Notch信号通路抑制组合物及抗前列腺癌骨转移应用的制作方法

本发明属于医药领域，更具体地涉及穿心莲内酯和薯蓣皂苷协同在notch信号通路抑制和抗前列腺癌骨转移的应用。
背景技术：
：前列腺癌(pca)是全球男性最常见的恶性肿瘤之一，其特点是骨转移发生率高。在全球范围内，欧美国家前列腺癌的发病率最高，但我国近年来随着人均寿命的延长及饮食结构的改变，前列腺癌的病发率也呈上升趋势。前列腺癌早期无明显临床症状，多于体检或者出现下尿路梗阻、骨痛等而被发现，导致确诊患者多伴有远处转移。前列腺癌患者的死亡往往不是原发疾病，而是由于肿瘤的远处转移，特别是骨转移。目前临床上治疗前列腺癌一般选择雄激素去除治疗为主的姑息治疗，但其对前列腺癌骨转移未能起到很好疗效，骨转移的患者预后差，平均生存时间仅为5～17.5个月。因此，寻找治疗前列腺癌骨转移的治疗方案尤为重要。以往研究表明，notch信号通路对细胞的增殖、凋亡、分化、黏附具有调控作用，但在不同细胞或组织，notch信号通路发挥的调控作用有所不同。寻找notch信号通路抑制剂，可选择性治疗被异常激活notch信号通路的疾病。技术实现要素：本发明在于提供穿心莲内酯和薯蓣皂苷协同在抗前列腺癌骨转移和抑制notch信号通路的应用。在一些实施方案中，本发明可以包括下述一项或多项：1.notch信号通路抑制组合物，包括穿心莲内酯和薯蓣皂苷。2.根据项1所述的组合物，其特征在于，所述notch信号通路抑制组合物具有抑制notch-1、nicd、hes-1中任一物质的表达的功能。3.根据项1所述的组合物，其特征在于，所述notch信号通路抑制组合物具有抑制前列腺癌骨转移细胞中notch-1、nicd、hes-1中任一物质的表达的功能。4.根据项1所述的组合物，其特征在于，所述notch信号通路抑制组合物中，穿心莲内酯和薯蓣皂苷的摩尔浓度比为(1.5-12):1。5.根据项1所述的组合物，其特征在于，所述薯蓣皂苷包括其衍生物形式；和/或，所述穿心莲内酯包括其衍生物形式。6.一种抗前列腺癌骨转移药物组合物，包括穿心莲内酯和薯蓣皂苷。7.根据项6所述的药物组合物，其特征在于，所述抗前列腺癌骨转移药物组合物具有以下至少任意一种功能：(1)抑制前列腺癌骨转移细胞的增殖；(2)抑制前列腺癌骨转移细胞的迁移；(3)抑制前列腺癌骨转移细胞的侵袭；(4)抑制前列腺癌骨转移细胞的粘附。8.根据项6所述的药物组合物，其特征在于，所述抗前列腺癌骨转移药物组合物中，穿心莲内酯和薯蓣皂苷的摩尔浓度比为(1.5-12):1。9.根据项6所述的药物组合物，其特征在于，所述抗前列腺癌骨转移药物组合物具有抑制notch信号通路的功能。10.根据项6所述的药物组合物，其特征在于，所述薯蓣皂苷包括其药学上可接受的盐或酯；和/或，所述穿心莲内酯包括其药学上可接受的盐或酯。薯蓣皂苷(cas:19057-60-4，dioscin，本发明简称dio)是一种薯蓣科植物中的主要成分，具有杀昆虫和抗须癣毛菌等真菌的作用。但未见薯蓣皂苷有抗前列腺癌骨转移及抑制notch信号通路的相关报道。穿心莲内酯(cas:5508-58-7，andrographolide，本发明简称andro)是天然植物穿心莲的主要有效成分，具有祛热解毒，消炎止痛之功效，对细菌性与病毒性上呼吸道感染及痢疾有特殊疗效，被誉为天然抗生素药物。但未见心莲内酯有抗前列腺癌骨转移及抑制notch信号通路的相关报道。在notch信号通路中，notch1作为通路的核心蛋白，当notch信号通路被激活后，notch1会被γ分泌酶切割，并产生nicd进入细胞核以启动下游基因表达，而hes-1是notch信号通路下游重要的靶基因。