一种作为结直肠癌肿瘤标志物VPS53基因及其制备得到的药物和试剂盒的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种作为结直肠癌肿瘤标志物的vps53基因及其制备得到的药物和试剂盒。

背景技术：

结直肠癌是指在基因、饮食、环境等多种致病因素综合作用下，由大肠粘膜上皮组织转化而成的恶性肿瘤。在世界上其发病率和死亡率分别居恶性肿瘤的第三位和第四位。在发达国家，结直肠癌的发病率在所有恶性肿瘤中甚至位居第二位。目前，结直肠癌的治疗主要是外科手术为主的综合性治疗，包括肿瘤组织的外科切除、化疗、放疗、生物治疗及免疫治疗等。但是，由于结直肠癌病因复杂、恶性程度高、肿瘤生长速度快、侵袭能力强，导致其5年生存率较低。因此，早期发现、早期诊断、早期治疗已成为提高结直肠癌治愈率、延长患者生存时间的关键。

囊泡转运主要包括出芽、定向转运、栓系、锚定和膜融合。运输小泡和膜受体之间的最初连接是由系链因子介导的，系链因子识别运输小泡并缩小运输小泡和膜受体之间的距离。研究证明vps53可能参与细胞内胆固醇转运及维持溶酶体鞘脂的稳态。此外，vps53在不同肿瘤中的表达水平也存在差异。在前期研究中我们发现vps53在结直肠癌组织中的表达水平明显降低，但是vps53在结直肠癌发生发展中的生理作用及其作用机制尚不完全明确。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种作为结直肠癌肿瘤标志物的vps53基因及其制备得到的药物和试剂盒，过表达的vps53基因能够上调beclin1和lc3bii表达水平，并诱导结直肠癌细胞的凋亡和自噬，同时还可抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，因此，以vps53基因作为结直肠癌标志物，能够为结直肠癌的早期诊断和治疗提供非常重要的意义。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种肿瘤标志物vps53用于制备治疗结直肠癌的药物中的用途。

进一步地，vps53基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

进一步地，vps53可诱导结直肠癌细胞自噬。

进一步地，vps53通过上调beclin1和lc3bii表达水平来诱导结直肠癌细胞自噬。

上述核苷酸序列编码得到的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如seqidno.2所示。

含有上述vps53基因的重组载体。

含有上述vps53基因的细胞系。

一种用于治疗结直肠癌的药物，以上述蛋白质作为活性成分，以及其在药学上可接受的辅助成分。

一种用于结直肠癌体外诊断的试剂盒，包括用于检测该vps53基因表达量的引物。

本发明的有益效果为：

过表达的vps53基因能够上调beclin1和lc3bii表达水平，并诱导结直肠癌细胞的凋亡和自噬，同时还可抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，因此，以vps53基因作为结直肠癌标志物，能够为结直肠癌的早期诊断和治疗提供非常重要的临床意义。

附图说明

图1为vps53和自噬相关基因在结直肠癌中的表达量检测结果；

图2为过表达vps53对结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，以及促进结直肠癌细胞的凋亡和自噬的检测结果；

图3为vps53对自噬机制的调控检测结果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1材料和方法

1、病人组织样本收集

收集了2017年11月至2018年2月在南充市中心医院行手术切除的15例结直肠癌患者的肿瘤组织样本及邻近的正常组织。所有患者术前未接受放化疗并签署书面知情同意书。我们的研究也得到川北医学院第二临床学院伦理委员会的批准。收集的样本放置于低温保存管中，液氮快速冷冻后转移至-80度冰箱保存。

