一种预防新型冠状病毒肺炎的金花茶L-茶氨酸口服剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种预防新型冠状病毒肺炎的金花茶l-茶氨酸口服剂及其制备方法和应用。

背景技术：

金花茶(camellianitidissimac.w.chi)属于山茶科，山茶属，根据中国疾病预防控制中心营养与食品安全所的检验表明，金花茶属无毒级，含有多种对人体具有重要保健作用的有效成分，包括l-茶氨酸、各类维生素、总皂苷、齐墩果酸以及多种微量元素，具有非常高的药用价值。尤其是金花茶中特殊的游离氨基酸——l-茶氨酸，化学名称为n-乙基γ-l-谷氨酰胺，其含量占金花茶固形物的0.4-3％。

哈佛医学院布考斯基博士(林智.从茶叶抗病毒的研究谈茶氨酸的生产与应用前景[j].中国茶叶,2003,25(3):4-5)通过在志愿者身上进行试验，证明茶氨酸能通过调节γ-δ-t免疫细胞(γ-δ-t免疫细胞是细胞亚群的一种，它可以直接识别多种细菌、病毒以及寄生虫的抗原成分)，进而增强人体免疫系统，抵抗致病微生物如病毒、细菌和真菌的入侵，它甚至可五倍地提高人体预防疾病的抵抗力。bukowski等(bukowskijf,percivalss.l-theanineinterventionenhanceshumangammadeltatlymphocytefunction.[j].2010,66(2):96-102)认为一些烷基胺类物质如茶氨酸可以迅速被细胞直接识别，从而激活人的先天性免疫反应。这一过程中，茶氨酸在人体肝脏能分解出乙胺，乙胺被外周血液免疫细胞接触后可以促进细胞分泌干扰素，从而增强人体的先天性免疫，抵抗病毒侵袭，降低流感等疾病的发生。

但是，暂未见将金花茶的l-茶氨酸应用于预防新型冠状病毒肺炎的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种预防新型冠状病毒肺炎的金花茶l-茶氨酸口服剂及其制备方法和应用，该金花茶l-茶氨酸口服剂能有效提高人体免疫力和预防新型冠状病毒肺炎。

本发明提供了一种预防新型冠状病毒肺炎的金花茶l-茶氨酸口服剂，包括以下按质量份数计原料：金花茶l-茶氨酸15-30份，填充剂45-65份，润滑剂1-2.5份，崩解剂1-2.5份，矫味剂1-3份，粘合剂10-30份，甜味剂10-30份，余量为水。

相对于现有技术，本发明发现从金花茶中提取的l-茶氨酸能够提高人体免疫力，同时能够有效灭杀新型冠状病毒，因此，本发明以金花茶中提取的高纯度l-茶氨酸作为主要抗病毒活性成分，复配填充剂、润滑剂、崩解剂、矫味剂、粘合剂和甜味剂等辅料制成口服剂，为预防新型冠状病毒肺炎提供了一种新配方。

进一步地，所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、可溶性淀粉、交联聚维酮中的任意一种；所述甜味剂为木糖醇、甘露醇的任意一种。

进一步地，所述填充剂为微晶纤维素：预胶化淀粉＝1：1，或乳糖中的任意一种；所述润滑剂为硬脂酸镁、聚乙二醇-4000的任意一种。

进一步地，所述粘合剂为阿拉伯胶、玉米淀粉浆的任意一种；所述矫味剂为柠檬酸。

本发明还提供了一种预防新型冠状病毒肺炎的金花茶l-茶氨酸口服剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)金花茶预处理：选取金花茶的叶片或花朵，洗净、干燥、破碎、过筛后获得金花茶茶粉；

