一种复合神经电极及其制备方法与流程

本发明属于神经科学和生物医用仪器工程技术领域，具体涉及一种复合神经电极及其制备方法，尤其涉及一种携载治疗物的多功能复合神经电极及其制备方法。

背景技术：

二十一世纪被世界科学界公认为是生物学、脑科学的时代。神经科学是对人脑语言、记忆、思维、学习和注意等高级认知功能进行多学科、多层次的综合研究的主流方向之一。神经科学的一个核心挑战是了解由许多细胞类型组成的神经回路的组织和功能，从而对特定的由于大脑局部核团异常导致的疾病进行治疗和改善，如癫痫、帕金森症、顽固性疼痛、肌张力障碍以及精神疾病等中枢神经系统(cns)紊乱疾病以及脑癌等。

神经电极技术的发展为实现对神经元的高时空分辨和调控提供了可能。通过在神经环路中植入能够记录高时空分辨神经活动的神经电极，让神经科学家们能够了解特定神经元在神经环路中对神经信号的处理过程和作用，检测局部神经元功能的变化，同时长期稳定追踪和记录神经元的电生理活动，为研究神经网络之间的交互奠定了基础。

目前，对神经系统类疾病的治疗主要分为基因疗法和药物疗法，无论采用何种治疗方法，都需要通过适当的方式将活性物质(包括外源基因和/或药物和/或细胞等)作为药物转移至体内。主要的给药方式有全身给药以及局部给药。

全身给药方式进行药物输送时，由于血脑屏障(bloodbrainbarrier，bbb)的存在，使得大部分药物无法进入大脑内发挥药理作用，只有一些相对分子质量极小(＜500)，具有脂溶性及电荷中性的分子才容易经被动扩散穿过bbb，且全身给药存在效率低、毒性大的特点。脑内直接给药是一种更加直接高效的药物输送方法，药物不再需要通过血脑屏障进行药物转运，减少了全身给药造成的效率低下的问题。脑内直接给药依赖于渗透作用进入大脑组织和细胞，这种一步到位的治疗神经系统疾病的给药方式能提供持续的药效，在对复杂的中枢神经系统疾病的治疗方面引起广泛关注。如前所述，为了更好地研究不同脑区的功能以及脑区之间的交互，需要在脑部植入神经点击，在调节神经元功能的同时对神经元的信号进行长期稳定记录。

然而，目前药物输送和神经电极的植入通常需要通过两步法进行，即首先将药物定位注射或输送到目的脑区，然后再同位点植入神经电极。这大大增加了实验操作的难度以及对大脑组织的损伤，并且很难达到进行药物注射和电极植入位置的高度定位。

因此，如何将药物与神经电极同时精确地植入大脑，减少对大脑的损伤是本领域亟待解决的问题。

技术实现要素：

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种复合神经电极，该复合神经电极由柔性神经电极和活性物质组成，柔性神经电极的电极阵列与活性物质通过弹性毛细管共组装技术共同嵌入到可植入大脑的聚合物中，提供一种集神经调控、检测和治疗于一体的多功能复合神经电极。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种复合神经电极，所述复合神经电极包括柔性神经电极固化物，所述柔性神经电极固化物包括聚合物固化物和通过共同自组装(即共组装)作用分散所述聚合物固化物中的柔性神经电极阵列；所述聚合物中分散有活性物质。

本发明中通过特殊的毛细自组装作用将柔性神经电极固定于分散有活性物质的聚合物固化物中，所得到的复合神经电极可植入大脑的特定脑区，并且将负载的活性物质定点输送到目的脑区，对目的脑区的神经元功能进行调控；在脑内植入过程中，聚合物可为电极穿透组织提供机械支持，也是活性物质传递的固体载体；同时由于柔性神经电极的电极阵列可以追踪神经元的电生理信号，可将电生理信号检测和光遗传技术相结合，对神经环路、神经疾病等方面的研究具有重要的应用价值。

