一种纳米金属硫化物作为制备神经损伤修复药物的应用的制作方法

本发明属于神经损伤修复药物领域，涉及纳米金属硫化物作为制备神经损伤修复药物的应用。

背景技术：

神经系统的复杂性使很多药物无法进入大脑，而神经细胞的自我修复能力有限，这造成许多神经系统疾病的不可逆转和进行性，最终导致结果的严重性，造成巨大的经济损失和社会负担。

以四氧化三铁为代表的纳米材料具有过氧化物模拟酶活性可以提高过氧化氢产生自由基的效率，增强杀菌效果。产生的自由基能够有效降解蛋白质、核酸和多糖。目前纳米颗粒通常被用作高效抗菌剂。

没有资料公开纳米硫化物作为神经修复药物方面的应用。

本发明是提供一种纳米金属硫化物的新用途，给出了治疗相关疾病的新思路，以解决现有技术中的问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种纳米金属硫化物的新用途，给出了治疗神经损伤的思路。

本发明公开了一种纳米金属硫化物作为制备神经损伤修复药物的应用。

进一步地，所述纳米金属硫化物，为纳米金属硫化物化合物或组合物。

进一步地，所述纳米金属硫化物为金属离子与通式(i)所示的多硫键相结合的化合物mxsn：

或所述化合物的组合物，其中n取2、3、4、5中任意一个数值。

优选地，n＝2或3。

优选地，所述纳米金属硫化物采用包括金属的二硫化物mxs2与金属的三硫化物mxs3的混合物，其中以物质的量计，s2：s3＝1:1-5。

进一步地，所述纳米金属硫化物的加入量为0.1-10mg/kg。

优选地，所述纳米金属硫化物的加入量为2.5mg/kg。

优选地，所述纳米金属硫化物的给药浓度为0.5mg/ml。

进一步地，所述纳米金属硫化物的使用方式为口服、静脉注射、肌肉注射中至少一种。

进一步地，所述纳米金属硫化物颗粒粒径为10-100nm。

优选地，所述纳米金属硫化物采用具有一定的粒径和粒形的纳米硫化铁fe1-ys混合物，其中所述s为-2价，所述y为0.1-0.2。

优选地，所述纳米金属硫化物采用包括如下步骤的方法制备：

步骤1，将铁源与水或非水溶剂按比例溶解，得反应液a；

步骤2，向反应液a中加入碱性溶液，搅拌使其溶解，得反应液b；

步骤3，向反应液b中加入硫源，搅拌使其溶解，得反应液c；

步骤4，将反应液c加热制备得到纳米硫化铁混合物。

进一步地，所述步骤4包括将反应液加热、烘干的步骤。

进一步地，所述步骤4加热的温度为100-500℃，优选为200-400℃；加热时间为1-48h，优选为12-24h。

进一步地，所述铁源选自二价铁和/或三价铁，优选氯化铁、硫酸亚铁、硝酸铁、溴化铁中的至少一种。

进一步地，所述非水溶剂为醇类溶剂、醚类溶剂、酮类溶剂、烃类溶剂、酯类溶剂中的至少一种；优选的，所述非水溶剂为醇类溶剂；更优选的，所述醇类溶剂为乙二醇、丙三醇、乙醇、聚乙二醇中的至少一种。

进一步地，所述碱性溶液选自醋酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、nh4⁺中的至少一种，优选的，选用醋酸钠、柠檬酸钠和/或碳酸氢钠的溶液。

进一步地，所述硫源选自含硫化合物；含硫化合物分为有机含硫化合物和无机含硫化合物。优选的，所述含硫化合物选自含硫氨基酸、硫醚类化合物中的一种或多种；更优选的，所述含硫氨基酸选自l-半胱氨酸、胱氨酸、gsh(谷胱甘肽)中的一种或多种，所述硫醚类化合物可为不饱和硫醚化合物，尤其为烯丙基甲基硫醚、二烯丙基硫醚、烯丙基甲基二硫醚、二烯丙基二硫醚、烯丙基甲基三硫醚、二烯丙基三硫醚、烯丙基乙硫醚中的至少一种。

