一种小鼠子宫内膜损伤模型的构建方法及构建得到的模型与流程

本发明属于动物实验模型构建技术领域，具体涉及一种小鼠子宫内膜损伤模型的构建方法及构建得到的模型。

背景技术：

薄型子宫内膜和宫腔粘连是子宫内膜损伤的常见病症，对女性健康造成极大威胁且会造成妊娠失败。妊娠早期的扩张刮除术是造成薄型子宫/宫颈粘连的常见原因。当前主要通过建立子宫内膜损伤模型的方法来对宫腔粘连/薄型子宫内膜进行研究。常见的用于构建子宫内膜损伤模型的动物主要有兔子、大鼠和小鼠。但由于小鼠手术操作难度较大，一般选用大鼠构建子宫内膜损伤模型。

现有技术中的子宫内膜损伤大致可分为三种：子宫全层损伤模型、子宫缺血模型和子宫内膜化学损伤模型。

子宫全层损伤模型的制备方法为：sd大鼠术前禁食1晚，10％戊巴比妥钠按5ml/kg腹腔注射麻醉后固定大鼠。剃去下腹部毛发，碘伏棉球消毒。在动物实验中心超净台中于耻骨联合上端2～3cm处挑起外层皮肤，剪刀纵向剪开腹壁皮肤2cm，逐层切开腹层黏膜、肌肉组织，进入腹腔，缓慢挑出大鼠的y型子宫(双子宫、双宫颈、单阴道，两侧宫角互不相通)，于左侧子宫造模(iua—l组)，眼科剪于子宫中段正中央纵向剪开子宫壁，尽量全部剪开(大鼠子宫全长3～4cm)，眼科剪沿着子宫内膜慢慢剪，彻底去除子宫内膜全层，手术过程中无菌纱布随时止血，保证视野清晰，深度控制在子宫组织浅肌层至深肌层，以确保子宫浆膜面的完整性。子宫内膜切除完成后，7-0显微无菌手术缝线间断缝合子宫，清除血液，右侧子宫作自身对照(iua-r组)。sham假手术组左侧子宫(sham—l组)仅切开再缝合，右侧子宫(sham—r组)不做处理。手术完成后，将子宫还纳至腹腔，清洗腹腔，4-0手术缝线关腹。7天和28天后分别处死各组大鼠，子宫取样，4％多聚甲醛固定组织，48h内石蜡包埋、切片。该造模方法可以使子宫全层损伤的子宫内膜薄弱，但仅手术区域的子宫内膜偏薄，与临床上人的子宫内膜整体偏薄的情况不同，此造模方法将局部子宫内膜及肌层同时损伤，很难做到大鼠整体的内膜偏薄。

子宫缺血模型的具体造模方法为：麻醉大鼠后，开腹暴露子宫，结扎双侧子宫角动脉，术后3个月，于发情期处死大鼠取子宫组织，发现sd大鼠子宫内膜缺血过后，子宫内膜变薄，腺体减少，腺上皮细胞受损。该造模方法成模时间长且大鼠的老龄化也会对实验造成影响。

子宫内膜化学损伤模型是通过采用95％乙醇对大鼠子宫内膜进行化学损伤，主要利用无水乙醇对组织、细胞的脱水作用，以及可使蛋白质变性的特点。文献《乙醇作用时间对大鼠子宫内膜损伤的影响》(南楠等，《生殖医学杂志》，2019年1月第28卷第1期，p66-10)公开的造模方法为：用10％水合氯醛溶液对大鼠进行麻醉，注射剂量为3ml/kg，麻醉后放入无菌手术台，仰卧，消毒后腹部阴道口向上1cm左右进行开口，轻轻夹出v型子宫，用动脉夹夹住子宫近阴道端，用注射器分别向子宫推入300-500微升95％乙醇，使子宫保持充盈状态。左右结束后将95％乙醇吸出，并用生理盐水洗涤子宫腔3遍，将子宫塞回，缝合伤口并消毒放回。

上述3种造模方法均需通过开腹的方式来构建宫腔粘连/薄型子宫内膜平台，操作复杂，且造模效果不稳定，与临床常见原因的子宫内膜损伤特点存在差异，有待进一步改进。

技术实现要素：

发明人在研究中发现：现有技术通过开腹方式建造模型，必须经子宫外侧浆膜层及肌层进入，会造成子宫局部全层的损伤，与临床常见原因造成iua的损伤特点存在差异。本构建方法采用小鼠作为模型动物，通过微创的方式保留子宫全层结构，经宫颈乙醇灌注法构建得到宫腔粘连模型。