作为本发明一种优选的技术方案，所述柔性神经电极阵列由柔性衬底层、柔性绝缘层和设置于衬底层和绝缘层之间的金属连接线层组成，所述金属连接线层由连接电极位点和焊接点的金属连接线组成。

优选地，所述复合神经电极包括依次连接的焊盘、连接区和功能区，焊盘上设有焊接位点，所述功能区由设置有电极位点的神经电极组成，所述电极位点和焊接点表面设有柔性绝缘层。

复合神经电极包含依次连接的焊盘、连接区和功能区，其中功能区即为柔性神经电极固化物，主要包含电极记录位点、可以实现光/电刺激的刺激元件以及负载的药物，中间的连接区为连接电极位点和焊接点的包裹在两层绝缘材料中的连接线。

优选地，所述复合神经电极还包括刺激元件，所述刺激元件包括神经刺激电极、光纤或led器件中任意一种或至少两种的组合。

本发明中，柔性神经电极的电极阵列在组装的同时还能够与光纤、led等光刺激元件以及电刺激电极等共组装，以实现对神经元功能的调控。这种多功能神经电极克服了以往常用的两步手术法，即药物注射-光纤/电极植入法造成的大脑伤害严重、手术过程繁琐等问题，可通过一步手术法实现药物的定点输送以及刺激元件的埋植。

本发明中，所述复合神经电极的直径为50～500μm，例如可以是50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm或500μm等，优选为90～200μm。

本发明中对柔性神经电极以及电极阵列的结构无严格限制，能够发生自组装即可。作为优选的技术方案，所述柔性神经电极为具有如cn106667475a中所述的梳齿结构的植入式柔性神经电极。其电极阵列具有独特的线-网-面结构，共组装和固化之后能够形成了针状到平面的过渡结构，其梳齿状结构在水中会分散开：置于空气中，在毛细作用下会形成针状，经固化后能够保证植入实验动物大脑的过程中保持稳定的力学稳定性，并将负载的药物输送到目的脑区：其网格结构在卷曲作用力下会卷成滚筒或半滚筒状，植入后可与大脑进行良好的贴合。

优选地，所述聚合物固化物由聚合物或者聚合物单体固化得到，所述聚合物包括聚乙二醇、壳聚糖、蚕丝蛋白、聚丙交酯乙交酯、胶原蛋白、海藻酸钠、明胶或基底膜中的任意一种或至少两种的组合。

本领域的技术人员能够根据实际需求选择任意一种聚合物和水的熔融液以达到相同的处理效果。以上聚合物具有优良的生物相容性，在脑组织中引起的免疫反应小，并且能够在生物组织环境中溶解和进一步降解。

柔性神经电极阵列在水/聚合物熔融液中共组装并固化之后，得到具有足够硬度的复合神经电极，可在植入大脑的过程中保持良好的力学稳定性。当到达目的脑区之后，多功能复合柔性神经电极阵列表面包裹的聚合物具有亲水性，能够缓慢溶解，同时聚合物包裹的药物能够缓慢进行释放，并被周围神经元和组织细胞吸收，达到局部神经元治疗的目的。同时，随着聚合物的逐步释放或降解，柔性神经电极阵列可恢复其柔性特点，从而恢复与脑组织相匹配的机械性能。

作为本发明一种优选的技术方案，所述活性物质选自基因类药物、肽类或蛋白质类药物、化学类药物或细胞中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述基因类药物携带的基因包括光遗传基因、基因编辑工具基因、神经因子基因、巨噬细胞炎性蛋白-1基因、乙酰胆碱酶基因、多巴胺受体4基因、络氨酸羟化酶基因、芳香氨基酸脱羧酶基因、乙酰胆碱转移酶基因或神经特异性转录因子中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述基因类药物的表达载体为病毒载体(如逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体、单纯孢疹病毒载体、慢病毒载体或多种杂交型病毒载体)、噬菌体载体(如λ类双链噬菌体，m13、f1或fd单链丝状噬菌体)、非病毒载体(如脂质体、质粒载体)、高分子载体(如聚乙烯亚胺(pei)、聚赖氨酸(pll)、壳聚糖(cs)、聚酰胺-胺型树状物(pamam)等阳离子聚合物载体，聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚乙烯醇(pva)或三嵌段聚合物peo-to-eo等两亲性高分子)或无机纳米粒子载体(如硅、铁氧化物、碳纳米管、磷酸钙、金属纳米粒子或量子点等)中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述基因类药物的表达载体为包装有光遗传基因的腺相关病毒。