目前notch信号通路抑制有fli-06，ro4929097、semagacestat(ly450139)，可用于预防或治疗notch信号通路异常激活的疾病。令人意外地是，本申请发现穿心莲内酯和薯蓣皂苷都能够同时抑制notch信号通路关键蛋白和下游基因(包括notch-1、nicd、hes-1)的表达，并且协同抑制前列腺癌骨转移细胞的增殖、迁移、侵袭、粘附，实现抗前列腺癌骨转移作用。在一些实施方案中，穿心莲内酯和薯蓣皂苷能协同抑制notch信号通路。在一些实施方案中，穿心莲内酯和薯蓣皂苷能同时抑制notch信号通路关键蛋白和下游基因(包括notch-1、nicd、hes-1)的表达。在一些实施方案中，在前列腺癌骨转移细胞中(如pc-3)，穿心莲内酯和薯蓣皂苷能同时抑制notch信号通路关键蛋白和下游基因(包括notch-1、nicd、hes-1)的表达。在一些实施方案中，穿心莲内酯和薯蓣皂苷的摩尔浓度比为(1.5-12):1，两者联合应用比穿心莲内酯或薯蓣皂苷任何一种药物的单用，在抑制notch信号通路活性中表现出更优异的效果。在一些实施方案中，穿心莲内酯和薯蓣皂苷的摩尔浓度比为(1.5-12):1，优选为(3-12)：1，进一步优选为(3-6)：1，具体浓度比例如为1.5:1，2:1，3:1，4:1，5:1，6:1，8:1，10:1，12:1。在一些实施方案中，所述薯蓣皂苷包括其衍生物形式。在一些实施方案中，薯蓣皂苷衍生物形式包括薯蓣皂苷药学上可接受的盐、薯蓣皂苷药学上可接受的酯、薯蓣皂苷结构类似物、薯蓣皂苷的修饰物。在一些实施方案中，所述穿心莲内酯包括其衍生物形式。在一些实施方案中，穿心莲内酯衍生物形式包括穿心莲内酯药学上可接受的盐、穿心莲内酯药学上可接受的酯、穿心莲内酯结构类似物、穿心莲内酯的修饰物。在一些实施方案中，薯蓣皂苷的修饰物是指对薯蓣皂苷进行修饰后的产物，该产物并未改变其作为notch信号通路抑制剂的实质。在一些实施方案中，穿心莲内酯的修饰物是指对穿心莲内酯进行修饰后的产物，该产物并未改变其作为notch信号通路抑制剂的实质。在一些实施方案中，穿心莲内酯和薯蓣皂苷能协同抗前列腺癌骨转移。在一些实施方案中，穿心莲内酯和薯蓣皂苷能协同实现以下功能：(1)抑制前列腺癌骨转移细胞的增殖；(2)抑制前列腺癌骨转移细胞的迁移；(3)抑制前列腺癌骨转移细胞的侵袭；(4)抑制前列腺癌骨转移细胞的粘附。在一些实施方案中，穿心莲内酯和薯蓣皂苷能协同抑制肿瘤转移相关蛋白mmp-2和mmp-9的分泌表达。在一些实施方案中，穿心莲内酯和薯蓣皂苷的摩尔浓度比为(1.5-12):1，两者联合应用比穿心莲内酯或薯蓣皂苷任何一种药物的单用，在抑制前列腺癌骨转移细胞的增殖、迁移、侵袭、粘附、肿瘤转移相关蛋白表达中表现出更优异的效果。在一些实施方案中，穿心莲内酯和薯蓣皂苷的摩尔浓度比为(1.5-12):1，优选为(3-12)：1，进一步优选为(3-6)：1，具体浓度比例如为1.5:1，2:1，3:1，4:1，5:1，6:1，8:1，10:1，12:1。在一些实施方案中，穿心莲内酯和薯蓣皂苷在前列腺癌骨转移细胞中能够抑制notch信号通路。在一些实施方案中，所述薯蓣皂苷包括其药学上可接受的盐或酯。在一些实施方案中，所述穿心莲内酯包括其药学上可接受的盐或酯。本发明的有益效果是：本发明意外发现穿心莲内酯与薯蓣皂苷联合使用能够发挥协同的作用，更高效地抑制notch信号通路，并且进一步高效地发挥抗前列腺癌骨转移作用，包括抑制前列腺癌骨转移细胞增殖、迁移、侵袭、粘附、转移相关蛋白的分泌表达。