观结构而仅加载单一的水溶性治疗剂。由聚合物胶束和纳米凝胶组成的纳米复合材料，具有疏水性内核的聚合物胶束而具有包封水不溶性试剂的明显优势，而亲水性纳米凝胶生物材料可以容易地加载水溶性试剂，可用于共同递送疏水性和亲水性试剂，是一种非常有前景的共递送载药系统。此外，混合系统可以更容易地设计出具有热敏性、ph敏感性和氧化还原敏感性等多重响应特性的纳米水凝胶。由前药形成的分子纳米凝胶也被尝试应用于共同递送多种药物，前药参与纳米凝胶的分子组装过程，在形成纳米凝胶后进一步负载其他药物。

dna水凝胶是近年来发展起来的一种先进纳米材料，显着扩展了水凝胶的应用领域，具有广泛的生物技术和生物医学用途，包括生物传感器，rna干扰和药物运载等。根据dna纳米凝胶的构建方式可以分为两类：纯dna纳米凝胶和dna接枝聚合物纳米凝胶。

量子点-氧化石墨烯作为一种新型纳米复合材料，因其综合了氧化石墨烯比表面积大、导电速度快以及量子点尺寸依赖的光学性能和高发光效率等优点，在太阳能电池、传感器、光电材料等领域具有广阔的应用前景。然而，现有的水热法、溶剂热法、电化学等合成方法，工艺苛刻、繁琐、不具备通用性。因此，开发具有通用性的、合成工艺简单的合成方法，合成高质量的量子点-氧化石墨烯复合材料，对推动该类复合材料的研究及应用具有重要的意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于一种新型药载纳米水凝胶及其制备方法和应用，构建了一种新型药载纳米水凝胶，在载药量、靶向性、稳定性、药物的可控释放性均有较高的水平。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种新型药载纳米水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)调节氯化镉和l半胱氨酸的混合溶液的ph值至11.0，依次加入硼氢化钠、亚碲酸钠和ssdna1后加热至95℃，再加入硒氢化钠溶液继续加热2h，得到dna-qds溶液，经无水乙醇洗涤、离心后加入pbs缓冲液溶解，提纯干燥后得cdtese量子点；所述ssdna1在5’端的碱基上修饰一个氨基，链结构中六个碱基的磷酸骨架中的p＝o键依次修饰为p＝s键；

(2)将羧甲基纤维素(cmc)溶液与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)混合后超声5min，静置15min后，得活化的cmc溶液；

(3)将span80和tween80混合后超声，得span+tween乳液；

(4)将活化的cmc溶液、阿霉素(dox)溶液、cdtese量子点的水溶液与ssdna2溶液混合后进行第一超声反应30min，得第一超声体系；向所述第一超声体系中加入ssdna3溶液进行第二超声反应30min，得第二超声体系；向所述第二超声体系中加入span+tween乳液进行第三超声反应5min，得第三超声体系；向所述第三超声体系中加入胱胺溶液，进行第四超声反应5min，交联8～12h后，得含有ssdna和量子点的载药纳米水凝胶nhy/cys-(dox,qds)；

所述ssdna2在5’端的碱基上修饰一个氨基，其余不做修饰；

所述ssdna3不做任何修饰。

优选的，步骤(1)中氯化镉中的镉元素、亚碲酸钠中的碲元素和硒氢化钠溶液中的硒元素的摩尔量之比为8:4:3；所述混合溶液中l半胱氨酸和镉元素的摩尔量之比为1.2：1。

优选的，步骤(2)中edc、nhs和cmc中羧基的摩尔量之比为3:3:1。

优选的，步骤(3)所述span80和tween80的质量比为1:2～2:1。

优选的，步骤(3)所述超声的体系中还包括固定油相正己烷。

优选的，步骤(1)中ssdna1溶液、步骤(4)中所述的ssdna2溶液和ssdna3溶液浓度均为10μmol/l。

优选的，所述ssdna1与ssdna3部分碱基互补；ssdna2与ssdna3部分碱基互补。

本发明还提供了利用所述制备方法制备得到的含有ssdna和量子点的载药纳米水凝胶nhy/cys-(dox,qds)。

本发明还提供了所述含有ssdna和量子点的载药纳米水凝胶nhy/cys-(dox,qds)在制备释放性可控的药物中的应用。

本发明还提供了所述含有ssdna和量子点的载药纳米水凝胶nhy/cys-(dox,qds)在提高材料生物相容性中的应用。

相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明基于核酸适配体和量子点构建得到的新型药载纳米水凝胶性质稳定，并且采用dna功能化的量子点为药物载体的示踪提供了新的方式；本发明率先采用了含有mirna配对杂交结构dna作为交联剂，组装dna功能化硒碲化镉量子点(dna-cdseteqds)，并交联以核仁素为靶向的as1411核酸适体修饰的羧甲基纤维素(cmc)构建靶向、载药水凝胶；采用的原料环境友好、反应条件温和，所制备的水凝胶载药量大，药物的释放性可控；在水相介质中合成，提高了材料的生物相容性。