(2)提取金花茶l-茶氨酸：称取所述金花茶茶粉用40-80℃的水浸提2-5h后过滤，滤液调节ph值为3.5，在滤液中加入壳聚糖溶液絮凝去杂后，用非极性大孔吸附树脂进行脱色和除杂处理，将处理后的溶液过滤浓缩并调节ph至中性，于60-80℃下加热搅拌并加入碱性碳酸铜，获得紫色沉淀物；将所述紫色沉淀物用硫酸溶解后获得l-茶氨酸硫酸铜混合溶液；除去所述l-茶氨酸硫酸铜混合溶液进行去硫酸铜处理，再通过抽滤、浓缩、真空干燥、重结晶获得金花茶l-茶氨酸；

(3)制备口服剂：称取步骤(2)的金花茶l-茶氨酸，加入适量水和崩解剂于50-60℃下搅拌，再加入柠檬酸混合均匀后，以喷洒的方式加入到粘合剂中，将填充剂、润滑剂、甜味剂加入，充分混合，真空干燥后获得金花茶l-茶氨酸口服剂。

相对于现有技术，本发明从金花茶中分离出高纯度的l-茶氨酸，再复配适量的辅料如填充剂、润滑剂、崩解剂、矫味剂、粘合剂和甜味剂组合成口服剂，该口服剂可以内服并增强人体免疫力，同时对新型冠状病毒有一定的杀伤力，在抗击新型冠状病毒肺炎方面有巨大的预防和治疗潜力。

进一步地，在步骤(3)后还包括压制步骤：将步骤(3)的金花茶l-茶氨酸口服剂放入旋转式压片机中压制成含片。本发明制成的口服剂完整光洁、色泽均匀且无杂质，该金花茶l-茶氨酸口服剂体积小、携带方便且实用方便。

进一步地，步骤(3)中各原料的质量份数为：包括以下按质量份数计原料：金花茶l-茶氨酸15-30份，填充剂45-65份，润滑剂1-2.5份，崩解剂1-2.5份，矫味剂1-3份，粘合剂10-30份，甜味剂10-30份，余量为水。

进一步地，所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、可溶性淀粉、交联聚维酮中的任意一种；所述甜味剂为木糖醇、甘露醇的任意一种；所述填充剂为微晶纤维素：预胶化淀粉＝1：1，或乳糖中的任意一种；所述润滑剂为硬脂酸镁、聚乙二醇-4000的任意一种；所述粘合剂为阿拉伯胶、玉米淀粉浆的任意一种；所述矫味剂为柠檬酸。

进一步地，步骤(3)中，去硫酸铜处理的步骤为：在l-茶氨酸硫酸铜混合溶液中通入过量的硫化氢气体除去铜离子，再加入适量的氢氧化钡溶液沉淀硫酸根离子。去硫酸铜处理是为了除去l-茶氨酸中的铜离子和硫酸根离子，进一步提高获得的金花茶l-茶氨酸的纯度。

进一步地，步骤(2)中，壳聚糖溶液的浓度为1％；所述非极性大孔树脂可以为bs-55，bs-65，bs-80，d101，h103，x-5，dm11，hpd-100，d1400，d3250，hp-20，ads-5,ads-8中的任意一种。

本发明还提供了一种预防新型冠状病毒肺炎的金花茶l-茶氨酸口服剂的应用，将所述金花茶l-茶氨酸口服剂应用于预防新型冠状病毒肺炎。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1为本发明的金花茶l-茶氨酸分子结构图。

具体实施方式

本发明提供了一种预防新型冠状病毒肺炎的金花茶l-茶氨酸口服剂(以下简称金花茶l-茶氨酸口服剂)，包括以下按质量份数计原料：金花茶l-茶氨酸15-30份，填充剂45-65份，润滑剂1-2.5份，崩解剂1-2.5份，矫味剂1-3份，粘合剂10-30份，甜味剂10-30份，余量为水。

其中，所述填充剂为微晶纤维素：预胶化淀粉＝1：1，或乳糖中的任意一种；所述润滑剂为硬脂酸镁、聚乙二醇-4000的任意一种；所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、可溶性淀粉、交联聚维酮中的任意一种；所述矫味剂为柠檬酸；所述粘合剂为阿拉伯胶、玉米淀粉浆的任意一种；所述甜味剂为木糖醇、甘露醇的任意一种。

