本发明涉及一种复方中兽药制剂涉及治疗猪禽腹泻的中兽药配方，具体涉及一种用于治疗猪禽腹泻的复方中兽药口服制剂及其制备方法。
背景技术：
致病性大肠杆菌引起仔猪黄痢、白痢及水肿病。这三种病在规模化猪场的发病率和死亡率都较高，同时近年来其流行趋势、临床症状和病理变化呈现多样性，给养猪业带来了巨大的经济损失。大肠杆菌的血清型繁多，目前没有理想的疫苗来预防，对其治疗多采用有效的抗菌药物，但在养殖环节中由于滥用抗生素不仅导致耐药菌株的传播扩散，还会引起残留、环境污染，对养殖业及人类的健康构成越来越严重的危害。研究开发中兽药可解决药物残留问题，且中兽药可部分或全部恢复大肠杆菌对抗生素的敏感性，缓解耐药基因的扩散和转移。“无抗化”是大势所趋，养殖业、兽药兽医行业必须适应趋势的发展，以中兽药制剂来替代或部分替代抗生素药物，因此寻找一种具有抗菌、止泻作用的中兽药制剂治疗仔猪腹泻至关重要。
但是目前许多中兽药及饲料添加剂多为经过简单加工的中草药混合物，用量大、起效慢，产品粗糙，很难适应畜牧业规模化、集约化发展的需要。我国中兽药要想在激烈竞争的国际市场上占有一席之地,必须有自主知识产权的产品，利用现代科技对中兽药进行开发、应用科技手段代替传统工艺,提高产品质量是目前紧迫的任务。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一款效果好，起效快，用量少的用于治疗畜禽腹泻的复方中兽药及其制备方法，该中兽药通过合理的配方，达到见效快，提高疗效作用,同时通过先进的提取方法可最大限度提取有效成分，减少制剂中杂质，有效节约药材资源。
为实现上这目的，本发明通过以下技术方案来实现：
一种用于治疗猪禽腹泻的复方中兽药口服制剂，该中兽药口服制剂包括以下重量份配比的中药材：凤尾草5-10份、醋五味子5-10份、石榴皮5-10份、连翘5-10份、乌梅5-10份、甘草5-10份。
进一步地，该中兽药口服制剂包括以下重量份配比的中药材：凤尾草5份、醋五味子5份、石榴皮5份、连翘10份、甘草10份、乌梅5份。
进一步地，该中兽药口服制剂包括以下重量份配比的中药材：凤尾草6份、醋五味子10份、石榴皮6份、连翘6份、甘草6份、乌梅6份。
进一步地，该中兽药口服制剂包括以下重量份配比的中药材：凤尾草9份、醋五味子5份、石榴皮5份、连翘5份、甘草5份、乌梅7份。
进一步地，该中兽药口服制剂包括以下重量份配比的中药材：凤尾草10份、醋五味子5份、石榴皮10份、连翘5份、甘草5份、乌梅10份。
优选的，该口服制剂为以汤剂或颗粒剂。
用于制备上述用于治疗猪禽腹泻的复方中兽药口服制剂的汤剂制备方法，具体包括以下步骤：取各中药粉碎后混合，按料液比1︰20加入70％乙醇浸泡0.5小时，回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，继续浓缩至浓度为1g／ml药液，加入苯甲酸钠，搅拌溶解即得。
用于制备上述用于治疗猪禽腹泻的复方中兽药口服制剂的颗粒剂制备方法，具体包括以下步骤：将中药原料粉碎，按料液比1：20加入70％乙醇浸泡0.5小时，回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，继续浓缩至浓度为1g／ml药液，喷雾干燥为药物粉末制作颗粒即得。
用于治疗猪禽腹泻的复方中兽药口服制剂的使用方法为：以上所述配方以汤剂或制备成颗粒剂，每日2次，3天为一个疗程。
本发明的各中药组份药性、药理如下：
凤尾草又名井口边草，为凤尾蕨科植物凤尾草的全株，味甘、淡，微苦，性寒。归心、肝、大肠经。功效清热利湿、凉血止血、消肿解毒。本品对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌、痢疾杆菌、沙门氏菌等杆菌有抑制作用。
醋五味子酸甘温，归肺，心、肾经。功效包括收敛固涩，益气生津，补肾宁心。主要用于久泻不止，久嗽虚喘等症的治疗。
