木香烃内酯和/或去氢木香内酯在制备治疗黑色素瘤的药品中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药
技术领域：
，尤其涉及木香烃内酯和/或去氢木香内酯在制备治疗黑色素瘤的药品中的应用。
背景技术：
：黑色素瘤，又称恶性黑色素瘤(malignantmelanoma，mm)，被称为“皮肤癌王”，是皮肤癌当中最危险的一种，增殖能力极强，是导致死亡人数最多的皮肤癌。中国黑色素瘤检出率增加，每年新发病持续增长。目前，常规治疗黑色素瘤的主要方法是手术、放疗和化疗，但存在创伤大、不良反应明显的技术问题。技术实现要素：本发明的目的在于提供木香烃内酯和/或去氢木香内酯在制备治疗黑色素瘤的药品中的应用，木香烃内酯和/或去氢木香内酯通过抑制黑色素瘤细胞增殖和诱导黑色素瘤细胞凋亡来治疗黑色素瘤。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了木香烃内酯和/或去氢木香内酯在制备预防和/或治疗黑色素瘤的药品中的应用。优选的，所述木香烃内酯和/或去氢木香内酯通过抑制黑色素瘤细胞增殖和/或诱导黑色素瘤细胞凋亡来治疗黑色素瘤。优选的，当所述药品包括木香烃内酯和去氢木香内酯时，所述木香烃内酯和去氢木香内酯的质量比为(1～10)：(1～10)。优选的，所述药品还包括人参皂苷rh2或黄芪多糖。优选的，当所述药品包括木香烃内酯和人参皂苷rh2时，所述木香烃内酯和人参皂苷rh2的质量比为(1～10)：(1～10)。优选的，当所述药品包括木香烃内酯和黄芪多糖时，所述木香烃内酯和黄芪多糖的质量比为(1～10)：(1～10)。优选的，所述药品的剂型包括口服制剂和外用制剂；所述口服制剂包括颗粒剂、片剂、汤剂或胶囊剂；所述外用制剂包括软膏剂或散剂。优选的，所述药品还包括辅料；当所述药品的剂型为颗粒剂时，所述辅料包括β-环糊精和硬脂酸镁；当所述药品的剂型为片剂时，所述辅料包括羟丙甲纤维素、硬脂酸镁和麦芽糊精；当所述药品的剂型为软膏剂时，所述辅料包括凡士林。本发明的有益效果：本发明提供了木香烃内酯和/或去氢木香内酯在制备预防和/或治疗黑色素瘤的药品中的应用。本发明中，木香烃内酯和/或去氢木香内酯能够抑制黑色素瘤细胞b16增殖和诱导细胞凋亡，具有抗黑色素瘤的作用。木香烃内酯处理b16细胞24h，48h的ic50值分别为28.34μmol/l和19.21μmol/l；去氢木香内酯处理b16细胞24h，48h的ic50值分别为29.54μmol/l和21.22μmol/l；木香烃内酯处理b16细胞48h后，细胞形态发生明显变化，主要是凋亡相关形态学的改变，包括细胞收缩、高染色质凝聚、凋亡体的可见形成和核降解；去氢木香内酯处理b16细胞48h后，细胞形态发生明显变化，主要是凋亡相关形态学的改变，包括细胞收缩、高染色质凝聚、凋亡体的可见形成和核降解；木香烃内酯处理细胞48h后，浓度为25μmol/l时诱导35.1％的b16细胞凋亡；浓度为50μmol/l的木香烃内酯诱导50.2％的b16细胞凋亡；浓度为100μmol/l时诱导57.6％的b16细胞凋亡；去氢木香内酯处理细胞48h后，浓度为25μmol/l时诱导36％的b16细胞凋亡；浓度为50μmol/l的去氢木香内酯诱导47.9％的b16细胞凋亡；浓度为100μmol/l时诱导57.5％的b16细胞凋亡。