附图说明

图1为本发明构建所述新型药载纳米水凝胶的流程图；

图2a为实施例1制得的cmc纳米水凝胶的宏观(主图)和单个cmc凝胶(左上角小图)形貌的透射电镜图；

图2b为实施例2所制得cmc纳米水凝胶的宏观(主图)和单个cmc凝胶(左上角小图)形貌的透射电镜图；

图2c为实施例3所制得cmc纳米水凝胶的宏观(主图)和单个cmc凝胶(左上角小图)形貌的透射电镜图；

图3a为实施例1制得的(nhy/cys-(dox,qds))(477nm激发)荧光光谱；

图3b为实施例2制得的(nhy/cys-(dox,qds))(477nm激发)荧光光谱；

图3c为实施例3制得的(nhy/cys-(dox,qds))(477nm激发)荧光光谱；

图4是生物实验中不同条件下小鼠肿瘤体积变化曲线；

图5是生物实验中不同条件下肿瘤体积抑制率图像；

图6是生物实验中不同条件下小鼠解剖后取出肿瘤尺寸对比。

具体实施方式

本发明提供了一种新型药载纳米水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)调节氯化镉和l半胱氨酸的混合溶液的ph值至11.0，依次加入硼氢化钠、亚碲酸钠和ssdna1后加热至95℃，再加入硒氢化钠溶液继续加热2h，得到dna-qds溶液，经无水乙醇洗涤、离心后加入pbs缓冲液溶解，提纯干燥后得cdtese量子点；所述ssdna1在5’端的碱基上修饰一个氨基，链结构中六个碱基的磷酸骨架中的p＝o键依次修饰为p＝s键；

(2)将cmc溶液与nhs和edc混合后超声5min，静置15min后，得活化的cmc溶液；

(3)将span80和tween80混合后超声，得span+tween乳液；

(4)将活化的cmc溶液、dox溶液、cdtese量子点的水溶液与ssdna2溶液混合后进行第一超声反应30min，得第一超声体系；向所述第一超声体系中加入ssdna3溶液进行第二超声反应30min，得第二超声体系；向所述第二超声体系中加入span+tween乳液进行第三超声反应5min，得第三超声体系；向所述第三超声体系中加入胱胺溶液，进行第四超声反应5min，交联8～12h后，得含有ssdna和量子点的载药纳米水凝胶nhy/cys-(dox,qds)；

所述ssdna2在5’端的碱基上修饰一个氨基，其余不做修饰；

所述ssdna3不做任何修饰。

本发明调节氯化镉和l半胱氨酸的混合溶液的ph值至11.0，依次加入硼氢化钠(20mg，过量，防止量子点制备过程中被氧化)、亚碲酸钠和ssdna1后加热至95℃，再加入硒氢化钠溶液继续加热2h，得到dna-qds溶液，经无水乙醇洗涤、离心后加入pbs缓冲液溶解，提纯干燥后得cdtese量子点；所述ssdna1在5’端的碱基上修饰一个氨基，链结构中六个碱基的磷酸骨架中的p＝o键依次修饰为p＝s键。

本发明在制备所述混合溶液时，优选将氯化镉、l半胱氨酸溶于纯净水中，充分搅拌，加入氢氧化钠溶液调节混合溶液的ph值至11.0。本发明所述混合溶液中的l-cys与镉元素的摩尔量之比优选为1.2：1。本发明所述混合溶液中氯化镉的浓度优选为0.8mm，l-半胱氨酸的浓度优选为0.96mm。本发明向所述混合溶液中依次加入硼氢化钠(nabh4)和亚碲酸钠(na2teo3)并搅拌均匀，取出适量溶液于离心管中，加入巯基修饰的ssdna1，在金属浴中加热到95℃，再加入硒氢化钠(nahse)溶液继续加热2h后得到dna-qds溶液，经无水乙醇洗涤、离心后加入pbs缓冲液溶解，提纯干燥后得cdtese量子点。本发明所述混合溶液中的镉元素、亚碲酸钠中碲元素和硒氢化钠溶液中的硒元素的摩尔量之比优选为8:4:3。本发明优选利用1mol/l的naoh溶液调节所述混合溶液的ph至11.0。在本发明中优选加入过量的硼氢化钠，如在实施例中加入20mg硼氢化钠，防止量子点制备过程中被氧化。