石榴皮性温、味酸、涩，归大肠经，具有涩肠止泻，止血，驱虫之功效。
连翘性味苦，微寒，归肺、心、小肠经。连翘有广谱抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、贺氏痢疾杆菌有很强的抑制作用，还有抗真菌、抗病毒及抗炎解热的作用；能显著拮抗内毒素所致的炎症、发热、肿痛等。
甘草性味甘，平，归心、肺、脾、胃经，补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药。
乌梅来源于蔷薇科植物梅的干燥近成熟果实，属于收涩药。性味酸、涩、平，归肝、脾、肺、大肠经。功能主治为敛肺、涩肠、生津、安蛔。
本处方的主要功效是广谱抗菌、涩肠止泻、解毒、利湿，通过结合上述各药材的药效及恰到好处用量，可充分发挥各组份的作用，使个药材之间的配伍能够最大程度的发挥药效。
本发明的有益效果：
该复方制剂为纯中药制剂，长期使用不会产生耐药性，畜禽体内不易产生药物残留。经试验表明可有效抑制蓖麻油所致腹泻的发病时间及减轻腹泻程度，对大肠杆菌引起的腹泻有明显治疗效果，同时具有抗菌效果好、起效快，用量少、有效率高、治愈率高的优点。
具体实施方式
下面结合试验及临床效果对本发明的复方中兽药口服制剂作进一步说明。
实施例1：
本发明复方中兽药口服制剂对蓖麻油所致的实验性腹泻的疗效实验：
1.1材料与方法
1.1.1复方中兽药口服制剂的制备：
复方制剂1组：凤尾草9份、醋五味子5份、石榴皮5份、连翘5份、乌梅7份、甘草5份；
复方制剂2组：凤尾草5份、醋五味子5份、石榴皮5份、连翘10份、乌梅5份、甘草10份；
复方制剂3组：凤尾草10份、醋五味子5份、石榴皮10份、连翘5份、乌梅10份、甘草5份；
分别准确称好各组中药粉末，用滤纸分包成长条形，70%乙醇溶液、1:20的料液比，先浸泡30min后，50℃下乙醇回流提取2次，每次1h，合并两次滤液，60℃旋转蒸发至浓度为1g/ml。
1.1.2凤尾草单药提取物的制备：
准确称取凤尾草粉末20g，用滤纸分包成长条形，70%乙醇溶液、1:20的料液比，先浸泡30min后，50℃下乙醇回流提取2次，每次1h，合并两次滤液。60℃旋转蒸发至浓度为1g生药/ml。吸取部分1g/ml的提取液用蒸馏水稀释2倍得0.5g生药/ml作为高剂量组灌胃的药液（凤尾草乙醇提取物高剂量组的剂量为5g/kg即0.1ml/10g），吸取部分1g/ml的提取液用蒸馏水稀释4倍得0.25g/ml作为低剂量组灌胃的药液（凤尾草乙醇提取物低剂量组的剂量为2.5g/kg,即0.1ml/10g）。
1.1.3、试验动物分组及给药
昆明小鼠（spf级），雌雄各半，18-22g，购于江西中医药大学实验动物中心。
取健康小鼠70只，体重18～22g，雌雄各半，随机分为正常对照组、模型组、复方1、2、3组、凤尾草单药高、低剂量组共七组，每组各10只，雌雄各5只，雌雄分笼饲养，做好标记（分别以左上/右上/左下/右下/尾/不标记进行区分）。正常对照组和模型组小鼠按0.1ml/10g灌胃生理盐水，复方凤尾草各组按5g/kg以0.1ml/10g灌胃稀释好的复方药液，凤尾草乙醇提取物高剂量组、低剂量组分别以0.1ml/10g灌胃稀释好的高、低剂量组的药，连续给药3d，每次给药前、后均各禁食禁水2h，末次给药后30min，除正常对照组给予同体积生理盐水外，各组均以0.2ml/只灌胃蓖麻油。
将小鼠反罩在烧杯下面，烧杯下铺滤纸片，观察6h，每隔1h换滤纸一次。观察腹泻小鼠一般状态和行为学改变。观察各组小鼠精神状态、行为及大便的变化。试验中所得数据应用spss17.0做数据处理（本报告取前3h数据做统计分析），进行组间独立样本t检验，以`x±s表示。
1.2观察指标
以滤纸上每粒或每堆（指不能分清粒数者）粪便为排便一次；干便不黏连成颗粒状；稀便多不成形，含水量大，内有黏性液体。