附图说明图1为木香烃内酯对b16细胞增殖的影响；图2为去氢木香内酯对b16细胞增殖的影响；图3-1为空白对照b16细胞形态；图3-2为25μmol/l木香烃内酯处理后b16细胞形态；图4-1为空白对照b16细胞形态；图4-2为25μmol/l去氢木香内酯处理后b16细胞形态；图5-1为流式细胞仪分析空白对照b16细胞的凋亡率结果；图5-2为流式细胞仪分析25μmol/l木香烃内酯对b16细胞的凋亡率；图5-3为流式细胞仪分析50μmol/l木香烃内酯对b16细胞的凋亡率；图5-4为流式细胞仪分析100μmol/l木香烃内酯对b16细胞的凋亡率；图6-1为流式细胞仪分析空白对照b16细胞的凋亡率结果；图6-2为流式细胞仪分析25μmol/l去氢木香内酯对b16细胞的凋亡率；图6-3为流式细胞仪分析50μmol/l去氢木香内酯对b16细胞的凋亡率；图6-4为流式细胞仪分析100μmol/l去氢木香内酯对b16细胞的凋亡率；图7为westernblot分析木香烃内酯对b16凋亡相关蛋白表达。具体实施方式本发明提供了木香烃内酯和/或去氢木香内酯在制备预防和/或治疗黑色素瘤的药品中的应用；所述木香烃内酯和/或去氢木香内酯通过抑制黑色素瘤细胞增殖和/或诱导黑色素瘤细胞凋亡来治疗黑色素瘤；所述木香烃内酯通过线粒体释放cytoc从而激活caspase凋亡通路，最终引起b16细胞凋亡，起到抗黑色素瘤的作用。在本发明中，所述木香烃内酯(costunolide)的化学结构式如式i所示，来源于常规市售，纯度＞98％，cas号：553-21-9。在本发明中，所述去氢木香内酯(dehydrocostuslactone)的化学结构式如式ii所示，来源于常规市售，纯度＞98％，cas号：477-43-0。在本发明中，当所述药品包括木香烃内酯和去氢木香内酯时，所述木香烃内酯和去氢木香内酯的质量比优选为(1～10)：(1～10)，更优选为(1～4)：(1～4)。在本发明中，所述药品优选的还包括人参皂苷rh2或黄芪多糖；当所述药品包括木香烃内酯和人参皂苷rh2时，所述木香烃内酯和人参皂苷rh2的质量比优选为(1～10)：(1～10)，更优选为(1～4)：(1～4)；当所述药品包括木香烃内酯和黄芪多糖时，所述木香烃内酯和黄芪多糖的质量比优选为(1～10)：(1～10)，更优选为(1～4)：(1～4)。在本发明中，所述人参皂苷rh2具有抗癌作用，还能增强机体免疫力，快速恢复体质；黄芪多糖具有抗肿瘤，抗氧化损伤和抗衰老等作用。本发明中，所述人参皂苷rh2和黄芪多糖来源于常规市售。在本发明中，所述药品的剂型包括口服制剂和外用制剂；所述口服制剂优选的包括颗粒剂、片剂、汤剂或胶囊剂；所述外用制剂优选的包括软膏剂或散剂；所述药品优选的还包括辅料；当所述药品的剂型为颗粒剂时，所述辅料优选的包括β-环糊精和硬脂酸镁，药品中活性成分、β-环糊精和硬脂酸镁的质量比优选为(105～110)：(5～7)：(5～7)，更优选为108：6：6；当所述药品的剂型为片剂时，所述辅料优选的包括羟丙甲纤维素、麦芽糊精和硬脂酸镁，药品中活性成分、羟丙甲纤维素、麦芽糊精和硬脂酸镁的质量比优选为(85～95)：(5～7)：(3～5)：(0.3～0.8)，更优选为89.5：6：4：0.5；当所述药品的剂型为汤剂时，用药物煎汤，去渣取药汁而成，不需要辅料；当所述药品的剂型为胶囊剂时，所述辅料右旋的包括淀粉、硬脂酸镁和羟丙甲纤维素；当所述药品的剂型为软膏剂时，所述辅料优选的包括凡士林，药品中活性成分和凡士林的质量比优选为1～3:7～9，更优选为1：4；当所述药品的剂型为散剂时，所述辅料优选的包括淀粉、滑石粉和糊精。