本发明提供一种小鼠子宫内膜损伤模型的构建方法，该构建方法是非创伤性的，不会对小鼠子宫局部全层造成损伤，以解决上述技术问题。

本发明还提供了一种小鼠子宫内膜损伤模型。

本发明的小鼠子宫内膜损伤模型的构建方法采用如下技术方案：一种小鼠子宫内膜损伤模型的构建方法，所述子宫内膜损伤模型的构造方法是非创伤性的，包括下述步骤：对小鼠进行麻醉诱导，麻醉诱导成功后使用小鼠灌胃针从小鼠阴道进入，探查宫颈松弛后使所述小鼠灌胃针进入子宫角，注射95％乙醇并停留特定时间，之后除去残留乙醇。

优选的，所述小鼠灌胃针与连通三通管相连，所述连通三通管分别与95％乙醇和生理盐水相连。通过将小鼠灌胃针和三通管相连，使得可以精确控制95％乙醇的注射时长，及时使用生理盐水冲洗宫腔。

优选的，所述小鼠灌胃针进入子宫角的深度为0.5-1.0cm。

优选的，所述95％乙醇停留时间为10-60s。

优选的，所述95％乙醇停留时间为40s。95％乙醇停留时间为40s时，子宫内膜显著变薄并且纤维化程度严重即宫腔粘连产生，构建得到的模型接近临床由于妊娠早期流产而做的扩张刮除术造成的宫腔粘连，也是造成宫腔粘连的主要原因。

优选的，采用2-3％异氟烷对实验动物进行麻醉诱导并用1.5-2％浓度的异氟烷维持麻醉。

优选的，通过肌肉注射4％间三苯酚的方法使小鼠宫颈松弛。

优选的，通过使用生理盐水冲洗子宫角的方法稀释并除去残留的乙醇。

本发明的小鼠子宫内膜损伤模型采用如下技术方案：所述小鼠子宫内膜损伤模型采用如上述任意一项所述的方法构建得到。

本发明的有益效果是：本发明的小鼠子宫内膜损伤模型的构建方法可在保留子宫全层结构的情况下，实现模型的构建。本发明的构建方法操作简单、无需对小鼠进行开腹，可有效解决现有技术中以小鼠为模型动物采用开腹的方式构建子宫内膜损伤模型难度大的问题。此外，本发明以小鼠为实验动物，小鼠饲养方便，操作难度低。

本发明的小鼠子宫内膜损伤模型的构建方法造模效果稳定、操作简单，成功率可高达95％。

采用本发明的小鼠子宫内膜损伤模型的构建方法得到的小鼠模型，其造模效果更接近临床常见宫腔粘连的情况。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的小鼠子宫内膜损伤模型的构建方法的操作步骤示意图；

图2-3为按照实施例1的方法构建得到的小鼠子宫内膜损伤模型的组织学分析结果；

其中，图2中：a为小鼠子宫内膜解剖形态及he染色对比图；b为子宫内膜厚度量化对比图；c为腺体数量变化图；

图3中：a为小鼠子宫内膜masson染色结果图；b为小鼠子宫内膜纤维化百分比结果图

图4为按照实施例1的方法构建得到的小鼠子宫内膜损伤模型的免疫组化分析结果图，a为免疫组化染色结果图；b为免疫组化cd31数据分析结果图；c为免疫组化f4/80数据分析结果图；

图5为妊娠评估结果图，a为小鼠子宫内膜妊娠数量解剖图；b为每只小鼠胚胎个数；c为小鼠妊娠数量结果图

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1.材料和方法

1.1主要材料

采用性成熟未交配的雌性balb/c小鼠，spf级，鼠龄8～10周，体重18～22g。实验过程严格按照动物伦理学标准进行操作。随意获取食物和水，并保持每日12h的光照时间。每日早8：00行阴道涂片，显微镜观察阴道上皮细胞的形态，确定小鼠动情周期。选取正常发情周期为5天的20只小鼠，所有后续操作均在发情期进行。

试剂和仪器leica显微镜(德国leica公司)、石蜡切片机(金华市益迪医疗设备厂)、masson染色试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)、羊抗鼠cd31一抗(美国abcam公司)和兔/鼠通用型免疫组化试剂盒[基因科技(上海)有限公司]。

实验动物分组20只小鼠根据损伤时间的不同随机分为a组(即95％乙醇子宫停留时间10s)，b组(即95％乙醇子宫停留时间20s)，c组(即95％乙醇子宫停留时间40s)，d组(即95％乙醇子宫停留时间1min),e组(即95％乙醇子宫停留时间2.5min),f组(即95％乙醇子宫停留时间5min),g组(单纯使用生理盐水冲洗子宫腔)。