每小时腹泻发生率：每组小鼠每小时内的腹泻只数与该组小鼠总只数之比。
总腹泻率：每组小鼠在观察时间内腹泻只数与该组小鼠总只数之比。
稀便率：每只小鼠排稀便次数与总排便次数之比。
稀便级：表示每只小鼠排稀便的程度，以稀便污染滤纸形成的污迹面积直径(cm)大小定级，分为四级：直径<lcm为l级，1.0~1.9cm为2级，2~3cm为3级，>3cm为4级。污迹为较规则圆形的测其直径；不规则形状则测量其最长和近似圆的直径，两数相加除以2。
平均稀便级：统计时先逐个测量每只小鼠每一堆稀便的级数，然后将该鼠所有稀便级数相加，除以排稀便次数得每只小鼠稀便的平均级数，平均稀便级=稀便级数之和／稀便次数。
稀便抑制率=模型组每小时的平均稀便数－其余组每小时的平均稀便数）/模型组每小时的平均稀便数×100%
1.3试验结果与分析
除正常对照组外，各组灌胃蓖麻油一段时间后，均表现出一定程度的腹泻状况，腹泻小鼠表现为精神沉郁，倦怠乏力，毛发粗糙，眼周围有分泌物，不易睁开，排稀便次数有所增加，粪便较正常小鼠粪便偏黄褐色，无固定形状，粪便含水量增加，内有粘稠性液体，固体内容物较少，表明模型建立成功。
0～3h内每小时的稀便数：除正常对照组外，各组灌胃蓖麻油后均出现拉稀便。模型组在0~3h内拉稀程度随着时间而加重，凤尾草高、低剂量组在0~1h稀便数量与模型组相当，在1~2h比模型组严重，但在2~3h稀便数远低于模型组，说明单药凤尾草的止泻起效时间在灌胃蓖麻油2h后；复方1组在灌胃蓖麻油0~2h内无稀便，在2~3h内才开始出现稀便，但稀便数远低于模型组；复方2组、复方3组开始腹泻时间在灌胃蓖麻油1h后，稀便数量也比模型组明显减少，说明复方三个组均能明显延迟小鼠首次腹泻的时间。
每小时的腹泻发生率：凤尾草高剂量组0~3h内的腹泻发生率均比模型组降低，复方凤尾草三个组0~3h内的腹泻发生率均比模型组显著降低（p<0.05）；
3h总腹泻率：凤尾草高、低剂量组、复方三个组3h的总腹泻率均比模型组下降，其中模型组3h总腹泻率为90%（9/10），凤尾草高剂量组为40%（4/10），复方1组、复方3组均为20%（2/10）、复方2组为30%（3/10），可见复方三个组均可极大降低腹泻的发生率。
凤尾草高剂量组、复方三个组的0～3h平均稀便级与模型组相比极显著降低（p<0.01）；复方三个组平均稀便率与模型组有显著差异（p<0.05）；复方1、2、3组的稀便抑制率分别为74.36%、56.41、71.79%。具体见表1。
表1复方凤尾草对蓖麻油所致小鼠腹泻的影响（n=10，`x±s）
注：与模型组相比，“a”表示差异显著（p<0.05），”a”表示极显著差异（p<0.01）
蓖麻油是复制小鼠腹泻模型的常用药物，常用于研究中药抗腹泻机理。蓖麻油属于刺激性泻药，是能够刺激小肠黏膜的致泻剂。蓖麻油于小肠上部被脂肪水解酶水解成蓖麻醇酸，肠道平滑肌被水解产生的蓖麻醇酸刺激，而损害肠粘膜细胞并引起炎症，使得肠蠕动加快，抑制了水和电解质的吸收，进而出现渗出性的腹泻。
综上，蓖麻油致小鼠腹泻模型试验表明，单药凤尾草高剂量组、复方凤尾草三个组均有较好的止泻作用，复方三个组与单药凤尾草相比，复方组的止泻效果更好。
实施例2
本发明复方中兽药口服制剂对几种畜禽常见致病菌的体外抗菌活性
2.1材料
同1.1.1
各组药材粉碎后备用。药材购于江西省南昌市益丰大药房。
大肠杆菌atcc25922菌株，购于广东微生物菌种保藏中心。
大肠杆菌k88、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌菌株，江西农业大学动科院动物药学实验室保存。
2.2方法
2.2.1凤尾草复方的制备
取1.1.1提取复方凤尾草制剂，旋转蒸发器进行浓缩，回收乙醇，温度控制在60℃，浓缩为膏状物，称重。用20%二甲基亚砜2ml溶解膏状物，再用8ml灭菌双重水稀释定容，过滤除菌，4℃冰箱保存。各组复方提取物药液的浓度见表2。