作为本发明一种优选的技术方案，所述化学类药物包括左旋多巴、地塞米松、胞磷胆碱、雷帕霉素、阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、樟柳碱、神经节苷酯、脑肽节苷脂、多奈哌齐、盐酸美金刚、5-羟色胺、左旋多巴胺、紫杉醇及其衍生物、甲氨蝶呤、替尼类、水合氯醛、咖啡因、麻黄碱、地西泮或单盐酸氟西泮中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述肽类或蛋白质类药物包括脑源性神经营养因子(bdnf)、神经营养素-3(nt-3)、神经营养物质-4/5(nt4/5)、神经营养素-6(nt-6)、睫状神经营养因子(cntf)、胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)、芳香氨基酸脱羧酶(aadc)、鼠神经生长因子、多巴胺合成酶，乙酰胆碱转移酶(cha)或络氨酸羟化酶(th)中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述的细胞包括干细胞和/或免疫细胞。

优选地，所述干细胞包括骨髓间充质干细胞、骨髓基质干细胞、神经干细胞或造血干细胞中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述免疫细胞包括nk细胞、t细胞、b细胞或巨噬细胞中的任意一种或至少两种的组合。

本发明所述的活性物质，不仅包括上述列举的种类，其他的基因或药物同样适用，但由于篇幅有限，本发明不再穷尽列举上述基因或药物之外的所有种类。

第二方面，本发明还提供一种如第一方面所述的复合神经电极的制备方法，采用一次共组装固化法或二次共组装固化法制备得到所述复合神经电极。

本发明提供的方法可将二维平面的柔性神经电极阵列在负载有活性物质的聚合物溶液中自组装成具有三维柱状结构的电极阵列，并通过特殊的毛细自组装作用将聚合物中负载的活性物质共同组装成为多功能复合电极。

作为本发明一种优选的技术方案，所述一次共组装固化法包括：(1)将活性物质加入聚合物溶液或者聚合物单体溶液中得到含有活性物质的混合液；

(2)将柔性神经电极阵列浸入步骤(1)所述混合液中；

(3)将所述柔性神经电极阵列取出，所述柔性神经电极阵列和混合液发生共组装，固化后得到所述复合神经电极。

一次共组装固化法将聚合物分散于溶剂中或直接将聚合物熔融，再加入活性物质得到含有活性物质的聚合物熔融液，而后将所述柔性电极阵列全部浸入所述聚合物熔融液中，取出后，发生共组装并固化，得到所述复合神经电极。

使用一次共组装固化法制备得到的复合神经电极其整个固化部分均含有药物。

同时，本发明中加入的活性物质可以为液体、粉末或固体等任意形态。活性物质的浓度可通过调节加入药物的量进行调节。

优选地，所述二次共组装固化法包括如下步骤：

(1′)将柔性神经电极阵列加入聚合物溶液或者聚合物单体溶液并取出，得到含有柔性神经电极阵列的初始聚合物固化物；

(2′)将活性物质加入至所述聚合物溶液或者聚合物单体溶液中得到含有活性物质的混合液；

(3′)将步骤(1′)得到的含有柔性神经电极阵列的初始聚合物固化物部分解固化，而后将解固化的部分浸入步骤(2′)所述的含有活性物质的混合液中，取出后，发生共组装并固化，得到所述复合神经电极。

使用二次共组装固化法能够调节柔性神经电极浸入熔融聚合物或聚合物溶液中的长度，调控药物的分布范围。

作为本发明一种优选的技术方案，所述聚合物溶液为聚合物熔融液、聚合物水溶液或含有聚合物的有机溶液。所述聚合物熔融液为纯聚合物熔融后得到的溶液，所述聚合物水溶液为聚合物溶于水之后的溶液，所述含有聚合物的有机溶液则以有机溶剂溶解聚合物。也就是说，所述聚合物可以以多种方式形成溶液来浸没柔性神经电极。