基于上述配方，本发明还提供了一种预防新型冠状病毒肺炎的金花茶l-茶氨酸口服剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)金花茶预处理：选取金花茶的叶片或花朵，洗净、干燥、破碎、以20～40目过筛后获得金花茶茶粉；所述金花茶可以为东兴金花茶(camelliatunghinensish.t.chang)、小果金花茶(变种，camelliamicrocarpa(moethuang)s.l.mo)、中东金茶花(camelliaachrysanthachangets.y.liang，)、毛瓣金花茶(camelliapubipetalay.wanets.z.huang)、凹脉金花茶(camelliaimpressinervischangets.y.liang)、薄瓣金花茶(camellialeptopetalachangets.y.liang)、小瓣金花茶(camelliaparvipetalaj.y.liangetz.m.su)、四季金花茶(毛籽金花茶，camelliaptilospermas.y.liangetq.d.chen)、直脉多脉金花茶(camelliamultipetalaliangetdengvar.patens(liangetmo)s.y.liang)、多瓣金花茶(camelliamultipetalas.y.liangetc.z.deng)、柠檬(黄)金花茶(camellialimoniac.f.liang&s.l.mo)、薄叶金花茶(camelliachrysanthoidesh.t.chang)、夏石金花茶(camelliaxiashiensiss.y.liangetc.z.deng)、长柱金花茶(camellianitidissimavarlongistyla(moetzhong)s.y.liang)、龙州金花茶(camellialongzhouensisj.y.luo)、武鸣金花茶(camelliawumingensiss.y.liangetc.r.fu)、平果金花茶(camelliapinggaoensisd.fang)、顶生金花茶(camelliapingguoensisd.fangvar.terminalis(liangetsu)s.y.liang)、小花金花茶(camelliamicranthas.y.liangety.c.zhong)、弄岗金花茶(camellialonggangensisc.f.liangets.l.mo)、细叶金花茶(camelliaparvifolias.y.liangetf.f.li)、扶绥金花茶(camelliafusuiensiss.y.liangetx.j.dong)、天峨金花茶(camelliatianeensiss.y.liangety.t.luo)、多瓣淡黄金花茶〔camelliafavidachangvar.polypetala(liethe)s.y.liang)、淡黄金花茶(camelliaflavidah.t.chang)、簇蕊金花茶(camelliafascicularischang)、直脉多瓣金花茶(camelliamultipetalaliangetdengvar.patens(liangetmo)s.y.liang)、博白金花茶(camelliabobaiensiss.y.liangetj.j.wang)、五室金花茶(camelliaaureachang)、大金花茶(c.grandis(liangetmo)changets.y.liang)、四川金花茶(camelliaszechuanensiss.y.liangety.c.yang)、贵州金花茶(camelliahuanat.l.mingetw.j.zhang)、云南金花茶(camelliafascicularish.t.chang)、离蕊金花茶(camellialiberofilamentachangetc.h.yang)、越南东京金花茶〔camelliatonkinensis(pitard)cohenstuart〕、越南抱茎(金花)茶(camelliaamplexicauliscohenstuart)、库克芳金花茶(camelliacucphuongensisninhetrosmann)、厚叶金花茶(camelliacrassiphyllaninhethakoda)、塔姆岛金花茶(camelliatamdaoensishakodaetninh)、胡龙金花茶(camelliahulungensisrosmannetninh)以及camellialuteopallidat.q.t.nguyen&luu(theaceae)、camelliabugiamapensisorel,curry,luu&q.d.和camelliacapitataorel,curry&luu,sp.nov中的任意一种或几种的组合。

