一种治疗炎症性肠病及其他肠道疾病的口服MSCs充液胶囊的制作方法

本发明涉及肠道疾病治疗药物领域，具体涉及一种治疗炎症性肠病及其他肠道疾病的口服mscs充液胶囊。

背景技术：

间充质干细胞mscs是一种多能性干细胞，具有免疫调节和抗炎功能。近年来，大量的研究表明，间充质干细胞(mscs)具有治疗多种炎症性疾病的临床潜能，如复杂性肛瘘和炎症性肠病等。据报道，mscs移植后可归巢到受损的炎症肠道部位，可有效缓解结肠炎症的病程。因此mscs移植的方式是决定其治疗效果的首要因素。

传统的静脉注射mscs的给药方式主要障碍是肺部的首过效应导致归巢效率低，存在剂量需求量大及治疗差异性等问题；直肠给药不仅操作较为复杂，且大量的肠道内容物会降低细胞的存活率，此外运送部位局限于直肠和降结肠，无法到达横结肠、升结肠等主要溃疡病灶区，影响mscs疗效的发挥。口服结肠靶向给药可保护药物在结肠部分靶向释放，充分提高药物疗效，降低剂量和减少药物对人体的负作用等功效，是较为理想的给药途径。目前已上市或进入临床研究的药物多以药用明胶和包衣材料的胶囊包裹，例如柳氮磺吡啶结肠溶胶囊和肠胃宁胶囊等。

因此，在本发明中，我们将mscs微球混合在水凝胶培养液中，通过传统软胶囊工艺或3d打印技术将其封装于具有细胞保护功能的结肠溶软胶囊，口服后使mscs到达结肠部位后开始释放，起到缓释和结肠定位的双重作用。mscs充液口服胶囊给药简便易行，安全有效，提高了治疗效率，口服mscs充液胶囊在自身免疫或炎症等临床前期研究中的成功应用为临床试验开辟了道路。对于开发口服安全性、可行性和有效性。因此针对口服mscs的治疗研究更有应用前景和可行性，值得关注。

技术实现要素：

为了解决传统mscs治疗慢性肠道疾病归巢率低、输注剂量大、治疗效果不稳定等缺点，本发明提供了一种口服mscs充液仿生胶囊及其在结肠炎治疗中的应用。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种口服mscs充液胶囊，包括三层结构的胶囊外壳和胶囊内容物，所述的胶囊外壳从内到外依次为中和胃酸的碳酸钙涂层、水溶性的明胶-羟丙基甲基纤维素凝胶和尤特奇s100包衣涂层，所述的胶囊内容物为混悬于海藻酸钠水凝胶培养液中的mscs微球；其制备方法包括以下步骤：

(1)软胶囊外壳的制备：

碳酸钙溶液的配制：称取一定量的碳酸钙加入到双蒸水中分散，室温充分溶解；

明胶-羟丙基甲基纤维素凝胶的配制：分别称取一定量的明胶和羟丙基甲基纤维素，各自加入适量的双蒸水中，充分溶解；冷却至室温后将二者按照一定比例混合，充分搅拌直至均匀，放入冰箱冷藏，使其形成均一的混合凝胶；最终混合凝胶中明胶和羟丙基甲基纤维素的总浓度为0.5～10％，其中明胶浓度为0.05-5.0％；

尤特奇s100包衣液的配制：配制1-3％w/v的eudragits100的乙醇溶液；

(2)负载mscs微球海藻酸钠水凝胶的制备：

将脐带间充质干细胞mscs按一定密度均匀混合于海藻酸钠水凝胶中，再通过电喷微流控技术，在高电压的作用下将混合溶液喷射到氯化钙溶液中，获得包裹细胞的微凝胶液滴，微球大小可通过电压和流速进行调控；

(3)3d打印制备mscs口服胶囊：

采集软胶囊的生物信息，输入计算机进行仿生建模，将预调量的三层软胶囊外壳与负载mscs微球海藻酸钠水凝胶分别加载于准备好的挤压式3d打印料仓，设置打印参数后进行3d打印，打印成型的充液胶囊在仿生培养液中进行连续循环灌注培养，实现打印充液胶囊的预成熟。