优选地，步骤(3)、步骤(1′)和步骤(3′)中所述取出的操作均为：将所述柔性神经电极阵列垂直于所述聚合物溶液或者聚合物单体溶液液面取出。

优选地，所述柔性神经电极阵列从溶液中提出的速度为0.1～3mm/s，例如可以是0.2mm/s、0.4mm/s、0.6mm/s、0.8mm/s、1mm/s、1.2mm/s、1.4mm/s、1.6mm/s、1.8mm/s、2mm/s、2.2mm/s、2.4mm/s、2.6mm/s或2.8mm/s等，优选为1.5mm/s。

当柔性神经电极阵列从熔融聚合物或聚合物溶液中取出后，可进行晾干或冻干处理，以使得固化剂进一步固化成型。

提出速度需要保证在取出浸没在固化剂中的柔性神经电极梳时，电极阵列的自组装过程能够顺利进行。取出速率过快容易导致电极梳发生弯曲变形，不利于针状结构的形成，表面容易出现固化剂液滴，从而增加电极植入大脑过程中对大脑造成的创伤。

作为本发明一种优选的技术方案，所述制备方法包括如下步骤：采用一次共组装固化法或二次共组装固化法制备得到所述复合神经电极；

其中，所述一次共组装固化法包括如下步骤：

(1)将活性物质加入聚合物溶液或者聚合物单体溶液中得到温度为30～100℃的含有活性物质的混合液；

(2)将柔性神经电极阵列浸入步骤(1)所述的混合液中；

(3)将所述柔性神经电极阵列以0.1～3mm/s的速度垂直于液面取出，所述柔性神经电极阵列和混合液发生共组装，固化后得到所述复合神经电极；

所述二次共组装固化法包括如下步骤：

(1′)将柔性神经电极阵列加入聚合物溶液或者聚合物单体溶液并以0.1～3mm/s的速度垂直于液面取出，得到含有柔性神经电极阵列的初始聚合物固化物；

(2′)将活性物质加入至所述聚合物溶液或者聚合物单体溶液中得到含有活性物质的混合液；

(3′)将步骤(1′)得到的含有柔性神经电极阵列的初始聚合物固化物部分解固化，而后将解固化的部分浸入步骤(2′)所述的含有活性物质的混合液中，以0.1～3mm/s的速度垂直于液面取出后，发生共组装并固化，得到所述复合神经电极；

本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明所述的多功能复合柔性神经电极，集局部神经元治疗、调控和电信号检测多种功能于一体，利用一次手术的方式，将神经药物、刺激元件、柔性神经电极同步植入大脑内，可研究目的脑区特定神经元的功能，并研究其在神经环路中的作用机制，与传统的药物注射-电极植入两步开颅手术方式相比，一次手术法能大大减小手术损伤，降低免疫反应。

(2)本发明所述的多功能复合神经电极携带的药物作用的神经元的范围和个数可通过调控负载药物的浓度和复合探针的直径进行调控；复合探针携带的药物作用的神经元与刺激元件和柔性神经电极位点与空间位置高度一致，大大提高对神经元控制和记录的灵敏度。

(3)本发明所述的多功能柔性复合电极中的柔性神经电极阵列，采用微纳加工工艺制备，可通过设计精确控制各记录位点竖直方向间距和水平面内分布，对大脑神经元信号进行三维检测。

附图说明

图1为实施例1中制备的61通道的柔性神经电极加工过程示意图；其中，(i)为二氧化硅/硅基底，(ii～v)表示依次在二氧化硅/硅基底表面(ii)磁控溅射铝牺牲层、(iii)旋涂底层聚酰亚胺绝缘层、(iv)热蒸镀金层以及(v)旋涂第二层聚酰亚胺绝缘层。