1.2造模步骤

利用乙醇诱导细胞凋亡原理，以95％乙醇损伤小鼠宫腔，根据乙醇存留时间不同造成子宫内膜不同程度损伤，模拟iua的产生。用2-3％异氟烷诱导小鼠麻醉，维持麻醉使用1.5-2％浓度异氟烷，操作过程中小鼠保持自然呼吸与心跳。麻醉诱导成功后，4％间苯三酚(0.02mg/g)肌肉注射，2分钟后使用连接三通管的小鼠灌胃针从小鼠阴道进入，探查宫颈松弛后进入子宫角约1cm，注射95％乙醇，待乙醇从阴道口流出(表明乙醇完全充满小鼠子宫)开始计时，分别停留10s，20s，40s，1min，2.5min，5min，使用生理盐水冲洗子宫角，稀释并除去残留的乙醇(造模步骤参见说明书附图图1)。

备注:因为2.5min、5min组宫腔内子宫内膜大部分消失，可见局灶残存子宫内膜腺体，损伤过重后，故后续未对上述2组的造模效果进行进一步检测。

实施例2

2.1组织学分析

小鼠于术后8天在动情间期时全麻下取材,取材范围包括双侧子宫全层,进行动态组织形态学观察及评价。取材以假手术子宫为对照组(同实施例1中的g组，使用生理盐水冲洗子宫腔)。取材时记录子宫狭窄、堵塞情况,将宫腔通畅的子宫组织甲醛固定,石蜡包埋,取损伤区中央部位组织连续切片,行he染色(图2-a)、masson染色(图3-a)和免疫组织化学染色(图4-a)。普通倒置显微镜下观察组织学染色结果并拍照,使用图像分析软件ipp(image-proplus6.0software)进行测量分析。根据光镜下(40×)每个标本连续切片的he染色结果,测量手术区子子宫壁厚度,每组每张切片取三个部位测量,取其平均值,比较各组子宫子宫内膜损伤术后各时间段子宫壁厚度(图2–b)。

备注:子宫内膜厚度通过随机采集he染色切片中10个视野进行测量，获得均值；子宫内膜腺体通过随机采集he染色切片中5个视野进行计数，获得均值；

随机采集masson染色切片中5个视野，计算每个视野下子宫内膜纤维化面积的比例，即内膜间质纤维化面积占子宫内膜面积的百分比。

进一步采用图像分析软件ipp(image-proplus6.0software)进行分析。

2.2免疫组化分析

切片厚度为4mm，在37.8℃下脱蜡，再水化，在3％h2o2中孵育30分钟。切片在378c下用羊血清(1:20；zsgb-bio)封闭30分钟。用抗细胞角蛋白31(ck31；1:800；abcam)的一级抗体标记，f4/80(f4/80；1:100；novus)在48℃下培养12h，然后用山羊抗兔二级抗体在室温下标记培养2天。二氨基联苯胺(dab)染色(1:20；zsgb-bio)结果用nikoneclpse80i显微镜成像。用imagepro-plus软件(媒体控制论)对阳性染色区域的百分比进行量化。每幅图像中随机选取4个字段进行计数。其中，免疫组化cd31数据分析结果详见说明书附图图4-b；免疫组化f4/80数据分析结果详见说明书附图图4-c。

结果表明:与假手术组小鼠子宫内cd31阳性表达率相比，乙醇处理10s时对小鼠子宫内cd31表达率无明显影响；而乙醇处理20s及40s后，实验小鼠子宫内cd31阳性表达率显著高于假手术组(p＜0.01)；但乙醇处理60s时，小鼠子宫内cd31表达率则显著下降(p＜0.01)

实施例3妊娠率评估

选取15只balb/c小鼠使用上述方法于造模(此处选用乙醇左右时间40秒的处理组，该处理组所得模型损伤程度符合宫腔粘连的特征。ethanol-40s组小鼠子宫内膜明显变薄(参见说明书附图图2b)，结构松散，内膜层坏死严重，腺体缺失)20天后与成年balb/c小鼠连续合笼交配过夜,以合笼后第2天阴道图片见精子为妊娠第1天,同时观察雌鼠体重及腹形变化,于妊娠中晚期开腹探查受试雌鼠双侧子宫的受孕情况,统计每组孕鼠个数及孕囊或胚胎的数量,从第1天合笼时间开始至30天交配实验完全结束(实验结果详见说明书附图图5，a-c)。

备注：上述实施例中统计学分析采用spss17.0统计学软件进行统计分析,实验数据以±s表示,多组数据组间比较采用单向方差(onewayanova)法和snk法分析,小样本数据比较采用非参数秩和检验,p<0.05为差异有统计学

实施例4按照本发明的方法造模的成功率

按照实施例1的方法对40只小鼠进行造模，由于小鼠子宫较薄，生理盐水冲击较大导致其中2只子宫破裂，造模失败。采用本发明的小鼠子宫内膜损伤模型的构建方法造模成功率可达95％，甚至更高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。