附图说明图1：不同浓度andro处理pc-3细胞后细胞增殖情况；图2：不同浓度dio处理pc-3细胞后细胞增殖情况；图3：15μmandro处理pc-3细胞后细胞迁移情况；图4：2.5μm、5μmdio处理pc-3细胞后细胞迁移情况；图5：15μmandro处理pc-3细胞后细胞侵袭情况；图6：2.5μm、5μmdio处理pc-3细胞后细胞侵袭情况；图7：15μmandro处理pc-3细胞后细胞粘附情况；图8：2.5μm、5μmdio处理pc-3细胞后细胞粘附情况；图9：15μmandro处理pc-3细胞后notch-1、hes-1、nicd表达情况，gapdh为内参；图10：2.5μm、5μmdio处理pc-3细胞后notch-1、hes-1、nicd表达情况，gapdh为内参；以上图示中，**表示与对照相比，有显著差异。具体实施方式结合本发明的一般性描述，通过下述实施例将更容易理解本发明，以下实施例的目的仅在于阐述本发明的某些方面的实施方式，不旨在于限制本发明。需要说明的是，实验例所用的实验方法或实验条件，如无特殊说明均按常规方法或厂家说明书进行，实验例所用材料、试剂，如无特殊说明均可从商业途径获得。细胞培养人前列腺癌骨转移pc-3细胞系购自atcc(美国典型培养物保藏中心，美国)，将细胞接种在75cm2培养瓶37℃5％co2中培养，使用的1640培养基补充有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100mg/ml链霉素，取对数生长期细胞进行试验。mts检测pc-3细胞增殖将pc-3细胞用0.25％胰蛋白酶消化后，以细胞浓度3×104个/ml均匀接种于96孔培养板，每孔100μl，细胞贴壁后加入不同浓度的药物，并设立dmso对照组和空白对照组(不含细胞)，每组设5个复孔，于48h后检测药物作用pc-3细胞的半抑制浓度(ic50)。接着用ic50的药物处理pc-3细胞，分别培养0、1、2、3d，通过每孔加入mts试剂10μl，37℃恒温箱孵育3h，多功能酶标仪检测各孔的吸光值a(490nm)，以观察随着时间的变化，药物对细胞增殖的影响。transwell检测细胞迁移pc-3细胞按不同分组处理48h后，以胰蛋白酶消化重悬，调整细胞数至1×106个/ml，将200μl细胞悬液接种于transwell小室的上室，并向下室加入600μl完全培养基，然后置入37℃培养箱中继续培养24h。取出transwell小室，仔细擦净小室膜上的pc-3细胞后，膜下pc-3细胞以0.1％结晶紫染色，在光镜下随机计数5个高倍视野的细胞数，然后计算平均值。transwell检测细胞侵袭实验前用50mg/lmatrigel1：8稀释液包被transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。后续的步骤同上述的transwell迁移实验。纤维连结蛋白检测细胞粘附用人纤维连结蛋白铺被于96孔板中2h后，bsa孵育30分钟封闭特异性结合位点。pc-3细胞按不同分组处理48h后，以胰蛋白酶消化重悬，调整细胞数至1×105个/ml，将200ul细胞悬液接种在96孔板中37℃培养箱中孵育30分钟，pbs洗掉未贴壁细胞，多聚甲醛固定30分钟，0.1％结晶紫染色，拍照，计数。elisa检测mmp-2、mmp-9的分泌表达不同浓度的药物处理前列腺癌骨转移pc-3细胞24h后，分别用人mmp-2及mmp-9elisa试剂盒进行测定。每孔中加入100μl相应的标准品或者细胞上清，酶标板密封于37℃反应90分钟，去除酶标板内液体(不洗)后每孔中加入100μl生物素标记的抗人mmp-2或者mmp-9抗体工作液，继续37℃反应60分钟。