进一步地，所述铁源与水或非水溶剂的摩尔比为1:1-1000；所述碱性溶液的终浓度为0.01-1mol/l；所述硫源添加的终浓度为0.01-10mol/l。

进一步地，所述铁源与所述硫源的摩尔比为1：0.02-5，优选1：0.05-2，更优选1：0.06-1，更优选1：0.1-0.8，更优选1：0.2-0.6，更优选1：0.3-0.5。

进一步地，所述铁源：硫源的重量比例为1：0.1-10；所述铁源：水或非水溶剂：碱性溶液：硫源的重量比例为0.1-1：10-100：0.1-1：0.1-1，优选，0.5-1：20-80：0.5-1：0.5-1，更优选，0.5-1：30-60：0.5-1：0.5-1。

本发明的有益效果在于：

1、提供了制备神经损伤修复药物的新思路；

2、材料获取容易，成本低，易于制备；

附图说明

图1应用例1体外受损神经元的保护效果测试结果图；

图2应用例2体外受损神经元的保护效果测试结果图；

图3应用例3体外受损神经元的保护效果测试结果图；

图4应用例4体外受损神经元的保护效果测试结果图；

图5应用例5体外受损神经元的保护效果测试结果图；

图6应用例6体外受损神经元的保护效果测试结果图；

图7应用例1对体内tuj1蛋白表达的影响测试结果图；

图8应用例2对体内tuj1蛋白表达的影响测试结果图；

图9应用例3对体内tuj1蛋白表达的影响测试结果图；

图10应用例4-6对体内tuj1蛋白表达的影响测试结果图；

图11应用例1对体内gfap蛋白表达的影响测试结果图；

图12应用例2对体内gfap蛋白表达的影响测试结果图；

图13应用例3对体内gfap蛋白表达的影响测试结果图；

图14应用例4-6对体内gfap蛋白表达的影响测试结果图；

图15应用例1共济失调调节测试转棒试验测试结果图；

图16应用例2共济失调调节测试转棒试验测试结果图；

图17应用例3共济失调调节测试转棒试验测试结果图；

图18应用例4-6共济失调调节测试转棒试验测试结果图；

图19应用例1共济失调调节测试翻转试验测试结果图；

图20应用例2共济失调调节测试翻转试验测试结果图；

图21应用例3共济失调调节测试翻转试验测试结果图；

图22应用例4-6共济失调调节测试翻转试验测试结果图；

图23采用fluorojadeb染色技术对应用例1脑片中退行性神经细胞染色测试结构图；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术实施例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