在本发明中，所述药品的用量标准为：颗粒剂：包装规格2g/袋。服用方法1次1袋，1日2次；片剂：包装规格0.5g/片。服用方法1次两片，1日3次；乳膏剂：适量涂于患处，1日3次。在本发明中，所述口服制剂经口服，有效成分体内胃肠道吸收，通过血液循环，作用肿瘤位置，抗肿瘤；所述外用制剂不经过口服或注射给药，直接作用于皮肤，起到局部或全身的治疗效果；所述外用制剂透皮发挥作用的过程：皮肤的表面是角质层，外用制剂透过皮肤角质层，进入角质层-真皮连接层除，作用黑色素瘤起到抗肿瘤作用。本发明的药品能预防黑色素瘤，因为位于表皮和真皮交界处的黑痣容易恶变，被认为是黑色素瘤的前驱期。下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明实施例中采用的材料：木香烃内酯(costunolide)(市售)(纯度＞98％)(cas号：553-21-9)。去氢木香内酯(dehydrocostuslactone)(市售)(纯度＞98％)(cas号：477-43-0)。人参皂苷rh2(市售)(cas号：78214-33-2)。黄芪多糖，市售。小鼠b16黑色素瘤细胞。实施例1mtt法测定对黑色素瘤细胞b16细胞增殖的影响取对数生长期的小鼠b16黑色素瘤细胞，显微镜下细胞计数后，细胞浓度调整为1×105个/ml，接种到96孔板，每孔100μl细胞液，即1×104个/孔，细胞贴壁生长过夜后，分别加入100μl含香烃内酯或去氢木香内酯的新鲜培养基，药品浓度设置为3.125μm、6.25μm、12.5μm、25μm、50μm，同时设有未加药的空白对照组，每组设置6个复孔，分别培养24、48和72h，每孔加入20μlmtt溶液，细胞培养箱中继续培养4h，弃去旧培养基，每孔加入200μldmso，酶标仪a570nm测定吸光度值。细胞增殖抑制率(％)＝(a空白组-a给药组)/a空白组×100％。结果如下：木香烃内酯处理小鼠b16黑色素瘤细胞24h、48h后，和未给药空白对照组相比，能明显抑制小鼠b16黑色素瘤细胞增殖(图1，注：p＜0.05具有显著性差异，用*表示；p＜0.01具有极显著性差异，用**表示)。木香烃内酯在0-100μmol/l处理b16细胞时，抑制率随着浓度的增加而增大；且随着时间的增加，抑制率也在增大。如浓度为25μmol/l的木香烃内酯对b16细胞24h时的抑制率为42.01％，48h时抑制率为62.23％(图1)。木香烃内酯处理b16细胞24h，48h的ic50值分别为28.34μmol/l和19.21μmol/l。去氢木香内酯处理小鼠b16黑色素瘤细胞24h、48h后，和未给药空白对照组相比，能明显抑制小鼠b16黑色素瘤细胞增殖(图2，p＜0.05具有显著性差异，用*表示；p＜0.01具有极显著性差异，用**表示)。去氢木香内酯在0-100μmol/l处理b16细胞时，抑制率随着浓度的增加而增大；且随着时间的增加，抑制率也在增大如浓度为25μmol/l的去氢木香烃酯对b16细胞24h时的抑制率为40.21％，48h时抑制率为60.06％(图2)。去氢木香内酯处理b16细胞24h，48h的ic50值分别为29.54μmol/l和21.22μmol/l。