图2为实施例1中制备的61通道的柔性神经电极的结构示意图。

图3(a)为图2中区域(a)所示的61通道的柔性神经电极的局部放大图；图3(b)为图2中区域(b)所示的61通道的柔性神经电极的局部放大图；图3(c)为图2中区域(c)所示的61通道的柔性神经电极的局部放大图。

图4为实施例1中电极阵列在聚合物熔融液中进行弹性毛细自组装的示意图，其中(i～iv)为电极阵列浸没在熔融peg中以及取出后各阶段的形貌图(标尺200μm)。

图5为实施例1中电极阵列在负载有腺相关病毒的聚合物熔融液中进行二次共组装固化的示意图，其中(i～iii)为电极阵列在水或熔融液中以及取出后各阶段的形貌图(标尺200μm)。

图6(a)为实施例1中固化得到的复合电极探针在激光扫描共焦显微镜下的整体图，其中区域a所示为复合神经电极针状与网格结构连接处，b为复合神经电极针状尖端(标尺200μm)；图6(b)为图6(a)中区域a所示区域放大图(标尺200μm)；图6(c)为图6(a)中区域b所示区域放大图(标尺200μm)。

图7为实施例2中复合神经电极在小鼠大脑中的荧光蛋白表达图(标尺500μm)。

图8为实施例2中复合神经电极在小鼠大脑中的荧光蛋白表达图(标尺50μm)。

图9为实施例2中复合神经电极在小鼠大脑中的明场图(标尺50μm)。

图10为实施例3中制备的多功能复合神经电极的流程示意图，其中(i～iii)为神经电极与光纤共组装示意图，(ii)神经电极阵列浸没与含有活性分子的聚合物溶液中，(iii)将神经电极阵列取出后，发生共组装并固化。

图11为实施例3中制备的复合神经电极的局部放大图。

图12为图11中沿虚线a处的剖面结构示意图。

图13为图11中沿虚线b处的剖面结构示意图。

图14为实施例4中实验小鼠在10hz和20hz的激发光下产生的动作电位示意图。

图15为高通滤波下与光刺激相关的电生理信号波形图。

图16为实施例5中小鼠在光刺激前后的运动轨迹图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

实施例1

本发明提供一种柔性神经电极/腺相关病毒(raav)/peg多功能复合神经电极，并使用二次共组装固化法进行制备。具体方法如下：

1.制备植入式柔性神经电极：选用具有如cn106667475a中所述的梳齿结构的植入式柔性神经电极作为处理对象，其加工过程如图1所示，i为二氧化硅/硅基底，ii～v部分表示依次在二氧化硅/硅基底表面(ii)磁控溅射铝牺牲层、(iii)旋涂底层聚酰亚胺绝缘层、(iv)热蒸镀金层以及(v)旋涂第二层聚酰亚胺绝缘层。以i部分为例，上图表示电极的正面图，下图为图中虚线位置所示的截面图；vi部分表示电极通过等离子刻蚀之后得到的电极正面和截面示意图，得到具有依次连接的焊盘、实心、网格和梳齿结构的柔性神经电极；

所述柔性神经电极如图2和图3所示，图2为神经电极整体结构，图3(a)、图3(b)、图3(c)分别为图2中a、b、c三处区域对应的局部放大图，其由61根长6.5mm，宽15μm，厚3.5μm的三层结构(绝缘层/导线/绝缘层)电极丝(即电极)组成，焊盘上设置有对应电极的焊接点。

2.对上述植入式柔性神经电极进行预共组装固化得到柔性神经电极/peg复合神经电极：

将平均分子质量为4000的聚乙二醇(peg4000)倒入干净烧杯中，并在120℃的热板上加热直到其全部融化呈澄清状；

将柔性神经电极的焊盘部分固定在能够准确调节高度的定位仪上，并将柔性神经电极的电极阵列全部浸入熔融peg中，如图4中(i)部分所示，电极阵列的实心结构、网格结构以及梳齿状部分全部浸入熔融peg中；

