FGF21在制备用于治疗结直肠癌药物中的应用的制作方法

文档序号：21538169发布日期：2020-07-17 17:36阅读：348来源：国知局

本发明涉及fgf21在制备用于治疗结直肠癌药物中的应用，特别涉及人fgf21在制备用于治疗结直肠癌药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术：

大肠癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，大肠癌包括结肠癌和直肠癌，是我国第三大常见恶性肿瘤。其发病率随着生活水平的提高呈现上升趋势，在世界范围内，大肠癌以每年1023152例新发病例数居常见恶性肿瘤发病率第3位，占恶性肿瘤总发病数的10.38％。在我国，随着居民生活方式和饮食结构的改变，结直肠癌的发病率上升趋势明显，以每年4％的速度递增，年均增长速度高出世界范围2个百分点。

目前，大肠癌的治疗主要以外科根治手术为主，化疗、放疗、中医药治疗及生物治疗作为其辅助性治疗手段。首次诊断的病人中大约有三分之二接受了根治术，其中超过一半的患者出现复发或远处转移。对晚期癌肿或有广泛转移的癌肿，不能进行根治性手术，内科综合治疗常成为主要治疗手段，在可手术的患者中，大肠癌术后仍有较高的复发率。而常用的治疗药物通常为广谱类化学药物，具有较多的副作用。因此，开发一种安全的、同时具有抑制肿瘤生长和复发且器官保护效应的、无相关明显副作用的、安全的治疗结直肠癌的药物是目前研发的理想目标。

近年来，大量临床调查结果显示结直肠癌的发生发展与代谢异常存在十分紧密的联系。大量研究发现代谢通路包括糖酵解、三羧酸循环、脂肪酸代谢、谷氨酰胺代谢等在肿瘤细胞中均发生了重编程变化，肿瘤细胞可通过对各种代谢途径间的协调，提供增殖所必须的脂肪酸、核苷酸等，从而使生物大分子的合成过程更适合于肿瘤细胞的快速增殖。尤其需要指出的是，代谢异常并不仅仅是肿瘤发生发展的结果，还可能直接参与肿瘤的始发过程。目前，从代谢的角度开发抗肿瘤药物，已在诸多的肿瘤中获得了成功的应用，比如，最近的研究发现某些编码代谢酶类的基因本身就是癌基因，如延胡索酸羧化酶的突变与肾癌的发生、发展；琥珀酸羧化酶的突变与嗜铬细胞瘤的发生发展；异柠檬酸脱氢酶的突变产生代谢物小分子2hg一直hnf4α的表达从而诱导胆管癌等。基于以上分析表明靶向肿瘤细胞代谢可能是杀死肿瘤细胞的有效途径之一。然而，目前开发的药物都是一些小分子抑制剂，靶向性较弱，副作用较多，而生物蛋白类药物吸收快，靶向性强。因此，针对结直肠癌开发新型靶向生物蛋白类制剂是目前肿瘤研究的热点。

技术实现要素：

本发明经过大量的研究发现，作为参与糖脂代谢网络多个环节的重要成员的人成纤维细胞生长因子21可以显著抑制结直肠癌的发生发展以及转移。基于此，本发明提供了fgf21蛋白在制备预防、缓解和/或治疗结直肠癌的药物方面的新用途。

本发明的第一个目的是提供fgf21蛋白在制备预防、缓解和/或治疗结直肠癌的药物中的应用。

在一种实施方式中，所述fgf21蛋白的氨基酸序列如seqidno.1～5任一所示。

在一种实施方式中，所述fgf21蛋白的有效剂量为0.1～10mg/kg。

本发明的第二个目的是提供一种治疗结直肠癌的药物，所述药物的活性成分包括fgf21蛋白。

在一种实施方式中，所述fgf21蛋白的氨基酸序列如seqidno.1～5任一所示。

在一种实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的载剂或辅料。

在一种实施方式中，所述药物的给药途径包括口服、腹腔注射、皮下注射、静脉注射或肌肉注射。

本发明的第三个目的是提供fgf21基因作为药物靶标在筛选具有治疗结直肠癌的药物中的应用。

在一种实施方式中，所述fgf21基因的核苷酸序列如seqidno.6～10任一所示。

在一种实施方式中，所述应用是用于筛选fgf21蛋白的小分子激活剂。

本发明的第四个目的是提供fgf21蛋白在制备肿瘤糖代谢和/或谷氨酰胺代谢抑制剂中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是制备hk2、pkm2、pfkp、pd、gpd中一种或多种抑制肿瘤糖代谢关键蛋白的抑制剂。

在一种实施方式中，所述应用是制备谷氨酰胺代谢相关蛋白gls的抑制剂。

本发明还要求保护fgf21蛋白本发明还要求保护所述fgf21蛋白在制备预防、缓解和/或治疗前列腺癌、食管癌、结肠直肠腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、透明细胞肾癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤中的一种或多种疾病的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明发现fgf21基因的新功能，能够显著改变肿瘤代谢，尤其是显著抑制肿瘤糖代谢及谷氨酰胺代谢过程关键蛋白hk2,pkm2以及gls，抑制结直肠肿瘤细胞系的增殖、侵袭、迁移；能够在小鼠模型中显著降低肿瘤病灶的大小，因而可作为各种剂型药物的有效成分，对于结直肠癌的治疗具有极其重大的意义。