2、细胞培养

正常结肠fhc细胞(bncc338003)和lovo细胞(bncc338601)购于bena培养库(suzhou,china)；ht29(htb-38)、sw480(ccl-228)和hct116(ccl-247)购于atcc。fhc和hct116细胞在含有10％胎牛血清(fbs；invitrogencat.no.10099-141)和谷氨酰胺的rpmi-1640培养基中进行培养。sw620和sw480细胞在含有10％fbs的l-15培养基(gibco,cat.no.41300039)中培养。ht29细胞在含10％胎牛血清的mccoy's5a(sigma,cat.no.m4892)培养基中培养。lovo细胞在含10％胎牛血清的f-12k培养基(gibco)中培养。所有细胞均在包含5％co2，37℃环境下进行培养。

3、载体构建及转导

用primerstarmaxdna聚合酶复合物(takara,japan)扩增全长vps53基因，并将其克隆到pcdna3.1+载体(invitrogen)。将sw620和lovo细胞(2*10⁵个细胞/孔)种植到6孔板中，37℃条件下培养8小时。根据产品说明书用lipofectamine3000(invitrogen)将空载体(nc)和pcdna-vps53转染到sw620和lovo细胞。同时将自噬抑制剂(inhb)转染到sw620和lovo细胞。

4、rna提取及实时定量pcr(rt-qpcr)分析

用trizol(invitrogen)从组织匀浆及细胞中提取总rna。按照反转录试剂盒说明书(takara,japan)用rna合成cdna。用sybr-green-pcr试剂盒(qiagen,hilden,germany)在abi7500快速实时pcr系统上检测靶基因和管家基因(gapdh)的表达。使用2^-δδct法计算靶基因的相对表达水平。所用引物序列具体如表1所示：

表1引物序列

5、westernblot分析

研磨后的组织及处理过的细胞加入500μlripa裂解液(beyotime,cat.no.p0013b)后提取细胞总蛋白。用piercebca蛋白检测试剂盒(thermofisherscientific)对提取的蛋白质进行定量分析。在含有10％sds-page分离胶的孔中加入30ug蛋白质，通过电泳将不同分子量的蛋白质转移到pvdf膜(bio-rad,cat.no.170-4157)。用5％脱脂牛奶密封后，加入一抗在4℃条件下过夜。加入二抗(santacruz)后使用ecl系统(amershampharmaciabiotech)使膜着色。主要抗体如下：抗gapdh抗体(1:3000；abcam，ab9485)、抗vps53抗体(0.4μg/ml；abcam，ab251759)、抗lc3b抗体(1:2000；abcam，ab51520)、抗beclin1抗体(1.0μg/ml；abcam，ab62557)。

6、增殖实验

将sw620和lovo细胞(1*10⁴/孔)种植在96孔板，转染vps53高表达质粒或/和自噬抑制剂，用3-ma处理0、24/48和72小时后，每孔细胞加入15μlcck-8试剂。孵育3小时后在450nm处用酶标仪(thermofisher)测量od值。

7、流式细胞分析

将处理过的sw620和lovo细胞分离及离心(1000×g，5分钟)后收集，用pbs缓冲液悬浮细胞沉淀。使用annexinv-fitc/pi凋亡检测试剂盒(cat.no.ma0220)分析细胞凋亡，参照说明书，在细胞中加入500μl结合缓冲液，5μlannexinv-fitc及10μlpi。用流式细胞术(bdbiosciences)检测细胞凋亡数。

8、细胞迁移侵袭试验

细胞迁移和侵袭试验分别通过带或不带凝胶基质(cat.no.356230)的transwell板(costar,cat.no.3422)进行操作。将200μl在无血清培养基中处理过的sw620和lovo细胞(1*10⁵/ml)置于上室，含有20％胎牛血清的培养基置于下室。在37℃条件下孵育24小时，固定迁移和侵袭细胞10分钟，用0.5％结晶紫(cat.no.c3886)染色20分钟后用显微镜进行观察。

9、透射电子显微镜检测自噬

收集处理过的sw620和lovo细胞并进行离心(500×g，5分钟)。细胞沉淀加入4℃条件下预冷的5％戊二醛溶液混合5分钟。悬浮并离心细胞，将沉淀用5％戊二醛和10％牛血清白蛋白(bsa；cat.no.bp1605)在冰上处理4小时。洗涤细胞后用8％焦磷酸钾和1％氧化四氧化锇固定细胞。将细胞用丙酮脱水，再用环氧树脂浸泡2天。使用莱卡emuc7超显微切片机进行切片，用2％醋酸铀酰染色后使用透射电镜进行观察。