本发明将cmc溶液与nhs和edc混合后超声5min，静置15min后，得活化的cmc溶液。本发明所述cmc溶液中cmc的质量百分含量优选为1％。本发明在所述混合时，优选将向所述cmc溶液中，依次加入称量好的nhs和edc，使edc、nhs和cmc中羧基的摩尔量之比优选为3:3:1。在本发明中，由于edc极易吸潮，因此必须快速称量和加入到上述cmc溶液中。本发明所述超声温度为20℃，频率为2000hz，功率为0.5w/cm²下同。

本发明将span80和tween80混合后超声，得span+tween乳液。本发明所述span80和tween80的质量比为1:2～2:1。本发明所述超声的体系中还包括固定油相正己烷。本发明所述超声的参数优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明将活化的cmc溶液、dox溶液、cdtese量子点的水溶液与ssdna2溶液混合后进行第一超声反应30min，得第一超声体系；向所述第一超声体系中加入ssdna3溶液进行第二超声反应30min，得第二超声体系；向所述第二超声体系中加入span+tween乳液进行第三超声反应5min，得第三超声体系；向所述第三超声体系中加入胱胺溶液，进行第四超声反应5min，交联8～12h后，得含有ssdna和量子点的载药纳米水凝胶nhy/cys-(dox,qds)。本发明所述的ssdna2溶液和ssdna3溶液浓度优选相同，均为10μmol/l；且所述ssdna1与ssdna3部分碱基互补；ssdna2与ssdna3部分碱基互补。本发明所述cmc溶液中cmc的质量百分含量优选为1％。本发明所述dox溶液的浓度优选为2mg/ml。本发明所述cdtese量子点的水溶液的浓度优选为40mm。本发明所述四次超声反应参数均为20℃，2000hz，功率为0.5w/cm²。

在本发明实施例中，所述ssdna1巯基修饰碱基用*标注；ssdna1与ssdna3部分碱基互补(注解中直线部分)；ssdna2与ssdna3部分碱基互补注解中浪线部分)；ssdna2能与肿瘤细胞中含有的mirna完全互补配对。本发明实施例中所采用的dna具体序列优选为：

ssdna1:5’nh2-seqidno.1-3’，seqidno.1序列为

ssdna2:5’nh2-seqidno.2-3’，seqidno.2序列为

ssdna3:5’-seqidno.3-3’，seqidno.3序列为

本发明还提供了利用所述制备方法制备得到的含有ssdna和量子点的载药纳米水凝胶nhy/cys-(dox,qds)。

本发明还提供了所述含有ssdna和量子点的载药纳米水凝胶nhy/cys-(dox,qds)在制备释放性可控的药物中的应用。本发明所述水凝胶载药量大，药物的释放性可控。

本发明还提供了所述含有ssdna和量子点的载药纳米水凝胶nhy/cys-(dox,qds)在提高材料生物相容性中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的新型药载纳米水凝胶及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

按照如图1所示流程制备新型药载纳米水凝胶：

s1、设计单链dna：

ssdna1在5’端的碱基上修饰一个氨基(-nh2)，链结构中六个碱基的磷酸骨架中的p＝o键依次修饰为p＝s键；

ssdna2在5’端的碱基上修饰一个氨基(-nh2)，其余不做修饰；

ssdna3不做任何修饰，分别为：

ssdna1:5’nh2-seqidno.1-3’，seqidno.1序列为ggtggtggtggttgtg*g*t*g*g*t*ggtggtagcttatc；

ssdna2:5’nh2-seqidno.2-3’，seqidno.2序列为

ssdna3:5’-seqidno.3-3’，seqidno.3序列为

s2、制备dna功能化cdtese量子点：

称取0.024mmol的无水氯化镉，0.0288mmol的l-cys，并将其依次加入到50ml的三口烧瓶中，倒入30ml超纯水。持续搅拌并通入氮气除氧30min后，加入适量的1mol/l的naoh溶液调节ph至11.0。然后在剧烈搅拌的条件下向上述溶液中依次加入称量好的适量硼氢化钠(nabh4)(20mg)和0.012mmol的亚碲酸钠(na2teo3)。待搅拌均匀后，用移液枪移取1000μl上述混合溶液至2ml离心管(盖上扎有小孔)中，然后取10μl浓度为10μmol/l的ssdna1(部分磷酸骨架上修饰有巯基)溶液加入到上述离心管中，摇晃使其混合均匀并将离心管置于金属恒温加热器中加热至95℃。nahse的制备：称取0.05mmol的se粉和过量的nabh4(15mg)于2ml离心管中，然后向其中加入1ml超纯水，超声反应15min得到无色透明的nahse溶液。待上述离心管中含有cd²⁺和te^2-的溶液反应30min后，用移液枪取6μlnahse溶液加入其中，进一步反应得到cdtese量子点。加热至90℃，恒温反应2h后得到dna-qds溶液，经无水乙醇洗涤、离心后加入pbs缓冲液溶解。