(2)本发明通过注射fgf21蛋白，可缓解结直肠的发生和发展，抑制结肠癌的生成和转移。

附图说明

图1为fgf21对人结直肠癌移植瘤生长速度的影响；其中，a为肿瘤体积的变化；b为肿瘤质量的变化；

图2为fgf21aom/dss诱导的小鼠结直肠癌的影响；其中，a为大肠肿瘤数目；b为大肠的形貌表现；

图3为fgf21对肿瘤代谢关键蛋白的影响；其中，a为肿瘤糖代谢通路关键蛋白的变化；b为肿瘤谷氨酰胺代谢关键蛋白的变化。

具体实施方式

实验动物及饲养：裸鼠及c57bl/6小鼠购于上海斯莱克公司。饲养于江南大无锡医学院动物中心，每12小时交替照明，温度20±2℃。

细胞培养：结直肠癌细胞系sw620由中国科学院生物化学与细胞生物学研究所提供；

rpmi1640、dmem、0.05％trypsin，购于博士德公司；胎牛血清购于四季青公司。氧化偶氮甲烷购于sigma公司(批号098k1488)，葡聚糖硫酸钠mpbiomedicals(批号0216011050)；其他药品为国产分析纯。结直肠癌细胞系贴壁生长于含10％胎牛血清的rpmi1640培养液中，于37℃，5％co2湿化培养箱中培养，隔天传代一次。

实施例1fgf21在制备药物中的应用

fgf21蛋白通过培养微生物细胞制备获得，制备方法已公开于授权公告号为cn106432509b的专利申请中。

将微生物细胞制备的获得fgf21蛋白与药学上可接受的载剂或辅料共同用于制备药物，所述药学上可接受的载剂或辅料可以为赋形剂、佐剂和/或稀释剂等。

实施例2fgf21对人结直肠癌移植瘤生长速度的影响

按照实施例1的方法制备氨基酸序列如seqidno.1所示的fgf21蛋白。

将人结肠癌细胞sw620细胞按照1×10⁶个细胞/只接种6周龄的雄性裸鼠的皮下，待肿瘤长至200mm³随机分为四组，①生理盐水组：注射等体积生理盐水；②低剂量组：注射1mg/kgfgf21；③中剂量组：注射5mg/kgfgf21；④高剂量组：注射10mg/kgfgf21。每天注射一次，连续注射15天。每天监测肿瘤体积，三周后处死小鼠，称量肿瘤重量。结果显示：三种不同剂量的fgf21均能抑制移植瘤体积和最终肿瘤重量，且呈现剂量依赖性。高剂量fgf21(10mg/kg)注射后，可完全抑制肿瘤生长，使肿瘤维持在500mm³，最终体积仅为对照组的30％，同样肿瘤质量也下降了约70％，注射1mg/kg和5mg/kg分别能使肿瘤质量下降30％和50％(如图1所示)。

实施例3fgf21对aom/dss诱导的小鼠结直肠癌的影响

按照实施例1的方法制备氨基酸序列如seqidno.1所示的fgf21蛋白。

取c57小鼠于第一周注射氧化偶氮甲烷10mg/kg，同时开始2.5％葡聚糖硫酸钠自由食用周期，每个周期包含三周21天，于第一周饮用含葡聚糖硫酸钠的水，后两周饮用普通水，以三周为一个周期，一共处理三个周期。在第六周开始分组为生理盐水组及fgf21注射组，fgf21注射组注射剂量为10mg/kg，生理盐水组注射同样量的生理盐水，每天注射一次，连续注射4周。

结果如图2a所示，注射fgf21后能够使平均肿瘤灶个数由4减少至1，图2b显示了fgf21治疗组和对照组的大肠典型照片，可直观的表明fgf21的治疗效果，减少肿瘤数目，改善肠癌长度缩短的问题，使结肠长度比对照组增加了10-20mm，平均增加18mm。

实施例4fgf21对肿瘤代谢关键蛋白的影响

按照实施例1的方法制备氨基酸序列如seqidno.1所示的fgf21蛋白。

通过westernblot(蛋白质免疫杂交印迹)检测实施例3肿瘤组织中肿瘤代谢相关蛋白水平：

a)溶液配制：

(1)10％(w/v)十二烷基硫酸钠sds溶液：0.1gsds，1毫升h2o去离子水配制，室温保存。

(2)分离胶缓冲液：1.5mmol/ltris-hcl(ph8.8):18.15gtris用80毫升水溶解，用hcl调节ph到8.8，加水稀释到100毫升终体积。