实施例2vps53和自噬相关基因在结直肠癌中的表达情况

采用实施例1中步骤4设计的实时定量pcr(rt-qpcr)对结直肠癌组织中vps3和自噬相关基因beclin1的表达量进行了检测，其结果见图1。

图1中a为beclin1在癌旁正常组织(n＝15)和结直肠癌组织(n＝15)中的表达水平；b为癌旁正常组织(n＝15)和结直肠癌组织(n＝15)中vps53的表达水平；c为vps53在癌旁正常组织和结直肠癌组织中的western印迹分析；d为结直肠癌组织中beclin1与vps53的相关性分析(r2＝0.4719)；e为rt-qpcr法检测正常结肠fhc细胞和人结直肠癌细胞(sw620、ht29、sw480、hct116和lovo)中vps53的表达水平。

根据图1的检测结果可知，beclin1在结直肠癌组织中的表达水平较邻近的正常组织明显降低(p<0.01，图1a)。此外为了确定vps53在结直肠癌发生发展中的作用，我们检测了vps53在结直肠癌组织中的表达。如图1b和1c所示，结直肠癌组织中vps53的表达水平明显低于邻近正常组织(p<0.01)。同时我们的分析结果证实beclin1在结直肠癌中的表达水平与vps53的表达呈正相关(r2＝0.4719，图1d)。进一步我们通过rt-qpcr法检测了vps53在结直肠癌细胞中的表达，结果表明与正常结肠fhc细胞相比，vps53在结直肠癌细胞，尤其的lovo细胞中的表达水平明显降低，在sw620和sw480细胞中呈中等表达(p<0.01，图1e)。

实施例3vps53过表达抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进结直肠癌细胞的凋亡和自噬

将实施例1步骤3中的pcdna-vps53质粒和pcdna3.0空载质粒(nc)转染sw620和lovo细胞，然后再进一步检测了vps53过表达对sw620和lovo细胞增殖，以及结直肠癌细胞凋亡的影响，同时检测了过表达vps53对sw620和lovo细胞中beclin1和lc3b等自噬相关蛋白表达的影响。其结果见图2。

图2中a为westernblotting检测vps53分别在sw620和lovo细胞中的表达，左右两幅图为同一检测结果的不同表达形式，左侧为电泳检测结果，右侧为柱状图检测结果，柱状图中每组检测数据的柱状图由左至右依次为blank、nc和vps53的检测结果；

b为cck-8法检测过表达vps53对sw620和lovo细胞增殖的影响；c为流式细胞仪检测sw620和lovo细胞凋亡的检测结果；d为transwell分析过表达vps53对细胞迁移能力影响的检测结果，其中，左侧为光镜检测图，右侧两幅柱状图分别为过表达vps53的sw620和lovo细胞迁徙能力的检测结果；

e为transwell分析细胞侵袭检测结果，其中，左侧为光镜检测图，右侧两幅柱状图分别为过表达vps53的sw620和lovo细胞侵袭能力的检测结果；

f为过表达vps53的sw620和lovo细胞中的beclin1和lc3b的表达水平检测结果，其中左附图侧为电泳检测图，右侧为分别为sw620和lovo细胞中lc3b和beclin1表达水平的柱状图检测结果，柱状图中每组检测数据的柱状图由左至右依次为blank、nc和vps53的检测结果；g为细胞中表达的自噬体。