可见，木香烃内酯和去氢木香内酯具有很强的抗b16黑色素瘤细胞增殖的能力。实施例2dapi染色细胞核后荧光显微镜观察凋亡现象取3ml1×105个/mlb16细胞液，接种到置有玻片的60mm培养皿中，贴壁生长过夜后，弃去旧培养基，分别加入3ml含木香烃内酯或去氢木香内酯浓度为25μm的新鲜培养基，设置空白对照组，置于细胞培养箱中继续培养48h后，用pbs洗两次，加入预冷的75％的乙醇，4℃冰箱内固定过夜，弃去固定液，加入pbs洗3次，加入dapi染色液，37℃避光30min，pbs洗后，荧光倒置显微镜下观察细胞形态，并拍照分析。结果如下：木香烃内酯处理b16细胞后，显微镜下观察细胞的数目明显减少，出现收缩，消解现象。dapi染色后在倒置显微镜下观察木香烃内酯对b16细胞形态的影响(图3-1，图3-2)，其中图3-1为空白对照b16细胞形态，图3-2为25μmol/l木香烃内酯处理后b16细胞形态，木香烃内酯处理b16细胞48h后，细胞形态发生明显变化，主要是凋亡相关形态学的改变，包括细胞收缩、高染色质凝聚、凋亡体的可见形成和核降解。去氢木香内酯处理b16细胞后，显微镜下观察细胞的数目明显减少，出现收缩，消解现象。dapi染色后在倒置显微镜下观察去氢木香内酯对b16细胞形态的影响(图4-1，图4-2)，其中图4-1为空白对照b16细胞形态，图4-2为25μmol/l去氢木香内酯处理后b16细胞形态，去氢木香内酯处理b16细胞48h后，细胞形态发生明显变化，主要是凋亡相关形态学的改变，包括细胞收缩、高染色质凝聚、凋亡体的可见形成和核降解。说明木香烃内酯和去氢木香内酯引起了b16细胞凋亡。实施例3流式细胞仪fcm检测分析细胞凋亡取3ml1×105个/mlb16细胞液，接种到的60mm培养皿中，贴壁生长过夜后，弃去旧培养基，加入含不同浓度药品的新鲜培养基，设不加药品组为对照组。置于细胞培养箱中继续培养48h后，用不含edta的胰酶消化细胞，1000rpm离心5min，弃上清，用pbs洗两遍，用pbs重悬细胞，取1×104个重悬细胞，离心后，加入195μlannexinv-fitc结合液，轻轻重悬细胞。加入5μlannexinv-fitc染色液，轻轻混匀，加入10μlpi，轻轻混匀。室温避光孵育20min，随后置于冰上，流式细胞仪检测，进行凋亡率分析。结果如下：流式细胞仪检测木香烃内酯诱导b16细胞凋亡，不同浓度的药品处理b16细胞48h后，流式检测结果发现木香烃内酯能显著诱导b16细胞凋亡，增加细胞凋亡数目，而且随着浓度的增加，细胞凋亡率也在增加。木香烃内酯处理细胞48h后，浓度为25μmol/l时诱导35.1％的b16细胞凋亡；浓度为50μmol/l的木香烃内酯诱导50.2％的b16细胞凋亡；浓度为100μmol/l时诱导57.6％的b16细胞凋亡(图5-1，图5-2，图5-3，图5-4，其中图5-1为流式细胞仪分析空白对照b16细胞的凋亡率结果；图5-2为流式细胞仪分析25μmol/l木香烃内酯对b16细胞的凋亡率；图5-3为流式细胞仪分析50μmol/l木香烃内酯对b16细胞的凋亡率；图5-4为流式细胞仪分析100μmol/l木香烃内酯对b16细胞的凋亡率)。流式细胞仪检测去氢木香内酯诱导b16细胞凋亡，不同浓度的药品处理b16细胞48h后，流式检测结果发现去氢木香内酯能显著诱导b16细胞凋亡，增加细胞凋亡数目，而且随着浓度的增加，细胞凋亡率也在增加。