2.2.2菌液制备
将甘油保存的各菌分别种于lb肉汤内，37℃、220r/min条件下培养至对数生长期，后在普通营养琼脂上划线，于生化培养箱内37℃培养18h。用勾菌环从普通琼脂平板上选择3～5个生长良好，大小均一的菌落，接种于lb肉汤中，37℃条件下培养12h。平板活菌计数法计算菌液浓度，临用前用肉汤将细菌的浓度调制1.5×106cfu/ml，于冰箱4℃冷藏备用。
2.2.3复方凤尾草对5种常见致病菌的最小抑菌浓度测定
参照clsi推荐的微量二倍稀释法测定，准备无菌的96孔板，将每一孔加入100μlmh肉汤，在每一排的第一孔分别加入复方凤尾草药液100μl，移液枪吹打混匀后，从第一孔吸出100μl至第二孔，再吹打混匀，以此类推，重复以上操作，依次向后面孔进行微量二倍稀释，直至第十二孔弃去100μl；试验孔每孔加入50ul浓度为1.5×106cfu/ml的菌液，使得96孔板中每孔中细菌的终浓度为5×105cfu/ml；每个菌做三组重复。另设普通lb肉汤为空白对照组，5×105cfu/ml的菌悬液为生长对照组，药物对照组是以普通lb肉汤加入复方凤尾草药液，按上述操作后37℃静置培养18h后肉眼观察结果。
2.3结果与分析
本发明复方中兽药口服制剂对5种常见致病菌的最小抑菌浓度的测定结果见表3。实验结果可见，三个复方凤尾草制剂对5种畜禽常见病原体都有非常好的抗菌活性。表现出广谱的抗菌活性。
实施例3
本发明复方中兽药口服制剂对小鼠大肠杆菌感染的保护试验
3.1材料
复方制剂1材料：选凤尾草9份、醋五味子5份、石榴皮5份、连翘5份、乌梅7份、甘草5份，粉碎后备用。
硫酸庆大霉素注射液，广州白云山天心制药股份有限公司，规格：每支4万单位/ml批号：20190218。
试验动物：昆明小鼠（spf级），雌雄各半，18-22g，购于江西中医药大学实验动物中心。
大肠杆菌k88菌株，江西农业大学兽药研究所保存。
3.2方法
3.2.1复方制剂1的制备
准确称取100g复方1粉末，粉末用滤纸包成长条形，以最佳提取工艺的条件，即乙醇浓度为70%，液料比为1:20，提取温度为50℃，在此条件下，用乙醇回流提取的方法，先浸泡30min，再提取两次，每次1h，合并两次次提取液，旋转蒸发器进行浓缩，回收乙醇，温度控制在60℃，浓缩至1g生药/ml的浓度（凤尾草复方1高剂量组给药浓度），同时吸出部分1g/ml的药液稀释2倍，使浓度为0.5g/ml（此浓度为凤尾草复方1低剂量组的给药浓度），冷冻保存，备用。
3.2.2大肠杆菌k88的菌液制备
将甘油保存的大肠杆菌k88接种于lb肉汤内，37℃、220r/min条件下培养至对数生长期，后在普通营养琼脂上划线，于生化培养箱内37℃培养18h。用勾菌环从普通琼脂平板上选择3～5个生长良好，大小均一的菌落，接种于lb肉汤中，37℃条件下培养12h。平板活菌计数法计算菌液浓度，用肉汤将细菌的浓度调制1.5×109cfu/ml，于冰箱4℃冷藏备用。
3.2.3大肠杆菌k88致小鼠腹泻模型的建立
昆明小鼠饲养1周，观察情况无异常。感染前禁食2h，除正常组外，其余组腹腔注射0.2ml大肠杆菌菌液，2h后正常饲喂。正常对照组处理的不同之处是把菌液改为生理盐水。感染后每隔3h观察1次，记录动物的发病情况。动物发病的定义：拉稀便；肛周黏附有稀便、黏液或血液；毛松，活动少；进食少或不进食，出现以上症状的任一项即为发病。
3.2.4凤尾草复方1制剂对小鼠实验性大肠杆感染的保护作用