步骤(1)中的碳酸钙室温溶解20min～40min，碳酸钙的浓度为5～30％w/v；明胶和羟丙基甲基纤维素各自加入适量的双蒸水中，反应温度80℃，搅拌时间1～4h充分溶解，二者的水溶液混合后放入4℃冰箱保持24小时以上，使形成均一的混合凝胶。

步骤(1)中，所述的羟丙基甲基纤维素的粘度为100～10000mpa.s；所述的eudragits100成分为甲基丙烯酸酯：甲基丙烯酸质量比＝1:2。

所述脐带间充质干细胞mscs选自人脐带间充质干细胞第2～4代，接种细胞密度为10⁶个/ml。

电喷微流控技术的电喷参数设置为：电压为5kv，流速为30μl/min。

所述海藻酸钠水凝胶培养液使用f12/dmem完全培养液配制而成。

所述微流控电喷技术制备的负载mscs的海藻酸钠微球尺寸为143±5.2μm，且混悬于1％w/v的海藻酸钠水凝胶中。

步骤(3)通过repetierhostv1.0.5软件用3d打印机打印；仿生培养液为含有f12/dmem+10％胎牛血清+抗生素的mscs培养基。

本发明还保护所述的口服mscs充液胶囊在作为治疗肠道疾病的药物中的应用。

所述肠道疾病包括炎症性肠病。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1)本发明以首先分析结肠口服给药系统特征，结合生物材料性质，通过高精度生物3d打印技术，构建出负载mscs的充液口服微胶囊，实现mscs口服递送到结肠部位，缓解肠道疾病的作用。方法简单，操作方便。

2)本发明通过四层结构精确3d打印技术，精准调控充液胶囊各层结构的参数，高度优化了软胶囊外壳各层的结构特征，突出各层的功能，解决了传统软胶囊工艺中涂层厚度不均一、结构简单、差异性较大的问题。本发明提出了多层结构打印软胶囊包裹mscs内容物，形成具有抗酸、抗消化功能(防胃酸和消化液渗透到细胞层)以及结肠定位释放的口服充液胶囊。

3)本发明解决了口服mscs在消化道长期存活的问题。由于软胶囊壳的最外层为结肠溶材料，口服后因外层肠溶胶囊不在胃和小肠内溶解，保护胶囊不被胃肠蛋白酶降解。中间层为水溶性胶囊，起到隔离内容物与消化道接触的作用。最内层为碳酸钙层，中和渗入的氢离子，起到缓冲胃酸影响细胞活性的作用。胶囊完整通过胃和小肠，进入结肠肠道后，外层尤特奇s100包衣首先溶解，然后依次次外层水溶性胶囊崩裂释放，释放出含mscs微球和海藻酸钠水凝胶。在易黏附于肠道的水凝胶保护下，实现了微球中的mscs长时间通过旁分泌发挥抗炎和免疫调节作用，缓解结肠相关疾病症状，实用性强。

4)本发明提供了一种mscs口服给药途径及其相关医学应用，缓解了细胞类口服胶囊在消化道被蛋白酶和酸破坏的问题，同时确保了mscs在结肠肠道内长时间存活并稳定发挥生物功能，使mscs及其他细胞口服胶囊可以在体内达到治疗最小细胞量。

附图说明

图1为本发明的mscs口服充液胶囊的结构示意图；其中1为碳酸钙涂层，2为eudragits100包衣材料层，3为水溶性胶囊，4为海藻酸钠微球，5为mscs,6海藻酸盐水凝胶。