去氢木香内酯处理细胞48h后，浓度为25μmol/l时诱导36％的b16细胞凋亡；浓度为50μmol/l的去氢木香内酯诱导47.9％的b16细胞凋亡；浓度为100μmol/l时诱导57.5％的b16细胞凋亡(图6-1，图6-2，图6-3，图6-4，其中图6-1为流式细胞仪分析空白对照b16细胞的凋亡率结果；图6-2为流式细胞仪分析25μmol/l去氢木香内酯对b16细胞的凋亡率；图6-3为流式细胞仪分析50μmol/l去氢木香内酯对b16细胞的凋亡率；图6-4为流式细胞仪分析100μmol/l去氢木香内酯对b16细胞的凋亡率)。流式结果，结合显微镜观察结果，明确了木香烃内酯和去氢木香内酯能够诱导b16黑色素瘤细胞凋亡的活性。实施例4westernblot检测凋亡蛋白分别收集对照组细胞，及不同浓度(25、50、100μmol/l)木香烃内酯处理组处理48h的b16细胞，加入配置好的含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的ripa细胞裂解液冰上充分裂解，提取蛋白。bca蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。按照蛋白样品与5×loadingbuffer体积比4：1制备，95度8min变性。取40μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至pvdf膜上，5％脱脂奶粉封闭1h，加入稀释好的一抗(cytoc；caspase3；caspase9；β-actin)，4℃孵育过夜，tbst洗膜3次，每次5min，二抗室温孵育1h，tbst洗膜3次，每次5min，加入显影液，tanon化学发光图像分析系统，采集图像，进行条带分析。结果如下：westernblot实验结果表明，木香烃内酯处理组b16细胞48h后，不同浓度(25、50、100μmol/l)木香烃内酯组细胞内cytoc、cleavedcaspase3和cleavedcaspase9表达明显升高，并成浓度依赖性促进b16细胞凋亡，与空白对照组相比，差异具有统计学意义(p＜0.05)(图7)。木香烃内酯诱导b16细胞凋亡是通过线粒体释放cytoc从而激活caspase凋亡通路(抗肿瘤，诱导肿瘤细胞凋亡的途径之一)，最终引起b16细胞凋亡，起到抗黑色素瘤的作用。实施例51)木香烃内酯(市售)；2)去氢木香内酯(市售)；3)木香烃内酯(市售)：去氢木香内酯(市售)(质量比1:1)；4)木香烃内酯(市售)：人参皂苷rh2(市售)(质量比1:1)；5)木香烃内酯(市售)：黄芪多糖(市售)(质量比1:1)取1)～5)中任何一种，真空干燥，粉碎，加入蔗糖和β-环糊精，混合均匀，干法制成颗粒，分装即得颗粒剂。配方参见表1。真空干燥条件：100℃、2h或者80℃、3h；干法制粒参数：gk-70干法制粒机，轧轮压力6.0mpa，轧轮转速500rpm颗粒剂粒径：60～80目不规则颗粒。表1颗粒剂配方实施例6片剂的制备：取1)～5)中任何一种，溶解于羟丙甲纤维素溶液，超声辅助溶解，高速分散器使药品充分分散在水中，加入麦芽糊精适量，仪器预热5min后，药液泵入流化床喷枪，制粒后与质量百分含量为0.5％的硬脂酸镁混合，压片。配方参见表2。羟丙甲纤维素溶液浓度为3％，即3g羟丙甲纤维素溶解到100ml水中，同理可放大倍数，如6g羟丙甲纤维素溶解到200ml水中。