pbs洗涤3次后每孔加入100μlabc工作液于37℃反应30分钟。pbs洗涤5次后加入100μltmb显色液37℃避光反应20-25分钟。加入100μltmb终止液(此时蓝色可立即转为黄色)。酶标仪450nm测定吸光度并根据标准曲线计算相应浓度，分别除以对照组浓度，算出其相对水平。蛋白质免疫印迹实验(westernblot)将pc-3细胞用胰蛋白酶消化重悬后，用完全培养基制成2×105个/ml的细胞悬液，均匀接种于6孔培养板中，每孔2ml，24h细胞贴壁后，用不同浓度药物处理细胞。培养48h后，用预冷的pbs洗涤3次，然后用细胞刮将细胞刮下转移至15ml离心管中，4000r离心十分钟，弃上清，每管加入100μl的ripa裂解液和pmsf(100:1)的蛋白酶抑制剂，转移至1.mlep管中，于冰上裂解30min，接着4℃离心机12000r/min离心10min，吸取清液，用bca试剂盒检测各组总蛋白质含量并使用loadingbuffer染色，将总蛋白稀释统一浓度，95℃10min蛋白变性后分装保存于-20℃备用。配置10％的sds-page分离胶与浓缩胶，加入定量的样品至泳道(约50μg)。80v电泳至样品过分离胶后转120v电泳，接着300ma90min电转。5％bsa室温摇床封闭90min，然后用tbst(ph＝7.6)洗涤3次，10min/次，再分别加入notch-1抗体、nicd抗体、hes-1抗体及内参gapdh抗体，于4℃孵育过夜，次日摇床1h后tbst洗涤3次，10min/次，再分别加入对应的辣根过氧化物酶标记的二抗anti-mouseigg(1∶2000)、anti-rabbitigg(1：2000)，于室温孵育1h，再用tbst洗涤3次，10min/次，最后ecl法显色曝光。说明：实验结果中未明确解释的相对率或率是与未给药的对照组相比换算的比率，例如未给药组是1，本组测试结果是0.9，则相对率或率为90％。细胞增殖实验结果实验组1：不同浓度andro(2.5、5、10、20、40μm)结果如图1所示，随着andro浓度的升高，细胞增殖受到抑制的程度越来越显著，且呈剂量依赖性。通过spss统计软件分析，细胞增殖抑制率的ic50约为15μmol/l。实验组2：不同浓度dio(2.5、5、10、20、40μm)结果如图2所示，随着andro浓度的升高，细胞增殖受到抑制的程度越来越显著，且呈剂量依赖性。通过spss统计软件分析，细胞增殖抑制率的ic50约为5μmol/l。实验组3：不同浓度比andro和dio混用根据ic50配置andro和dio混合物，同时测试单用其中一种药物的组，并计算相对单用等量药物的变化幅度，变化幅度计算方式：混合物用药相对细胞增殖率-单独用药相对细胞增殖率。配置方案及测试结果如下表所示，可见联合使用andro和dio能够协同高效抑制细胞增殖。联用药物单用组1联用组1联用组2联用组3联用组4摩尔浓度比andro：dio12：16:13:11.5:1andro浓度/μm1515151515dio浓度/μm01.252.5510相对细胞增殖率61.74％50.45％28.52％22.73％20.99％相对单独用dio增殖率变化-48.12％-53.80％-42.25％-17.68％细胞迁移和侵袭能力实验结果根据药物的ic50浓度测试药物对pc-3细胞迁移和侵袭能力影响，结果如图3和图4所示，andro(15μm)或dio(2.5μm、5μm)处理细胞后，pc-3细胞迁移能力受到抑制。结果如图5和图6所示，andro(15μm)或dio(2.5μm、5μm)处理细胞后，pc-3细胞侵袭能力受到抑制。