(2)提取金花茶l-茶氨酸：称取所述金花茶茶粉用40-80℃的水浸提2-5h后过滤，滤液调节ph值为3.5，在滤液中加入1％壳聚糖溶液絮凝去杂后，用非极性大孔吸附树脂进行脱色和除杂处理，将处理后的溶液过滤浓缩并调节ph至中性，于60-80℃下加热搅拌并加入碱性碳酸铜，获得紫色沉淀物；将所述紫色沉淀物用硫酸溶解后获得l-茶氨酸硫酸铜混合溶液；除去所述l-茶氨酸硫酸铜混合溶液进行去硫酸铜处理，去硫酸铜处理的步骤为：在l-茶氨酸硫酸铜混合溶液中通入过量的硫化氢气体除去铜离子，再加入适量的氢氧化钡溶液沉淀硫酸根离子，再通过抽滤、浓缩、真空干燥、重结晶获得金花茶l-茶氨酸；所述金花茶l-茶氨酸的分子结构图请参阅图1。

其中，所述非极性大孔吸附树脂为bs-55，bs-65，bs-80，d101，h103，x-5，dm11，hpd-100，d1400，d3250，hp-20，ads-5,ads-8中的任意一种。

(3)制备口服剂：称取步骤(2)的金花茶l-茶氨酸，加入适量水和崩解剂于50-60℃下搅拌，再加入柠檬酸混合均匀后，以喷洒的方式加入到粘合剂中，将填充剂、润滑剂、甜味剂加入，充分混合均匀后放入旋转式压片机中压制，真空干燥后获得金花茶l-茶氨酸含片。需要说明的是，本发明的金花茶l-茶氨酸口服剂可以为含片、喷雾、口服液、粉末等任意形式的内服药物。

以下通过实施例1和实施例2对本发明进行详细说明。

实施例1

(1)金花茶预处理：选择金花茶的叶片，按《中国药典》(2015)进行优选，随后洗净，干燥后粉碎成粉，用20目筛子过筛，得过筛后金花茶茶粉；所述金花茶为凹脉金花茶(camelliaimpressinervischangets.y.liang)。

(2)提取金花茶l-茶氨酸：称取所述金花茶茶粉100g用6倍量60℃的水浸提3h后过滤，用盐酸调节滤液ph值为3.5，在滤液中加入1％壳聚糖溶液絮凝去杂后，用d101非极性大孔吸附树脂进行脱色和除杂处理，将处理后的溶液过滤浓缩并调节ph至中性，于70℃下加热搅拌并加入碱性碳酸铜，获得紫色沉淀物；将所述紫色沉淀物用1mo/l硫酸溶解后获得l-茶氨酸硫酸铜混合溶液；除去所述l-茶氨酸硫酸铜混合溶液进行去硫酸铜处理，去硫酸铜处理的步骤为：在l-茶氨酸硫酸铜混合溶液中通入过量的硫化氢气体除去铜离子，再加入适量的氢氧化钡溶液沉淀硫酸根离子，再通过抽滤、浓缩、真空干燥、用无水乙醇进行重结晶获得白色针状结晶0.72g，所述白色针状结晶即为金花茶l-茶氨酸，纯度高达99.0％。

(3)制备口服剂：按照一定比例称取原料，金花茶l-茶氨酸20份，填充剂(微晶纤维素/预胶化淀粉＝1:1)50份，润滑剂(硬脂酸镁)2份，崩解剂(羧甲基淀粉钠)2份，矫味剂(柠檬酸)1.5份，粘合剂(玉米淀粉浆)15份，甜味剂(木糖醇)15份。

在金花茶l-茶氨酸中加入适量水和羧甲基淀粉钠于55℃下搅拌，再加入柠檬酸混合均匀后，以喷洒的方式加入到玉米淀粉浆中，将微晶纤维素：预胶化淀粉＝1:1、硬脂酸镁、木糖醇加入，充分混合均匀后放入旋转式压片机中压制，40℃下真空干燥2h后获得直径为8mm，重量为230mg的金花茶l-茶氨酸口服剂。