表2片剂配方实施例7抗黑色素瘤软膏：成分：木香烃内酯(市售)：去氢木香内酯(市售)(10g：10g)制备方法：加入凡士林80g调配成20％的软膏。实施例9动物实验体内抗黑色素瘤b16细胞培养至指数生长期，胰酶消化，收集细胞，配制成将处于指1×107/ml细胞悬液；选裸鼠6周龄，体重约20g，每只裸鼠右侧鼠鼷处皮下注射0.2ml细胞悬液，当细胞成瘤长至直径约2～3mm，裸鼠分组，每组6只。实验分为9组：未给药对照组，阳性对照组(2mg/kg)、木香烃内酯低剂量组(15mg/kg)、木香烃内酯高剂量组(30mg/kg)、去氢木香内酯低剂量组(15mg/kg)、去氢木香内酯高剂量组(30mg/kg)、木香烃内酯：去氢木香内酯(1:1)组(30mg/kg)、木香烃内酯：人参皂苷rh2(1:1)组(30mg/kg)、木香烃内酯：黄芪多糖(1:1)组(30mg/kg)。给药方式：灌胃给药。给药时间：3周后，处死裸鼠，取肿瘤，称重。实验结果：实验过程中，裸鼠存活状态正常，未发现有不良反应，未发现有过敏反应。无死亡小鼠出现。实验结果显示，阳性对照组(2mg/kg)、木香烃内酯低剂量组(15mg/kg)、木香烃内酯高剂量组(30mg/kg)、去氢木香内酯低剂量组(15mg/kg)、去氢木香内酯高剂量组(30mg/kg)、木香烃内酯：去氢木香内酯(1:1)组(30mg/kg)、木香烃内酯：人参皂苷rh2(1:1)组(30mg/kg)、木香烃内酯：黄芪多糖(1:1)组(30mg/kg)裸鼠的肿瘤体积和重量明显降低，说明均能抑制肿瘤细胞生长。抑瘤率＝(对照组平均体积-实验组平均体积)/对照组平均体积×100％。表3药品抑瘤率编号实验分组肿瘤重量(g)抑瘤率(％)1空白对照组3.890.002阳性对照组3.0322.113木香烃内酯低剂量组2.5634.194木香烃内酯高剂量组1.7854.245去氢木香内酯低剂量组2.6132.906去氢木香内酯高剂量组1.5460.417木香烃内酯：去氢木香内酯(1:1)组2.7629.058木香烃内酯：人参皂苷rh2(1:1)组2.8726.229木香烃内酯：黄芪多糖(1:1)组2.6432.13实施例10动物实验外用抗溃疡性黑色素瘤实验动物：裸鼠皮下接种黑色素瘤细胞，建立溃疡性黑色素瘤模型。b16细胞培养至指数生长期，胰酶消化，收集细胞，配制成将处于指1×107/ml细胞悬液；选裸鼠6周龄，体重约20g，每只裸鼠右侧鼠鼷处皮下注射0.2ml细胞悬液，当细胞成瘤长至溃疡性外溢，实验分为空白对照组和治疗组和预防组。预防组过程：皮下接种黑色素瘤细胞之前，将实施例7软膏涂在纱布上约3mm厚，外敷在裸鼠即将接种肿瘤的位置“右侧鼠鼷处”，医用胶布固定，每天1次，连用2周。2周后同上，接种肿瘤细胞，继续给药。治疗组用法：将实施例7软膏涂在纱布上约3mm厚，外敷在裸鼠溃疡性黑色素瘤处，医用胶布固定，每天1次，连用2周。效果：治疗组，溃疡性黑色素瘤，溃疡面得到控制，渗出物明显减少，与对照组比较黑色素瘤生长显著减慢。预防组，黑色素瘤细胞生长缓慢，形成很小的肿瘤结，几乎不成肿瘤块。表4乳膏抑瘤率编号实验分组肿瘤重量(g)抑瘤率(％)1空白对照组3.890.002乳膏治疗组2.2143.193乳膏预防组0.7181.74以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12