将电极在垂直液面的方向上以1.5mm/s的速度匀速提起，使得电极阵列中的网格结构和梳齿结构发生卷曲，如图4中(ii)和(iii)所示，电极阵列的网格结构自组装成柱状结构；再根据(iv)所示，电极阵列的梳齿部分和聚合物溶液共组装形成直径～90μm的针状结构；将完全提出的柔性神经电极在25℃下，置于空气中1min后可得到固化后的可植入式柔性神经电极/peg复合电极。

3.释放柔性神经电极/peg复合电极的梳齿结构：将上述固化后的植入式柔性神经电极探针的梳齿结构部分，其长度为～6mm，浸没于50℃的去离子水中，如图5中(i)所示，原本的peg融化，并释放出尖端的电极丝使其恢复成梳齿状。

4.配制raav和peg4000的聚合物熔融液，其中腺相关病毒选用的是raav9-hsyn::egfp，其中血清型为对大脑具有较高转染效率的9型血清型，启动子为对神经元具有特异性转染的hsyn(humansynapsin-1promoterh)启动子，目的蛋白为加强型绿色荧光标蛋白egfp(enhancedgreengluorescentprotein)。

具体的配置过程为：首先取180μl100℃的熔融peg置于250μl的离心管中，并将其置于55℃的恒温油浴锅中；待上述熔融peg降温至55℃后，取20μl滴度为10¹³vg/ml的raav9-hsyn::egfp病毒加入熔融peg4000中，并充分搅拌均匀，之后将油浴温度降到45℃并保持恒温。

5.对柔性神经电极阵列/peg探针进行第二次共组装固化得到柔性神经电极/raav/peg复合神经电极。

将释放了部分梳齿结构的柔性神经电极/peg复合电极浸没于上述raav9-hsyn::egfp/peg熔融液中，如图5中(ii)部分所示，并静置30s，待电极丝部分在熔融液中均匀分散；将电极在垂直液面的方向上以0.5mm/s的速度匀速提起，如图5中(iii)部分所示，对柔性神经电极阵列的尖端部分进行二次共组装固化，得到尖端直径为～90μm的针状结构；将完全提出的柔性神经电极置于～25℃的空气中，最终得到柔性神经电极/raav/peg多功能复合神经探针。所述探针用激光扫描共焦显微镜(奥林巴斯公司，lextols4000)扫描，得到的整体图如图6(a)所示，复合神经电极针状与网格结构连接处如图6(b)所示，复合神经电极针状尖端如图6(c)所示，说明固化之前的梳齿状电极全部聚合在一起并通过聚合物固化，形成了稳定的针状结构。

实施例2

本实施例利用实施例1制备的复合神经电极植入小鼠脑部，验证柔性神经电极负载raav病毒的可行性，具体操作如下：

1.电极植入：取健康c57小鼠，按照0.01g/ml的标准注射戊巴比妥钠将小鼠麻醉；待小鼠深度麻醉之后，将其固定在立体定位仪上，用棉签蘸碘伏在小鼠头部涂抹消毒，并将毛发剪去；用剪刀将小鼠头皮沿中缝剪去，清理颅骨表面组织，露出干净颅骨。

将带有窗口的铁片用组织胶固定在小鼠颅骨上，起到固定电极和连接地线的作用；用颅钻在目标脑区m2/vo(坐标，+2.50mm，+0.80mm)上方钻出1mm×1mm的方形孔并小心挑去硬脑膜用于植入电极；在对称脑区(坐标，+2.50mm，-0.80mm)上方钻出一个0.4mm的圆孔用于埋植地线，将地线的一端缠绕在铁片上，一端平行于颅骨植入颅骨与硬脑膜之间。

将实施例1中制备的柔性神经电极/raav/peg多功能复合神经电极固定在立体定位仪上，并按照1mm/s的速度垂直于脑表面植入小鼠目标脑区1.7mm的深度；用隔离胶封闭颅骨孔，在电极周围和铁片底托之间涂抹牙科水泥进行固定。