根据上述实验结果设计联合给药测试，配置andro和dio混合物，同时测试单用其中一种药物的组，并计算相对单用等量药物的变化幅度，变化幅度计算方式：混合物用药迁移细胞率-单独用药迁移细胞率，或，混合物用药侵袭细胞率-单独用药侵袭细胞率。配置方案及测试结果如下表所示，可见联合给药andro和dio能够协同高效抑制细胞迁移和侵袭。联用药物单用组1联用组2联用组3摩尔浓度比andro：dio6:13:1andro浓度/μm151515dio浓度/μm02.55迁移细胞率32.88％18.63％12.49％相对单独用dio迁移细胞率变化-44.70％-26.72％侵袭细胞率48.65％25.44％22.71％相对单独用dio侵袭细胞率变化-43.54％-23.83％细胞粘附实验结果根据药物的ic50浓度测试药物对pc-3细胞粘附能力影响，结果如图7和图8所示，andro(15μm)或dio(2.5μm、5μm)处理细胞后，pc-3细胞间的黏附能力明显下降。根据上述实验结果设计联合给药测试，配置andro和dio混合物，同时测试单用其中一种药物的组，并计算相对单用等量药物的变化幅度，变化幅度计算方式：混合物用药粘附细胞率-单独用药粘附细胞率。配置方案及测试结果如下表所示，可见联合给药andro和dio能够协同高效抑制细胞粘附能力。联用药物单用组1联用组2联用组3摩尔浓度比andro：dio6:13:1andro浓度/μm151515dio浓度/μm02.55粘附细胞率49.84％29.41％30.52％相对单独用dio粘附细胞率变化-21.63％-13.33％notch-1、nicd、hes-1的表达结果经过分析意外发现，andro和dio都能抑制notch信号通路活性，具体而言发现andro(15μm)或dio(2.5μm、5μm)处理细胞，能抑制notch信号通路关键蛋白和下游基因(包括notch-1、nicd、hes-1)的表达，结果如图9和图10所示。进一步测试联合给药的作用，结果如下表所示，可见，联合使用andro和dio抑制notch信号通路活性效果更优。药物单用组1单用组2单用组3联用组2联用组3摩尔浓度比andro：dio6:13:1andro浓度/μm15001515dio浓度/μm02.552.55notch-1相对表达率84.85％52.35％34.67％25.64％20.53％hes-1相对表达率75.36％90.53％80.55％60.44％53.52％nicd相对表达率40.24％74.24％56.27％23.65％19.69％肿瘤转移相关蛋白mmp2和mmp9的分泌表达测试结果根据前述实验结果，同时检测单独给药和联合给药对pc-3细胞中肿瘤转移相关蛋白mmp2和mmp9的分泌表达水平，结果以相对分泌率展示，如下表所示，可见，无论是单独使用andro或dio，以及联合使用andro和dio都能抑制肿瘤转移相关蛋白mmp-2和mmp-9表达，并且联合用药的抑制效率更好。药物单用组1单用组2单用组3联用组2联用组3摩尔浓度比andro：dio6:13:1andro浓度/μm15001515dio浓度/μm02.552.55mmp-2相对分泌率43.62％65.37％60.03％22.56％24.34％mmp-9相对分泌率37.99％72.55％61.34％19.86％20.85％以上所述仅为本发明的示例性说明，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替代，都应涵盖在本发明保护范围之内。当前第1页12