一种新型软骨脱细胞基质墨水的制备方法与流程

本发明属于生物墨水的制备领域，特别涉及一种新型软骨脱细胞基质墨水的制备方法。

背景技术：

由于运动外伤、疾病和年龄引起的退化等因素，软骨缺损逐渐成为一种常见的现象，例如关节疼痛、畸形和半月板损伤等。

现有临床治疗方法包括关节置换手术和非手术治疗。关节置换手术后一段时间效果较好，但手术的风险和并发症易导致患者面临更痛苦的情况。非手术治疗方法能使部分患者的疼痛缓解，关节功能也能得到一定改善，但大多数患者治疗效果不佳。

软骨脱细胞基质是一种来源于自体或异体组织的无细胞的细胞外基质成分和结构，化学成分包括胶原、氨基葡萄糖、结构蛋白和弹性蛋白。它具有组织特异性，和较低的免疫原性，有利于软骨组织修复，在软骨组织工程领域具有很大的应用价值。

软骨脱细胞基质的质地致密，用作生物材料时往往需要将其制成溶液后单独使用或者与其他生物材料结合来使用。目前软骨脱细胞基质使用前需要将材料反复冻融，切片打碎并研磨。但此过程极其繁琐，由于其韧性较强，得到的材料颗粒较大(0.1-1cm)，且尺寸难以进一步缩小，因此需要连续搅拌10-14天才能大部分溶解，同时搅拌时间太长中容易出现细菌繁殖导致的蛋白质的腐败，对材料的安全性提出了很大挑战。因此现有方法具有很大缺陷，非常不利于软骨脱细胞基质的大批量加工以及作为一种安全无毒的生物材料用于软骨组织工程方面的应用。促进脱细胞基质的溶解，简化相关处理工艺，对于其应用具有十分重要意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种新型软骨脱细胞基质墨水的制备方法，以克服现有技术中软骨脱细胞基质质地致密导致的加工困难和溶解性差的缺陷。

本发明提供一种新型软骨脱细胞基质墨水的制备方法，包括：

(1)将软骨脱细胞基质在沸水中连续加热5-12h，直到软骨变为半透明或透明的胶冻状，然后冷冻干燥；

(2)将步骤(1)中冷冻干燥后的软骨脱细胞基质溶解在hcl的胃蛋白酶溶液中，搅拌至彻底溶解，得到软骨脱细胞基质溶液，其中软骨脱细胞基质溶解在hcl的胃蛋白酶溶液中的浓度为8-12mg/ml；

(3)将步骤(2)中软骨脱细胞基质溶液调节ph值为7.0-8.0(优选7.0-7.5)，滴加甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸缩水甘油酯或丙烯酰氯，搅拌反应，加入去离子水终止反应，透析，冷冻干燥；得到丙烯酰胺化软骨脱细胞基质，其中软骨脱细胞基质与甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸缩水甘油酯或丙烯酰氯的物料比为1g/ml；

(4)将步骤(3)中丙烯酰胺化软骨脱细胞基质溶解在hcl的胃蛋白酶溶液中，加入光引发剂，搅拌反应，得到软骨脱细胞基质墨水。

所述步骤(1)中软骨脱细胞基质来源于哺乳动物的软骨，包括但不限于，关节，耳，鼻和气管等部位。

所述步骤(1)中软骨脱细胞基质是通过物理或化学处理方法制备得到的，包括但不限于，氢氧化钠处理，triton处理等。

所述软骨脱细胞基质的制备方法包括：(1)获取新鲜的动物组织材料，并于4℃下低温保存；(2)将动物组织材料脱细胞，制成脱细胞基质。

所述步骤(2)中搅拌温度为室温，搅拌时间为12-24h。

所述步骤(2)中hcl的胃蛋白酶溶液ph值为3.0-4.0。

所述步骤(2)和(4)中hcl的胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶浓度为0.8-1.2mg/ml，盐酸浓度为0.008-0.012m。

所述步骤(3)中调节ph值为7.0-8.0是采用0.1m氢氧化钠溶液调节。

所述步骤(3)中搅拌反应温度为20℃，搅拌反应时间为12-24h，搅拌反应转速为300r/min。

所述步骤(3)中透析为：使用截留分子量为14000透析袋在去离子水中透析三天，每天换水三次。

所述步骤(4)中光引发剂包括2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮、1-羟基环己基苯基甲酮、2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮、2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦或2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮。

所述步骤(4)中搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为10-15h。

所述步骤(4)中软骨脱细胞基质墨水与细胞混合制备生物墨水。

所述步骤(4)中软骨脱细胞基质墨水在波长350-400nm的紫外光(功率10w)照射30s-60s，可固化成胶。

所述细胞包括：干细胞、软骨细胞或ips细胞。

本发明还提供一种上述方法制备得到的软骨脱细胞基质墨水。

本发明还提供一种上述方法制备得到的软骨脱细胞基质墨水的应用。

本发明通过在沸水中连续加热块状的软骨脱细胞基质，破坏天然软骨脱细胞基质中的氢键以及水解部分蛋白，在维持材料大部分组分不变的前提下，提升加工性能和酶溶解性。为扩展其应用，将软骨脱细胞基质溶液与甲基丙烯酸酐反应，可获得具有光交联特性的软骨脱细胞基质材料，可以作为一种生物墨水用于软骨组织工程应用。