2.脑片荧光表征：在电极埋植3周后，注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，心脏灌流后断头取脑；沿大脑水平方向切成100μm脑片，并进行荧光观察，激发波长为488nm；所得结果如图7-图9所示，从图7的荧光扫描图可以看到，电极周围(图中框线所示区域)直径～250μm的范围内能观察到很强的绿色荧光，并且通过图8的放大图可以看到神经元轴突和树突具有清晰的荧光转染。并且图9中能清晰看到电极切面，为图8中的转染范围的中心，说明柔性神经电极能与转染的神经元实现微米级别的精确空间定位。

因此，由实施例2可以证明，所述柔性神经电极的电极阵列部分在载有腺相关病毒(raav)的熔融peg聚合物中能够进行共组装，并且电极上能够承载药物，得到复合神经电极，同时所述复合神经电极植入大脑后，能够有效地将病毒载入脑内并在电极周围的神经元表达。

实施例3

本实施例提供一种柔性神经电极/腺相关病毒/光纤/peg的多功能复合神经电极。具体制备方法如下：

1.柔性神经电极的制备：选用33通道柔性神经电极阵列，其微加工流程与实施例1中的植入式柔性神经电极阵列相同。该植入式柔性神经电极包括依次连接的焊盘、4mm的实心结构、7mm的网格结构和4.5mm的梳齿结构，其中梳齿结构由33根长4.5mm，宽15μm，厚3.5μm的三层结构电极丝组成，焊盘上设置有对应电极的焊接点。

2.将柔性神经电极阵列与光纤共组装：选用cn107638175a中的神经电极阵列-光纤共组装方法，将上述柔性神经电极阵列与光纤进行共组装，其支撑结构、光纤、柔性电极阵列的空间结构如图10中(i)所示。

具体共组装方法如下：将光纤一端的套管固定在3d打印的支撑结构的凹槽中，并将其置于去离子水中；将柔性电极阵列在去离子水中与光纤对齐并超出光纤尖端500μm，然后将柔性电极阵列的硅基底一侧固定在支撑结构带有凹槽的一面；将固定在一起的支撑结构、光纤和柔性神经电极阵列从水中捞出，使柔性电极阵列卷曲包附于光纤表面；将柔性神经电极阵列/光纤复合神经电极放入高温熔融peg中进行，以1.5mm/s的速度匀速提起，得到柔性神经电极阵列/光纤/peg复合电极。

3.释放柔性神经电极阵列/光纤/peg复合电极尖端的梳齿结构：将上述的神经电极阵列/光纤/peg复合电极的梳齿结构浸没于50℃的去离子水中，使peg融化，并释放出神经电极的梳齿结构。

4.配制raav和peg4000的混合熔融液，其中腺相关病毒选用的是raav9-hsyn::chr2(h134r)-mcherry，目的蛋白为兴奋性光敏蛋白(chr2(h134r))和作为荧光标记的红色荧光蛋白(mcherry)。

具体的配置过程如下：取180μl100℃的熔融peg置于250μl的离心管中，并将其置于55℃的恒温油浴锅中；待上述熔融peg降温后，取20μl滴度为10¹³v·g/ml的raav9-hsyn::chr(h134r)-mcherry病毒加入上述熔融peg4000中，并彻底搅拌均匀，之后将油浴温度降到45℃并保持恒温。

5.制备柔性神经电极/光纤/raav/peg多功能复合神经电极：将释放出梳齿结构的神经电极阵列/光纤/peg复合电极的支撑结构部分固定在能够准确调节高度的定位仪上；将释放的梳齿结构浸没在45℃raav/peg4000的熔融液中，如图10中(ii)所示，以1.5mm/s的速度匀速提起；发生共组装并固化，如图10中(iii)所示，得到尖端负载有raav9-hsyn::chr2(h134r)-mcherry病毒的多功能复合神经电极，图11表示共组装固化得到的含有腺相关病毒植入式复合神经电极探针局部放大示意图。

图12为复合神经电极探针前端沿图11中虚线a处的剖面结构示意图，其中电极均匀分布在光纤表面，腺相关病毒与聚乙二醇将光纤与电极包裹。图13为复合神经电极探针前端沿图11中虚线b处的剖面结构示意图，由图可知，此处不含光纤，仅有电极分散在含有腺相关病毒的聚乙二醇中。