根据图2的结果可知，westernblotting结果显示，vps53在转染pcdna-vps53的sw620和lovo细胞中的表达水平明显高于转染pcdna3.0空载质粒(nc)的sw620和lovo细胞，表明vps53已成功转染至sw620和lovo细胞(p<0.001，图2a)。随后，我们进一步检测了vps53过表达对sw620和lovo细胞增殖的影响。cck-8法检测结果表明，转染pcdna-vps53质粒的sw620和lovo细胞与转染nc的sw620和lovo细胞相比，其细胞活力明显降低，表明vps53过表达能够抑制细胞的增殖(p<0.001，图2b)。肿瘤的另一个特点是可以抑制细胞凋亡，接下来我们采用流式细胞术检测vps53对结直肠癌细胞凋亡的影响。如图2c所示，过表达vps53可促进sw620和lovo细胞的凋亡(p<0.001)。除此之外我们还进一步检测了vps53对sw620和lovo细胞迁移和侵袭能力的影响。如图2d和2e所示，通过transwell法我们发现过表达vps53可抑制sw620和lovo细胞的迁移和侵袭能力(p<0.01)。不仅如此，我们还检测了过表达vps53对sw620和lovo细胞中beclin1和lc3b等自噬相关蛋白表达的影响。westernblotting结果显示过表达vps53可增加beclin1和lc3bii蛋白的表达水平(p<0.001，图2f)。同时我们还发现vps53可增加sw620和lovo细胞中自噬小体的表达(图2g，红色箭头表示自噬体；绿色箭头表示溶酶体)。

实施例4vps53通过调控自噬抑制结直肠癌细胞系肿瘤的生成

使用自噬抑制剂(inhb)处理高表达vps53的sw620和lovo细胞，并进行了功能实验，其结果见图3。

图3中a为inhb对vps53抑制sw620和lovo细胞增殖的影响；b为流式细胞术检测inhb对vps53诱导的sw620和lovo细胞凋亡的影响，其中，左侧为流式细胞术检测图，右侧柱状图为其柱状数据图；

c为vps53过表达质粒和inhb处理sw620和lovo细胞后进行的细胞迁移实验检测结果；其中，左侧为光镜检测图，右侧两幅柱状图分别为sw620和lovo细胞迁徙能力的检测结果；

d为vps53过表达质粒和inhb处理sw620和lovo细胞后进行的细胞侵袭实验检测结果；其中，左侧为光镜检测图，右侧两幅柱状图分别为sw620和lovo细胞侵袭能力的检测结果；

e为sw620和lovo细胞中beclin1和lc3b蛋白表达水平检测结果；其中，左侧为westernblotting电泳检测结果图；右侧两幅柱状图分别为lc3b和beclin1蛋白在sw620和lovo细胞中表达水平的检测结果，柱状图中每组检测数据的柱状图由左至右依次为vps53+inhb、vps53、nc的检测结果；fsw620和lovo细胞自噬体电镜超微结构，红色箭头表示自噬体；绿色箭头表示溶酶体。

根据图3的结果可知，cck-8结果显示过表达vps53可明显抑制结直肠癌细胞的增殖能力，但是inhb可逆转vps53对sw620和lovo细胞增殖的抑制作用(p<0.001，图3a)。流式细胞术检测结果表明过表达vps53可促进sw620和lovo细胞凋亡，但是inhb可逆转vps53诱导的sw620和lovo细胞的凋亡(p<0.001，图3b)。除此之外，我们的研究结果还表明inhb可逆转过表达vps53对结直肠癌细胞迁移和侵袭的抑制作用(p<0.05，p<0.01，p<0.001，图3c和3d)。更重要的是，我们发现过表达vps53可增加lc3bii，beclin1和vps53蛋白的表达，但是inhb则可抑制其表达(p<0.05，p<0.01，p<0.001，图3e)。上述结果证实vps53可通过直接调节自噬通路抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡和自噬。

综上可知，vps53是结直肠癌发生发展中的关键调控因子，过表达vps53可通过自噬通路抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡和自噬。

序列表

<110>南充市中心医院

<120>一种作为结直肠癌肿瘤标志物vps53基因及其制备得到的药物和试剂盒

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>13088

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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