图2为mscs口服充液胶囊对dss诱导的小鼠炎症性疾病的结肠照片。

图3为mscs口服充液胶囊治疗dss诱导的小鼠结肠h&e病理图片。

图4为mscs口服充液胶囊对tnbs诱导的小鼠炎症性疾病的疗效考核，其中，图a为mscs口服充液胶囊对tnbs诱导的小鼠体重曲线变化，图b为mscs口服充液胶囊对tnbs诱导的疾病活动指数的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种口服mscs充液胶囊，包括三层结构的胶囊外壳和胶囊内容物，所述的胶囊外壳从内到外依次是中和胃酸的碳酸钙涂层、水溶性的明胶-羟丙基甲基纤维素凝胶和尤特奇s100包衣涂层，所述的胶囊内容物为混悬于海藻酸钠水凝胶培养液中的mscs微球；其制备方法包括以下步骤：

(1)软胶囊外壳的制备：

碳酸钙溶液的配制：称取一定量的碳酸钙加入到双蒸水中分散，室温充分溶解；

明胶-羟丙基甲基纤维素凝胶的配制：分别称取一定量的明胶和羟丙基甲基纤维素，各自加入适量的双蒸水中，充分溶解；冷却至室温后将二者按照一定比例混合，充分搅拌直至均匀，放入冰箱冷藏，使其形成均一的混合凝胶；最终混合凝胶中明胶和羟丙基甲基纤维素的总浓度为2％，其中明胶浓度为4％；

尤特奇s100包衣液的配制：配制2％w/v的eudragits100的乙醇溶液；

(2)负载mscs微球海藻酸钠水凝胶的制备：

将脐带间充质干细胞mscs按一定密度均匀混合于海藻酸钠溶液中，再通过电喷微流控技术，在高电压的作用下将混合溶液喷射到氯化钙溶液中，获得包裹细胞的微凝胶液滴，微球大小可通过电压和流速进行调控；将包裹mscs的微球混悬于海藻酸钠水凝胶中；

(3)3d打印制备mscs口服胶囊

采集软胶囊的生物信息，输入计算机进行仿生建模，将预调量的三层软胶囊外壳与细胞微球分别加载于准备好的挤压式3d打印料仓，设置打印参数后进行3d打印，打印成型的充液胶囊在仿生培养液中进行连续循环灌注培养，实现打印充液胶囊的预成熟；通过repetierhostv1.0.5软件用3d打印机打印。

步骤(1)中碳酸钙室温溶解40min，碳酸钙的浓度为10％w/v；明胶和羟丙基甲基纤维素各自加入适量的双蒸水中，反应温度80℃，搅拌时间1～4h使其充分溶解，混合后放入4℃冰箱保持24小时以上，形成均一的混合凝胶。所述的羟丙基甲基纤维素的粘度为4000mpa.s；所述的eudragits100成分为甲基丙烯酸酯：甲基丙烯酸＝1:2。

所述脐带间充质干细胞mscs选自人脐带间充质干细胞第2～4代，接种细胞密度为10⁶个/ml。电喷微流控技术的电喷参数设置为：电压为5kv，流速为30μl/min。所述海藻酸钠水凝胶培养液使用f12/dmem完全培养液配制而成。所述微流控电喷技术制备的负载mscs的海藻酸钠微球尺寸为143±5.2μm，且混悬于1％w/v海藻酸钠水凝胶中。

实施例2

一种口服mscs充液胶囊，包括三层结构的胶囊外壳和胶囊内容物，所述的胶囊外壳从内到外依次是中和胃酸的碳酸钙涂层、水溶性的明胶-羟丙基甲基纤维素凝胶和尤特奇s100包衣涂层，所述的胶囊内容物为混悬于海藻酸钠水凝胶培养液中的mscs微球；其制备方法包括以下步骤：

(1)软胶囊外壳的制备步骤：

碳酸钙溶液的配制：称取一定量的碳酸钙加入到双蒸水中分散，室温充分溶解；

明胶-羟丙基甲基纤维素凝胶的配制：分别称取一定量的明胶和羟丙基甲基纤维素，各自加入适量的双蒸水中，充分溶解；冷却至室温后将二者按照一定比例混合，充分搅拌直至均匀，放入冰箱冷藏，使其形成均一的混合凝胶；最终混合凝胶中明胶和羟丙基甲基纤维素的总浓度为5％，其中明胶浓度为2％；