实施例4

本实施例利用实施例3制备的复合神经电极植入小鼠脑部，验证复合神经电极载入的光纤能否用于传导激活光敏蛋白的激光，具体操作如下：

1.电极植入：电极植入的操作同实施例2。

2.同步光刺激和电生理信号检测：用异氟烷将小鼠麻醉，并将小鼠固定在定位仪上；将柔性神经电极阵列的后端与128通道神经电生理记录系统连接起来，将光纤与激光器连接。

在信号记录过程中，设定激光器参数给光：每十秒进行一次一秒的光刺激，激光波长为473nm，激光能量为20mw/mm²，给光频率为10hz，20hz；对测得的电生理信号进行250～5000hz带通滤波，并分析单个神经元的动作电位。

图14为实验小鼠在10hz和20hz的激发光下产生的动作电位，图15为光刺激下的具有代表性的电生理信号波形图，从图中可以看到，每个光脉冲都能激发一一对应的神经元动作信号，关闭激光之后，动作电位迅速消失。

实验结果表明多功能神经电极携带的光遗传病毒对神经元进行了特异性转染，并且实施例3中制备的多功能复合神经电极可以对转染的神经元进行高时空分辨率地调控与检测。

实施例3和实施例4中，通过在多功能复合神经电极中负载病毒的方法将外源光敏感蛋白基因导入目标脑区细胞中，并通过多功能电极中的光纤刺激元件调控神经元的活动，说明电极阵列可与光纤在载有光遗传病毒的聚合物熔融液中进行共组装，得到复合神经电极，该复合神经电极可实现对电极周围局部神经元的转染，载入的光纤用于传导激活光敏蛋白的激光，使得神经元的发放具有光响应功能，同时柔性神经电极可实现神经元信号的长期稳定检测。

实施例5

本实施例中通过一步手术法实现光遗传行为学的检测，利用多功能神经电极对小鼠的局部神经元进行转染，并用光刺激调控小鼠行为。

将实施例3中制备得到尖端负载有raav9-hsyn::chr2-mcherry病毒的多功能复合电极埋植于小鼠的m2脑区(坐标，前后+1.00mm；左右+0.50mm；上下-1.00mm)并进行行为学测试。具体操作如下：

在电极植入手术2周后，每天将小鼠放置于矿场试验箱中让其自由活动以适应行为学测试环境，在手术4周后对上述埋植了多功能复合电极的小鼠进行行为学测试：

将光纤接口与激光器接口相连，让小鼠适应环境十分钟后，打开激光器进行测试，同时用行为学测试软件记录小鼠的运动轨迹。每次测试为一个off-on-off循环，包括1min无光、1min光刺激、1min无光。光刺激参数为激光能量20mw/mm²，频率30hz，脉冲宽度15ms。

图16为小鼠矿场实验测试得到的运动轨迹图，其中虚线表示小鼠在没有光刺激时的运动轨迹，空心圆圈和实心圆分别代表无光刺激时的运动起点和终点，实线表示小鼠在有光刺激情况下的运动轨迹，空心三角形和实心三角形分别代表给光时的起点和终点。实验结果显示，当没有光刺激时，小鼠沿着矿场试验箱壁无规律行走；当加入光刺激之后，小鼠逆时针转圈行走，这与之前报道的关于m2区光遗传行为学的研究结果一致，证明了所述复合神经电极负载的病毒能够实现对脑区功能的调控。

综上所述，本发明提供的多功能复合神经电极，能够实现对小鼠大脑特定脑区特定神经元的转染或治疗，并对光刺激下小鼠大脑中神经元活动进行长期记录，因此能够同时实现神经元转染治疗、光/电调控和同步记录多种功能，且所述复合神经电极植入脑部易于操作，一步手术即可实现药物的定点输送以及刺激元件埋置，因此，所述多功能复合神经电极在研究神经网络之间的交互以及治疗神经系统类疾病等方面具有较好的应用前景。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。