s3、制备活化的cmc溶液+dox溶液

cmc的活化：取200μl的1％的cmc溶液于2ml离心管中，然后依次加入称量好的5.33mgnhs和3.2mgedc。将上述溶液超声混合5min后，静置反应15min完成活化，其中edc:nhs:cmc中羧基的摩尔量＝3:3:1。

cmc溶液与dox溶液的混合：在活化的cmc溶液中加入10μl浓度为2mg/ml的dox溶液，超声2min使其分散均匀。

s4、span+tween乳液的制备

选择正己烷为油相，乳化剂为span80和tween80，因为它们均被国家允许用作食品添加剂，span80和tween80的质量比为4:6，质量分别为0.4175g和0.6262g，油相正己烷体积为3ml。分别称取span80和tween80加到5ml的离心管中，然后取3ml的正己烷加入其中，超声2min使其均匀分散。

s5、基于核酸适配体和量子点构建了一种新型药载纳米水凝胶的制备

取s3中制备的cmc+dox混合溶液，然后取一管提纯干燥后的cdtese量子点溶于50μl超纯水中配成溶液加到上述离心管中，再取10μl浓度为10μmol/l的ssdna2溶液加入其中，超声反应30min。再取10μl浓度为10μmol/l的ssdna3溶液加入其中，继续反应30min。再向该离心管中加入s4制备的span+tween乳液，超声5min后加入20μl的胱胺溶液，继续超声5min，隔夜交联反应制得含有ssdna和量子点的载药纳米水凝胶(nhy/cys-(dox,qds))。其宏观(主图)和单个凝胶(左上角小图)形貌的透射电镜图如图2a所示；制备得到的nhy/cys-(dox,qds)在477nm荧光激发下的荧光光谱如图3a所示。

实施例2

s1、s2、s3步骤同实施例1

s4、span+tween乳液的制备

span80和tween80的质量比为5:5，质量均0.522g，油相正己烷体积为3ml。分别称取span80和tween80加到5ml的离心管中，然后取3ml的正己烷加入其中，超声2min使其均匀分散。

s5、同实施例1。其宏观(主图)和单个凝胶(左上角小图)形貌的透射电镜图如图2b所示；制备得到的nhy/cys-(dox,qds)在477nm荧光激发下的荧光光谱如图3b所示

实施例3

s1、s2、s3步骤同实施例1

s4、span+tween乳液的制备

span80和tween80的质量比为6:4，质量分别为06262g和0.4171g，油相正己烷体积为3ml。分别称取span80和tween80加到5ml的离心管中，然后取3ml的正己烷加入其中，超声2min使其均匀分散。

s5、同实施例1。其宏观(主图)和单个凝胶(左上角小图)形貌的透射电镜图如图2c所示；制备得到的nhy/cys-(dox,qds)在477nm荧光激发下的荧光光谱如图3c所示。

由上述三个实施例实验结果对比可知，当span80和tween80的质量比为5:5时，所制备的nhy/cys-(dox,qds)凝胶具有更好的形貌和结构，因此，以实施例2所制得载药凝胶进一步进行细胞实验：通过对植入hale肿瘤细胞的裸鼠，分别注入200微升pbs(空白对照组)、nhy/cys-(qds)(未加入药物dox)、dox和nhy/cys-(dox,qds)，频率为两天一次，通过对相同时间内肿瘤体积的变化的记录，算出各个对照组对肿瘤的抑制率，并在持续注射两周后解剖小鼠取出肿瘤，比较体积。结果如图4～6所示，药物载体本身(nhy/cys-(qds))没有毒性；载有dox的nhy/cys-(dox,qds)能够有效的抑制小鼠肿瘤，并且对小鼠健康没有影响。相比之下，只加入阿霉素对小鼠健康影响很大，这说明，本发明所制得的药物载体具有较好的生物相容性及可控释放性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>燕山大学

<120>一种新型药载纳米水凝胶及其制备方法和应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggtggtggtggttgtgshgshtshgshgshtshggtggtagcttatc47

<210>2

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tttggtggtggtggttgtggtggtggtggtttagactgat40

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tcaacatcagtctgataagcta22