实施例2

(1)金花茶预处理：选择金花茶的花朵，按《中国药典》(2015)进行优选，随后洗净，干燥后粉碎成粉，用20目筛子过筛，得过筛后金花茶茶粉；小瓣金花茶(camelliaparvipetalaj.y.liangetz.m.su)。

(2)提取金花茶l-茶氨酸：称取所述金花茶茶粉150g用6倍量65℃的水浸提3.5h后过滤，用盐酸调节滤液ph值为3.5，在滤液中加入1％壳聚糖溶液絮凝去杂后，用hpd-100非极性大孔吸附树脂进行脱色和除杂处理，将处理后的溶液过滤浓缩并调节ph至中性，于72℃下加热搅拌并加入碱性碳酸铜，获得紫色沉淀物；将所述紫色沉淀物用1mo/l硫酸溶解后获得l-茶氨酸硫酸铜混合溶液；除去所述l-茶氨酸硫酸铜混合溶液进行去硫酸铜处理，去硫酸铜处理的步骤为：在l-茶氨酸硫酸铜混合溶液中通入过量的硫化氢气体除去铜离子，再加入适量的氢氧化钡溶液沉淀硫酸根离子，再通过抽滤、浓缩、真空干燥、用无水乙醇进行重结晶获得白色针状结晶1.08g，所述白色针状结晶即为金花茶l-茶氨酸，纯度高达99.0％。

(3)制备口服剂：按照一定比例称取原料，金花茶l-茶氨酸25份，填充剂(微晶纤维素/预胶化淀粉＝1:1)50份，润滑剂(聚乙二醇-4000)1.25份，崩解剂(可溶性淀粉)2份，矫味剂(柠檬酸)1.6份，粘合剂(阿拉伯胶)18份，甜味剂(甘露醇)16份。

在金花茶l-茶氨酸中加入适量水和可溶性淀粉于60℃下搅拌，再加入柠檬酸混合均匀后，以喷洒的方式加入到阿拉伯胶中，将微晶纤维素：预胶化淀粉＝1:1、聚乙二醇-4000、甘露醇加入，充分混合均匀后放入旋转式压片机中压制，45℃下真空干燥2.5h后获得尺寸为14mm*9mm，重量为550mg的金花茶l-茶氨酸口服剂。

以下通过验证实验证明本申请实施例1和实施例2的金花茶l-茶氨酸口服剂在抗新型冠状病毒中的功效。

(1)设计引物，获得第一代重组病毒：以新型冠状病毒covid-19的rna为模板，并以反转录酶合成cdna，以cdna为模板，用pcr技术分别获得covid-19s、m、e基因。构建以上三个基因的pmd-18t重组质粒，鉴定。并进一步地构建以上三个基因的pfastbac^tmdual重组质粒，并通过pcr、双酶切及测序鉴定。将pfastbac^tmdual重组质粒分别转化进入dh10bac感受态细胞中，摇床培养12～16h，进行pcr检测。挑取阳性菌落，扩菌，提取bacmiddna，获得三个重组rbacmiddna，将其分别转染sf9细胞，收获上清，即为第一代重组病毒。

(2)获得第二、三代重组病毒：用100μl第一代重组病毒感染sf9细胞，28℃放置2h，期间轻轻晃动培养瓶以使病毒均匀地吸附细胞。移除上清液，加2ml完全培养基，28℃培养72h之后，收集上清液，获得第二代重组病毒。将收获的病毒按上述方法继续传代，得到第三代重组病毒。将三种重组杆状病毒分别命名为rb-s、rb-m、rb-e，进行噬斑纯化并噬斑计数。