本发明实施例及应用例材料及仪器选取如下：

实验动物：

c57bl6/j(spf级、雄性、8-10月龄、体重22±3g)购于斯贝福动物有限公司。

试剂：

mtt粉末购于索莱宝公司；

fluorojadeb染料购于merck；

tuj1、gfap一抗购于cst；

无水乙醇购于安利隆；ecl发光液购于millipore；

一抗稀释液购于碧云天；

goatanti-mouseigg(h&l)-hrpconjugated购于柏奥易杰；

oct包埋剂购于樱花；

伊红、苏木素染色液购于索莱宝；

tunel染色液购于碧云天；

设备：

co2培养箱型号：thermo-bb15；

酶标仪型号：mr-96a；

倒置荧光显微镜型号：leicadmil；

转棒仪型号：智鼠多宝db024；

冰冻切片机型号：leica1950；

化学发光成像系统型号：tonon4800；

数据处理软件：graphpadprism6。

实施例1

所述纳米金属硫化物采用包括如下步骤的方法制备：

步骤1，将氯化铁与乙二醇按摩尔比为1:237溶解，得反应液a；

步骤2，向反应液a中加入醋酸钠，搅拌使其溶解，得反应液b，反应液b中醋酸钠浓度为0.7mol/l；

步骤3，向反应液b中加入l-半胱氨酸，搅拌使其溶解，得反应液c，反应液c中l-半胱氨酸浓度为0.04mol/l；

步骤4，将反应液c加热200℃，反应12h制备得到纳米硫化铁混合物。

应用例1

将实施例1制备的纳米硫化铁混合物用于制备乙醇急性中毒恢复药物。为了说明其有益效果，特做出如下检测：

纳米金属硫化物对体外受乙醇损伤的神经细胞的保护

采用mtt法检测体外细胞存活率。将sh-sy5y神经母瘤细胞按5e6的细胞密度均匀铺在96孔板中，每孔100μl。放置到含5％co2，37℃培养箱中培养4h后吸掉原有的培养基，加入含500mm乙醇的新鲜培养基对sh-sy5y神经母瘤造成损伤，同时加入0、7、9、11、13、15μg/ml六个浓度的纳米硫化铁混合物，将细胞板放回培养箱中继续培养24h。第二天吸出培养基，加入100μl，1mg/ml的mtt溶液，放入培养箱中继续培养4h，吸出mtt，加入150μldmso溶解甲瓒，用酶标仪检测490nm波长下的吸光值。

实验结果如附图1：加入500mm乙醇会造成神经母瘤细胞40％以上的死亡，而给予纳米硫化铁混合物后，神经母瘤细胞存活率与纳米硫化物混合物浓度呈现出剂量依赖性关系，神经母瘤细胞存活率提高了10％以上，说明纳米硫化铁混合物能提高体外受损神经细胞的存活率。

纳米金属硫化物对急性乙醇中毒后的受损神经细胞的保护

采用fluorojadeb染色技术对脑片中退行性神经细胞染色，退行性神经元呈亮绿色。本次动物实验选用spf级的9～10周龄的c57bl/6j小鼠。采用灌胃方法将浓度为0.5mg/ml纳米硫化铁混合物按2.5mg/kg的剂量给到小鼠体内，10min后采用腹腔注射法将25％乙醇按2.2g/kg的剂量给到小鼠体内。3h后进行心脏灌注。将灌流后的鼠脑取出，一定要小心，避免伤到脑组织。4％pfa浸泡过夜，20％、30％蔗糖溶液分别浸泡一天，40％蔗糖溶液浸泡2-3d。采用冰冻切片切取厚度为15μm的脑片。fjb染色：将切片浸入其中无水乙醇5min，然后在70％乙醇中漂洗2min，在30％乙醇中再漂洗2min，最后在蒸馏水中保持2min。然后将切片放入0.06％高锰酸钾溶液孵育30min。流水冲洗2min，将切片转移到一个以0.1％乙酸溶解的0.0004％的fluorojadebchemicon)溶液中。用蒸馏水洗3次，每次1min。在二甲苯中澄清2min，盖上dpx非荧光安装介质。在nikoneclipsee600荧光显微镜下可视化使用520nm荧光素滤光片组。

实验结果如附图7：scarebar为100μm。从附图2中可可看出急性乙醇组的退行性神经元最多，而给予纳米硫化铁混合物的治疗组，退行性神经元的数量减少，说明纳米硫化铁混合物能保护由急性乙醇中毒造成的脑中神经元的损伤。

采用westernblot技术检测成熟神经元细胞标志物tuj1蛋白的表达。本次动物实验选用spf级的9～10周龄的c57bl/6j小鼠。采用灌胃方法将浓度为0.5mg/ml纳米硫化铁混合物按2.5mg/kg的剂量给到小鼠体内，10min后采用腹腔注射法将25％乙醇按2.2g/kg的剂量给到小鼠体内。3h后进行心脏灌注，按常规方法提取总蛋白。配制12％的sds-page胶，分离蛋白样品。采用湿转法将蛋白转移至pvdf膜上，5％脱脂牛奶封闭1h，tuj1一抗孵育1h，tbst洗膜3次，每次5min，加入二抗孵育1h，tbst洗膜3次，每次5min，滴加显影液，用化学发光成像系统曝光成像。