(3)浓缩胶缓冲液：0.5mmol/ltris-hcl(ph6.8):6.05gtris溶于80毫升水中，用hcl调至ph6.8，加水稀释到100毫升终体积。

(4)sds-page加样缓冲液：ph6.8的0.5mol/ltris缓冲液8毫升，甘油6.4毫升，10％sds12.8毫升，巯基乙醇3.2毫升，0.05％溴酚蓝1.6毫升，h2o32毫升混匀备用。

(5)tris-甘氨酸电泳缓冲液：303gtris，188g甘氨酸，10gsds，用蒸馏水溶解至1000毫升，临用前稀释10倍。

(6)转膜缓冲液：称取14.4g甘氨酸、6.04gtris，并加入200毫升甲醇，加水至总量1l。

(7)tris缓冲盐溶液(tbs)：20mmol/ltris/hcl(ph7.5)，500mmol/lnacl。

b)具体步骤如下：取部分实施例2中的移植瘤细胞用pbs清洗3次，加入裂解液，直接煮沸5分钟，冰上冷却后，12000rpm离心2min，取上清，-20℃保存备用。

(一)蛋白质浓度测定

采用bca法测定蛋白质浓度：将0.5mg/ml标准蛋白梯度加到孔板中，加pbs补足至20μl；加适当体积(3μl)蛋白质样品到孔板中，加pbs补足至20μl；各孔加入200μlbca工作液(使用前配制，现配现用)，37℃孵育30min；测定波长562nm吸光度，通过标准曲线和样品体积计算出蛋白质的浓度。

(二)sds-page凝胶电泳

(1)清洗后的玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。

(2)配10％分离胶，加入temed后立即摇匀即可灌胶，随即用乙醇液封，胶充分凝固就可倒去胶上层乙醇并用吸水纸吸干。

(3)配5％的浓缩胶，加入temed后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，竖直向上轻轻将其拔出。

(4)将其放入电泳槽中，加足够的电泳液后开始准备上样。蛋白质样品测完蛋白含量后，加入5×sds上样缓冲液至终浓度为1×，在沸水中煮3min混匀后上样，总蛋白量35μg。

(5)恒压80v电泳跑胶，当样品进入下层胶后恒压120v电泳直至溴酚蓝达到凝胶底部为止，进行转膜。

(三)转膜：

(1)切胶：将玻璃板撬掉，除去小玻璃板后，将浓缩胶刮去，根据实验需要按照蛋白的分子量，以marker为对照进行切胶。

(2)备膜：裁剪pvdf膜和滤纸，将切好的pvdf置于80％甲醇溶液中激活30s。

(3)装膜：将转膜用的夹子打开使黑的一面(负极)保持水平。在上面垫一张海绵。

垫，加入转膜液浸湿，在垫子上垫上中浸泡好的滤纸，随后按照凝胶—硝酸纤维素膜—滤纸—海绵垫的顺序依次叠放。最后将白色板(正极)盖好装入转膜槽中。

(4)转膜：将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。4℃转膜，恒流400ma。

(5)转完后将膜取下，标记一角。

(四)免疫反应

(1)封闭：将膜用tbst中漂洗3次，每次5min。漂洗后将硝酸纤维素膜放入5％脱脂奶粉中，室温下摇床1h。

(2)加一抗：将封闭后的硝酸纤维素膜放入含有tbst的洗缸中摇床上漂洗3次，每次5min。放入加有一抗的平皿中4℃过夜孵育。

(3)加二抗：回收一抗，将硝酸纤维素膜在tbst洗缸中室温摇床漂洗3次，每次5min，然后将漂洗过的硝酸纤维素膜放入加有二抗的平皿中，避光室温孵育45min。孵育后将硝酸纤维素膜在tbst洗缸中洗3次，每次5min。

(五)化学发光

(1)将a和b两种试剂在小离心管里按照发光试剂盒说明书操作将其混合，加到硝酸纤维素膜上，用化学发光成像仪显色。

肿瘤细胞主要通过代谢的改变维持其异常增殖和转移的能量所需，而代谢速率的改变主要通过调节代谢过程关键基因表达水平实现，其中糖酵解代谢和谷氨酰胺代谢的改变尤为重要。图3可以看出，fgf21注射后可显著抑制肿瘤糖代谢关键蛋白hk2(己糖激酶2)、pkm2(丙酮酸激酶)、pfkp(磷酸果糖激酶)、pd(丙酮酸脱氢酶)、gpd(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)(图3a)，谷氨酰胺代谢相关蛋白gls(谷氨酰胺酶)(图3b)，这些蛋白在肿瘤异常增殖中显著高表达，多种药物靶向抑制这些蛋白后可显著改善结直肠癌，fgf21对这些关键蛋白表达的抑制也进一步说明fgf21对结直肠癌的治疗效果，同时也说明fgf21对结直肠癌细胞的抗肿瘤效果主要通过糖酵解和谷氨酰胺代谢的抑制作用。

发明人还尝试对seqidno.2～5所示的fgf21蛋白的融合蛋白在治疗结直肠癌方面的效果进行了研究，结果显示，如seqidno.2～5任一所示的fgf21融合蛋白与seqidno.1所示的fgf21蛋白具有相当的效果。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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