有益效果

(1)本发明操作简单、便捷可行，使用天然脱细胞基质和甲基丙烯酸酐等为原料，来源广泛。

(2)本发明较常规方法的操作简单，软骨脱细胞基质溶解时间大大缩短，溶解性能得到极大提升，有望成为理想的组织工程支架，在软骨修复方面具有更广阔的应用前景。

(3)本发明制备的脱细胞基质生物墨水具有良好的流动性，具有快速光交联的特点。

附图说明

图1是本发明软骨脱细胞基质在沸水中处理不同时间的实体图。

图2是本发明加热法和研磨法制备软骨脱细胞基质溶液的比较图，其中加热溶解时间为12h，研磨溶解时间为2周。

图3是本发明加热法(上图)和研磨法(下图)制备软骨脱细胞基质溶液的比较图，其中加热溶解时间为12h，研磨溶解时间为2周。

图4是本发明甲基丙烯酸酐修饰的软骨脱细胞基质的氢谱核磁图(上图为软骨脱细胞基质，下图为甲基丙烯酸酐修饰的软骨脱细胞基质)。

图5是本发明软骨脱细胞基质生物墨水交联前后的实体图，其中左图为交联前，右图为交联后。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

加热法所用脱细胞软骨来源于上海市第九人民医院。甲基丙烯酸酐来自于阿拉丁试剂(上海)有限公司。

实施例1

软骨脱细胞基质由如下两种方法制备，其中方法一用于加热法，方法二用于研磨法。方法一是将软骨切割成0.5cm×0.5cm×2cm大小，置于表面皿内，以1mol/lnacl水溶液37℃浸泡24h，用4％naoh溶液消蚀，b型超声清洗仪间断振荡清洗16h，每4h更换消蚀液一次，随后在蒸馏水中浸洗24h，每4h更换一次蒸馏水，直至溶液变为清亮，ph值为中性，最后将制备好的软骨脱细胞基质浸于生理盐水(滴加青霉素和庆大霉素溶液)，储存于4℃冰箱备用。方法二是将软骨切成薄片(厚1mm)，在-80℃冷冻，然后磨成粗粉，将粉末在1％sds/pbs(w/v)溶液中搅拌72h，每24h换一次sds溶液，随后用0.1％edta/pbs(w/v)溶液处理24h，并用去离子水中浸泡过夜，最后将获得的脱细胞软骨在-80℃冷冻，然后真空冻干，接着将脱细胞的半月板基质进一步研磨成细粉，并在-20℃下保存备用。，将软骨脱细胞基质分别切成1cm厚薄片，置于100℃水中，分别连续加热1h,2h,3h,4h,5h,6h,7h，冷却至室温制备软骨脱细胞基质溶液，如图1所示，可见脱细胞软骨随着加热时间的增长，颜色由白色逐渐转变为半透明和透明，表明加热后脱细胞软骨的分子结构发生了一定变化。

实施例2

将软骨脱细胞基质切成1cm厚薄片，置于100℃水中，连续加热12h，冷却至室温制备软骨脱细胞基质溶液，同时采用研磨法溶解2周制备软骨脱细胞基质溶液作为对照，如图2和图3所示，可见研磨法得到的溶液呈乳白色，溶液不透明，且含有部分不溶的颗粒物；加热法得到的溶液为澄清透明的无色溶液，表明加热法促进了软骨脱细胞基质的溶解。

实施例3

(1)将软骨脱细胞基质切成1cm厚薄片，置于100℃水中，连续加热7h，冷却至室温，随后-80℃冷冻，真空干燥。

(2)将冻干所得软骨脱细胞基质加入到胃蛋白酶的盐酸溶液中(脱细胞基质浓度10mg/ml，胃蛋白酶浓度1mg/ml，盐酸浓度0.01m)，室温搅拌12h，溶解后再加入0.1mnaoh调节ph为7.0-8.0，随后滴加甲基丙烯酸酐(甲基丙烯酸酐与软骨脱细胞基质的物料比为1ml/g)，20℃反应24h，随后使用截留分子量14000的透析袋透析，-80℃冷冻，真空干燥，得到甲基丙烯酸修饰的脱细胞基质。

(3)将步骤(2)中甲基丙烯酸酐修饰的脱细胞基质溶解在胃蛋白酶的盐酸溶液(浓度分别为10mg/ml，胃蛋白酶1mg/ml,盐酸0.01m)中，并加入光引发剂i2959(浓度为1wt％)，完全溶解后调节ph为7.0-8.0即制得生物墨水，或加入细胞悬液，制得载有细胞的生物墨水。将上述生物墨水在波长350-400nm的紫外光(功率10w)照射30s-60s，可固化成胶，如图5所示。

图4是脱细胞基质的氢谱核磁图，图示表明：经过甲基丙烯酸酐修饰的软骨脱细胞基质与软骨脱细胞基质相比，在5.2ppm和5.5ppm附近出现了新峰，是甲基丙烯酸与赖氨酸和羟基赖氨酸结合所产生的，表明甲基丙烯酸酐修饰脱细胞基质成功。