实验结果如附图11：急性乙醇组tuj1表达明显低于正常组，给予纳米硫化铁混合物的治疗组tuj1表达相较于急性乙醇对比例2增多。

纳米金属硫化物对急性乙醇中毒诱发的脑中炎症的缓解作用

脑内发生炎症时，星形胶质细胞会被过度活化，产生一系列的促炎因子，从而诱发炎症。采用westernblot技术检测星形胶质细胞活化标志物gfap蛋白的表达。本次动物实验选用spf级的9～10周龄的c57bl/6j小鼠。采用灌胃方法将浓度为0.5mg/ml纳米硫化铁混合物按2.5mg/kg的剂量给到小鼠体内，10min后采用腹腔注射法将25％乙醇按2.2g/kg的剂量给到小鼠体内。3h后进行心脏灌注，按常规方法提取总蛋白。配制12％的sds-page胶，分离蛋白样品。采用湿转法将蛋白转移至pvdf膜上，5％脱脂牛奶封闭1h，gfap一抗孵育1h，tbst洗膜3次，每次5min，加入二抗孵育1h，tbst洗膜3次，每次5min，滴加显影液，用化学发光成像系统曝光成像。

实验结果如附图15：急性乙醇对比例2的gfap表达高于正常组，给予纳米硫化铁混合物的治疗组gfap表达相较于急性乙醇对比例2降低，说明纳米硫化铁混合物对急性乙醇中毒诱发的脑中炎症具有缓解作用。

纳米金属硫化物对急性乙醇中毒后的小脑共济失调的改善

采用翻转实验和平衡实验对纳米硫化铁混合物对小脑共济失调的改善作用进行试验。本实验采用的小鼠为8～10周龄的c57bl/6j。采用灌胃方法将浓度为0.5mg/ml纳米硫化铁混合物按2.5mg/kg的剂量给到乙醇中毒小鼠体内，30min后相继进行翻转实验和平衡实验进行测试。

翻转实验：将小鼠置于25×30cm的铁网中心，铁网距离地面50cm高，迅速将铁网翻转，测量小鼠爬到顶部的时间。

实验结果如附图19：乙醇中毒的鼠在翻转试验中，很难从铁网中心爬往顶端，容易从铁网掉落，在悬空垂直的铁网上的时间降低，而给予纳米硫化铁混合物的鼠在铁网上的时间相较于只给予乙醇组的鼠有所提高，说明纳米硫化铁混合物能提高乙醇中毒鼠的平衡能力。

转棒实验：加速旋转杆装置(直径：3cm)的悬杆上评估旋转杆的性能，旋转杆装置以1至23rpm的恒定速率加速300秒。小鼠连续训练5天，并将它们放在棒上进行3次试验。记录每次试验的时间。当鼠标从旋转杆上脱落或时间达到300秒后，试验结束。每次试验之间允许休息180秒。

实验结果如附图23：乙醇中毒的鼠在转棒试验中运动时间相较于正常组的鼠降低了一倍，而给予纳米硫化铁混合物的鼠运动时间相较于只给乙醇组的鼠的运动时间显著提高，说明纳米硫化铁混合物能提高乙醇中毒鼠的运动能力。

应用例2-4

应用例2-4与应用例1相比较，仅仅是纳米金属硫化物混合物的具体选择不同，参数见表1：

表1纳米金属硫化物的选择-1

应用例5-6

应用例4-6与应用例1相比较，仅仅是纳米金属硫化物的具体选择不同，参数见表2：

表2纳米金属硫化物的选择-2

为了进一步说明本发明的有益效果，探究不同材料选择对效果的影响，特设置对比例1-2，对比例1为相同类别的正常细胞和小鼠(正常组)。对比例2与对比例1相比，仅仅是不加入纳米金属硫化物(中毒对照组)。

将对比例1-2及应用例2-6重复应用例1的测试实验，测试结果如表3：

表3测试结果汇总表

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。