尤特奇s100包衣液的配制：配制2％w/v的eudragits100的乙醇溶液；

(2)负载mscs微球海藻酸钠水凝胶的制备：

将脐带间充质干细胞mscs按一定密度均匀混合于海藻酸钠溶液中，再通过电喷微流控技术，在高电压的作用下将混合溶液喷射到氯化钙溶液中，获得包裹细胞的微凝胶液滴，微球大小可通过电压和流速进行调控；将包裹mscs的微球混悬于海藻酸钠水凝胶中；

(3)3d打印制备mscs口服胶囊

采集软胶囊的生物信息，输入计算机进行仿生建模，将预调量的三层软胶囊外壳与细胞微球分别加载于准备好的挤压式3d打印料仓，设置打印参数后进行3d打印，打印成型的充液胶囊在仿生培养液中进行连续循环灌注培养，实现打印充液胶囊的预成熟；通过repetierhostv1.0.5软件用3d打印机打印。

步骤(1)中的碳酸钙室温溶解20min～40min，碳酸钙的浓度为5～30％w/v；明胶和羟丙基甲基纤维素各自加入适量的双蒸水中，反应温度80℃，搅拌时间1～4h使其充分溶解，混合后放入4℃冰箱保持24小时以上，形成均一的混合凝胶。所述的羟丙基甲基纤维素的粘度为1000mpa.s；所述的eudragits100成分为甲基丙烯酸酯：甲基丙烯酸＝1:2。

所述脐带间充质干细胞mscs选自人脐带间充质干细胞第2～4代，接种细胞密度为10⁶个/ml。电喷微流控技术的电喷参数设置为：电压为6kv，流速为50μl/min。所述海藻酸钠水凝胶培养液使用f12/dmem完全培养液配制而成。所述微流控电喷技术制备的负载mscs的海藻酸钠微球尺寸为123±6.1μm，且混悬于1％w/v海藻酸钠水凝胶中。

实施例3

一种口服mscs充液胶囊，包括三层结构的胶囊外壳和胶囊内容物，所述的胶囊外壳从内到外依次是中和胃酸的碳酸钙涂层、水溶性的明胶-羟丙基甲基纤维素凝胶和尤特奇s100包衣涂层，所述的胶囊内容物为混悬于海藻酸钠水凝胶培养液中的mscs微球；其制备方法包括以下步骤：

(1)软胶囊外壳的制备步骤：

碳酸钙溶液的配制：称取一定量的碳酸钙加入到双蒸水中分散，室温充分溶解；

明胶-羟丙基甲基纤维素凝胶的配制：分别称取一定量的明胶和羟丙基甲基纤维素，各自加入适量的双蒸水中，充分溶解；冷却至室温后将二者按照一定比例混合，充分搅拌直至均匀，放入冰箱冷藏，使其形成均一的混合凝胶；最终混合凝胶中明胶和羟丙基甲基纤维素的总浓度为6％，其中明胶浓度为2％；

尤特奇s100包衣液的配制：配制3％w/v的eudragits100的乙醇溶液；

(2)负载mscs微球海藻酸钠水凝胶的制备：

将脐带间充质干细胞mscs按一定密度均匀混合于海藻酸钠溶液中，再通过电喷微流控技术，在高电压的作用下将混合溶液喷射到氯化钙溶液中，获得包裹细胞的微凝胶液滴，微球大小可通过电压和流速进行调控；将包裹mscs的微球混悬于海藻酸钠水凝胶中；

(3)3d打印制备mscs口服胶囊

采集软胶囊的生物信息，输入计算机进行仿生建模，将预调量的三层软胶囊外壳与细胞微球分别加载于准备好的挤压式3d打印料仓，设置打印参数后进行3d打印，打印成型的充液胶囊在仿生培养液中进行连续循环灌注培养，实现打印充液胶囊的预成熟；通过repetierhostv1.0.5软件用3d打印机打印。