取健康小鼠50只，雌雄各半，随机分为正常对照组、感染组、药物对照组、复方高、低剂量组，每组10只，雌雄各5只，雌雄分开饲养，做好标记。各组小鼠感染前禁食禁水2h，感染时除正常对照组外，每只小鼠以0.2ml/10g腹腔注射制备好的大肠杆菌菌液，注射完毕后，每组每只立即灌胃给药，正常对照组与模型组分别均以0.1ml/20g灌胃生理盐水，药物对照组以0.1ml/20g灌胃给庆大霉素注射液，复方组以0.1ml/20g灌胃稀释好高、低剂量组浓度的复方制剂1，每天同一时间给药，每天给药两次，两次间隔10h，每次给药前后禁食禁水2h，连续给药3天，观察一星期后处死小鼠。观察小鼠的精神状况，采食饮食是否正常，粪便是否正常，记录死亡情况并计算死亡率、保护率。
保护率=（模型组死亡数量-药物组死亡数量）/模型组死亡数量×100%
3.3结果与分析
攻毒后感染组小鼠毛发凌乱且无光泽、精神沉郁、反应迟缓、嗜睡、拒绝进食、拉稀、呼吸急促，部分小鼠抽搐死亡，并从死亡小鼠肝脏中分离到大肠杆菌，说明小鼠大肠杆菌性腹泻的模型建立成功。感染组24h中共死亡8只小鼠，具体死亡时间依次为：攻毒后6h死亡2只、12h~24h死亡6只。剖检死亡小鼠，肠道内有出血，肠内容物充盈，胃内充满气体及黄色粘液，肝脏部分发黑。
庆大霉素治疗组小鼠精神状态开始精神沉郁，嗜睡，但给药后6小时大多数小鼠精神开始好转，2天后大多数小鼠运动自如、食欲正常；复方制剂1高剂量组的小鼠开始精神沉郁、反应迟缓、嗜睡，但在给药8h后有小鼠开始进食，在给药2天后大多数小鼠精神恢复，反应较敏捷。复方制剂1高剂量组小鼠死亡率降低，对小鼠的保护率达75%。复方制剂1组低剂量组小鼠攻毒后感染组小鼠精神沉郁、反应迟缓、嗜睡，给药后少量小鼠症状减轻，有6只小鼠死亡。具体见表4。
实施例4
本发明复方中兽药口服制剂治疗仔猪腹泻的的临床疗效
4.1材料
凤尾草复方制剂制备：取1.1.1粉碎混合好的复方1、复方2、复方3粉末各2000g，提取方法同1.1.1，将各提取液滤液旋转蒸发仪浓缩至含生药1g/ml，加入6g苯甲酸钠，混匀，冷却，滤过分装即得。
硫酸庆大霉素注射液，同3.1
试验病猪
选择江西省定南县某猪场3～35日龄有腹泻症状的仔猪，品种为三元杂交白猪，经临床诊断和实验室细菌分离、生化鉴定诊断为大肠杆菌感染。仔猪尽量保证同圈舍的病猪4种药物都有使用。
4.2方法
4.2.1试验分组及治疗方案
将143头患猪随机分为4组。各组均按表5口服给药，2次／天，连用3天。各组均同一饲养管理条件下饲养。各组加适量电解多维和口服补液盐，防止机体脱水。每天观察记录各组猪精神状态和饮食情况，记录各组仔猪的死亡情况及各组给药后的疗效。
4.2.2判定标准
(1)治愈：用药3天后，停止排稀便，粪成型，采食、体温、精神恢复正常，停药一周内不复发。
(2)有效：治疗后患猪临床症状明显好转，用药3天后症状减轻，食欲、体温恢复正常；
(3)无效：治疗后患猪临床症状无明显改变，甚至死亡。
4.3结果与分析
四组猪通过3天的用药治疗，凤尾草复方制剂1组治疗的治愈率为97.4％，复方制剂2组治愈率93.3%，复方制剂3组治愈率为83.3%，庆大霉素组治愈率88.9%。复方制剂1组与复方制剂2组有效率均为100%，用药后的猪腹泻症状、腹泻次数都减轻，精神状态好转。见表5。
试验结果表明，复方制剂1、2、3组与庆大霉素组没有显著性差异(p＞0.05)，本发明的凤尾草复方制剂口服以1ml/kg体重灌服对仔猪自然感染大肠杆菌病治疗效果显著，有效率、治愈率与庆大霉素无显著差异,可作为临床推荐使用剂量。本发明的凤尾草复方制剂系纯中药制剂，长期使用不会产生耐药性，畜禽体内不易产生药物残留。试验研究已取得明显治疗效果，在部分养殖场使用后效果很好，因而大力开发这一产品对发展健康的养殖业有积极的促进作用，从而给养猪业健康快速发展提供了保障。通过中药提取物的应用，必将减少或延缓猪大肠杆菌耐药性。
综上，本发明复方中兽药口服制剂对几种常见病原体的体外抗菌活性强、抗菌谱广，对蓖麻油引起的腹泻有很强的止泻作用，对大肠杆菌引起的腹泻有很强的治疗和保护作用，该药在目前养殖业的“无抗化”背景下，能替代抗生素用于养殖业预防和治疗疾病具有广阔的应用前景。