(3)获得感染细胞：将纯化的病毒感染sf9细胞，培养，分别收集上清液及细胞，western-bloting、血凝试验、间接免疫荧光实验检测重组蛋白的表达。再用纯化的三种重组杆状病毒rb-s、rb-m或rb-s、rb-m、rb-e共同侵染sf9细胞，28℃培养箱中培养约5d，收集感染的细胞，pbs吹散贴壁细胞，洗涤三次，超声波破碎，4℃，12,000g离心10min，取上清液。利用蔗糖密度梯度超速离心，纯化covid-19vlp，western-bloting鉴定vlps的组成蛋白，并利用透射电镜观察vlps的形态。

(4)添加金花茶l-茶氨酸口服剂：将纯化的covid-19病毒样颗粒(vlps)溶解在pbs溶液作为病毒原液，分别开展梯次covid-19稀释病毒液(10^-1、10^-2、10^-3.....10^-9)制备，随后开展病毒接种(37℃，5％co2孵育箱)，弃生长液，用pbs液冲洗次后，加入10pfu/ml的病毒液100μl(其中包含l％牛血清白蛋白的pbs液)置4℃吸附1h。吸附后的细胞用pbs液洗涤，添加本发明实施例1和实施例2制备(本例以实施例1参数为例)的金花茶l-茶氨酸口服剂的pbs分散液0.5-3ml，金花茶l-茶氨酸口服剂浓度为0.01-0.35mg/ml，于37℃、5％co2孵育箱培养8-72h，收集不同时间段培养液，用pbs洗去死细胞，活的细胞用mtt(噻唑蓝)比色法测得，用空斑形成单位(pfu)测定病毒繁殖量，观察在不同时间段(8h，10h，18h,24h,36h,48h,72h)显微镜观察致细胞病变效应(cytopathiceffect)，直至受到抗病毒产品病毒持续作用，产生的cpe不再进展为止。设置相同条件下的空白对照组(金花茶l-茶氨酸口服剂替换为等体积的pbs液)记录不同金花茶l-茶氨酸口服剂详细抗covid-19病毒详细数据。按照本发明所述方法，covid-19病毒在37℃孵育，10h后病毒pfu达到高峰。研究数据显示，以添加本专利所述金花茶l-茶氨酸口服剂1ml为例，在0.01-0.05mg/ml浓度区间内，该口服剂无明显抑制covid-19病毒效果。在0.05-0.35mg/ml浓度区间内，金花茶l-茶氨酸口服剂对covid-19病毒有显著抑制效果，并在浓度为0.21mg/ml时有最佳抗covid-19病毒效果。如数据显示空白对照组的covid-19病毒滴度为17.33×10⁴pfu/ml，而当金花茶l-茶氨酸口服剂浓度分别为0.06mg/ml、0.10mg/ml、0.15mg/ml、0.21mg/ml和0.30mg/ml时，其covid-19病毒滴度观测值分别为12.19×10⁴pfu/ml、7.34×10⁴pfu/ml、1.62×10⁴pfu/ml、0.83×10⁴pfu/ml和0.96×10⁴pfu/ml。所有实验组抗covid-19病毒效果均显著优于空白对照组，其中在0.21mg/ml最优浓度条件下，添加金花茶l-茶氨酸口服剂的实验组covid-19病毒pfu值仅约相当于空白对照组的4.8％，covid-19病毒活性大幅降低。实验结果也充分表明，本发明实施例1和实施例2制备的金花茶l-茶氨酸口服剂能够有效抗击新型冠状病毒。

相对于现有技术，本发明发现从金花茶中提取的l-茶氨酸能够提高人体免疫力，同时能够有效灭杀新型冠状病毒，因此，本发明以金花茶中提取的高纯度l-茶氨酸作为主要抗病毒活性成分，复配填充剂、润滑剂、崩解剂、矫味剂、粘合剂和甜味剂等辅料制成口服剂，为预防新型冠状病毒肺炎提供了一种新配方。且本发明通过高效的实验步骤制成的口服剂完整光洁、色泽均匀且无杂质，该金花茶l-茶氨酸口服剂体积小、携带方便且实用方便，在抗击新型冠状病毒肺炎方面有巨大的预防和治疗潜力。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。