步骤(1)中的碳酸钙室温溶解40min，碳酸钙的浓度为20％w/v；明胶和羟丙基甲基纤维素各自加入适量的双蒸水中，反应温度80℃，搅拌时间1～4h使其充分溶解，混合后放入4℃冰箱保持24小时以上，形成均一的混合凝胶。所述的羟丙基甲基纤维素的粘度为1000mpa.s；所述的eudragits100成分为甲基丙烯酸酯：甲基丙烯酸＝1:2。

所述脐带间充质干细胞mscs选自人脐带间充质干细胞第2～4代，接种细胞密度为10⁶个/ml。电喷微流控技术的电喷参数设置为：电压为7kv，流速为50μl/min。所述海藻酸钠水凝胶培养液使用f12/dmem完全培养液配制而成。所述微流控电喷技术制备的负载mscs的海藻酸钠微球尺寸为101±3.7μm，且混悬于1％w/v海藻酸钠水凝胶中。

实施例4

口服mscs充液胶囊在dss诱导的肠炎模型的治疗应用：

本项发明采取口服mscs充液胶囊灌胃给药方式给予合适的剂量。该胶囊的有效量是能导致dss肠炎疾病症状明显降低的量。

a.c57bl/6雄性小鼠给予3％的dss饮用水，治疗组给予不同剂量的预先制备好的mscs充液胶囊通过灌胃给药的方式输入小鼠胃中。

b.dss模型中均为一周连续给药，灌胃后每天观察小鼠毛发状况，粪便性状，称量小鼠体重，并详细记录。

c.当结肠炎症最严重时，处死各组小鼠。取结肠组织，观察拍照后，部分结肠固定包埋用于h&e染色等病理学分析。

设立正常对照组，肠炎模型组给予dss自由饮水，治疗组在造模第1、3、5天灌胃胶囊。8天后处死小鼠取结肠，拍照结果如图2，从图2可以看出，对照小鼠结肠长度较长，无红肿现象，无明显其他炎症症状。dss组炎症症状明显，有红肿，结肠变短的现象。mscs悬液组的炎症症状存在，与模型组无明显差异，可能是由于未受保护mscs在胃酸和消化液里失活。mscs胶囊组与正常相似，无明显红肿现象。由此可见mscs胶囊经口服确有缓解dss诱导的小鼠结肠炎症的作用。mscs充液胶囊的治疗h&e染色图片见图3。我们可以发现，相比于dss模型组和mscs组，胶囊治疗组中仅见少量炎症细胞浸润，结肠结构较为完整，由此可见mscs充液胶囊的治疗可以有效缓解dss诱导的肠道炎症。

实施例4

口服mscs充液胶囊在小鼠tnbs诱导溃疡性炎结肠炎的治疗应用：

本项发明采取mscs充液胶囊灌胃给药方式给予合适的剂量。该试剂的有效量是能导致炎症性肠病症状明显降低的量。

本发明所述的mscs充液胶囊在tnbs肠炎模型治疗中的应用：

a.balb/c小鼠禁食24小时，灌胃给药tnbs溶液。

b.tnbs小鼠模型建立12小时后，将预先制备好的mscs充液胶囊通过灌胃给药的方式注入小鼠结肠内。

c.造模后每天称量小鼠体重，观察小鼠是否腹泻，便血，粪便性状等，记录疾病活动度评分(dai)，dai评分＝(体重丢失积分+粪便连续积分+隐血肉眼血积分)/3。

mscs胶囊治疗tnbs结肠炎的效果见图4。通过对小鼠每日体重进行统计，分析体重变化曲线(见图4a)，mscs胶囊能够有效减缓tnbs诱导小鼠体重下降的趋势。tnbs灌肠后，模型小鼠出现腹泻，体重明显降低，存在便血等症状，疾病活动度评分可以综合上述指标评价小鼠结肠炎的疾病严重程度。mscs充液胶囊在所用剂量下对小鼠tnbs模型有良好的保护作用，与空白对照组比较对疾病活动度有较好的抑制率，dia指数明显低于模型对照组。评分结果见图4b。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。