一种抗炎中药组合物及其应用

1.本发明涉及中药组合物领域，具体的说，涉及一种抗炎中药组合物及其应用。


背景技术：

2.鼻炎是鼻内粘膜处发生的刺激反应，或者说是炎症反应。其常见症状有鼻塞、流鼻涕、打喷嚏和鼻痒。炎症是由病毒、细菌、刺激物或过敏原引起的。最常见的鼻炎是过敏性鼻炎，通常由空气中的过敏原如花粉和皮屑引起。鼻炎属于一种高发病率的疾病，但目前尚无比较好的治疗方法。
3.鼻炎发生过程中，巨噬细胞作为抗原呈递细胞呈递过敏原的同时，也会在激活后分泌大量细胞因子和趋化因子，以招募更多炎症细胞参与到病理过程中。这里的细胞因子和趋化因子是指参与炎症反应的各种蛋白分子，比如趋化因子ccl家族、cxcl家族，白介素il家族，集落刺激因子csf家族，肿瘤坏死因子tnf家族等。常见的炎症细胞因子包括白细胞介素6(il-6)、白细胞介素1b(il-1b)以及肿瘤坏死因子(tnf-α)等，他们是主要影响炎症进程的细胞因子。tnf-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎症介质，它可诱导il-6细胞因子的释放，且能刺激细胞释放炎性介质如no、氧自由基等；il-1b参与包括细胞增殖，分化和凋亡在内的多种炎症细胞活动。
4.此外，肥大细胞作为包括过敏性鼻炎在内的一型过敏反应发生过程中的主导细胞，在鼻炎发生后，肥大细胞除了产生il-6、il-1b等炎症因子外，还会产生il-4、il-13、ccl2等一型过敏反应相关的细胞因子。
5.研究表明，以il-6、il-1b和tnf-α为代表的炎症细胞因子介导和参与许多疾病的病理生理过程。不仅急性感染中炎症因子大量表达，糖尿病、心血管疾病及肿瘤等慢性疾病也被认为有慢性炎症的参与。因此，开发具有抑制炎症细胞因子、炎性介质表达的药物，对于炎症疾病、过敏性疾病的治疗和临床应用十分必要。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于如何提供一种具有抑制炎症细胞因子、炎性介质表达的药物。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供一种抗炎中药组合物，所述抗炎中药组合物的活性成分由中药原料制成，所述中药原料由火麻仁、干姜、陈皮和大青叶组成。
8.其中，按照重量比例计算，所述中药原料的组成如下：火麻仁10-80重量份、干姜5-75重量份、陈皮5-75重量份和大青叶10-80重量份。
9.进一步，所述中药原料包括火麻仁100重量份、干姜6.25-750重量份、陈皮6.25-750重量份和大青叶12.5-800重量份。
10.进一步，所述中药原料包括火麻仁100重量份、干姜100重量份、陈皮100重量份和大青叶100重量份。
11.所述抗炎中药组合物具有下述至少一种功能：
12.1)降低炎症细胞因子基因的表达；
13.2)抑制炎性细胞的炎症介质释放量；
14.3)治疗或者辅助治疗鼻炎疾病。
15.所述降低炎症细胞因子基因的表达可为降低巨噬细胞的炎症细胞因子基因的表达，也可以为降低肥大细胞(hmc-1)的炎症细胞因子基因的表达。
16.所述炎症细胞因子基因可为tnf-α基因和/或il-6基因和/或ccl2基因。
17.所述炎性介质可以为血管内皮舒张因子no。
18.本发明还要求保护一种药物，所述药物包括上述抗炎中药组合物。
19.本发明提供一种中药组合物的制备方法，包括用乙醇水溶液提取所述中药原料，收集提取液，得到所述抗炎中药组合物。
20.其中，所述乙醇水溶液为90％乙醇水溶液。
21.其中，所述方法包括将所述提取液进行浓缩并干燥得到粉末的步骤。
22.其中，所述方法包括按照火麻仁10-80重量份、干姜5-75重量份、陈皮5-75重量份和大青叶10-80重量份的比例称取重要，之后进行索氏提取，将提取液进行浓缩干燥得到抗炎重要组合物。
23.所述提取方法为索氏提取法，所述索氏提取的时间为3小时，所述乙醇水溶液与中药原料的配比为每150ml乙醇水溶液中加入10g药粉。
24.所述方法还包括提取前将药材粉碎至80-100目粉末，再进行提取。
25.本发明还要求保护一种药物，所述药物包括上述中药组合物的制备方法制备的重要组合物。
26.所述中药组合物或者中药组合物的制备方法在制备抑制炎症细胞因子表达药物中的应用。
27.所述降低炎症细胞因子基因的表达可为降低巨噬细胞的炎症细胞因子基因的表达，也可以为降低肥大细胞(hmc-1)的炎症细胞因子基因的表达。
28.所述炎症细胞因子基因可为tnf-α基因和/或il-6基因和/或ccl2基因。
29.所述炎性介质可以为血管内皮舒张因子no。
30.以上述药物组合物为活性成分制成的药物也属于本发明的保护范围。通过将上述药物组合物，直接制备或者加入药学上可以接受的辅料后制备，可制成任何药学上可以接受的剂型。以口服剂型为例包括：胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、滴丸剂、缓控释制剂、口服液、合剂和糖浆剂；以外用制剂为例包括：软膏剂、栓剂、贴剂、酒剂、酊剂、凝胶剂、搽剂、气雾剂、喷雾剂和涂膜剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。当上述药物作为治疗鼻炎的药物时的给药方式可以为口服、鼻滴或者喷雾。
31.所述抗炎中药组合物或者抗炎中药组合物的制备方法在制备抑制炎性介质释放药物中的应用。本发明的抗炎中药组合物在所述的药物在在制备或者开发抗炎症药物中的应用，所述炎症是无菌性炎症，优选的所述无菌性炎症是过敏性炎症，优选的所述过敏型炎症为i型过敏反应。本发明的抗炎中药组合物在鼻炎疾病治疗和辅助治疗方面应用。上述应用也应在本发明的保护范围之内。
32.上述药物的剂型可以为汤剂、片剂或者丸剂。
33.本发明所述中药组方的功能主治为：温肺散寒、健脾理气。适用于鼻炎、过敏性鼻
炎，临床表现为遇到花粉或尘螨、冷空气等而引发的连续性喷嚏、鼻痒、鼻塞、流鼻涕等。其组方方解即作用机理为：本方温肺散寒、健脾理气。方中干姜温中散寒，温肺化饮，故本方用之为君药。陈皮理气健脾，燥湿化痰，为臣药。大青叶清热解毒，凉血消斑，火麻仁润肠通便，共为佐药。诸药合用，共奏温肺散寒、健脾理气之效。
34.本发明的抗炎中药组合物，能够在多个炎症细胞中抑制炎症因子表达；也能够抑制炎性介质的释放。能够显著抑制炎症因子如il-6、tnf-α和ccl2的表达，抑制血管内皮舒张因子no的产生。
附图说明
35.图1为中药组方对炎症细胞因子基因il-6表达的影响。
36.图2为中药组方对炎症细胞因子基因tnf-α表达的影响。
37.图3为中药组方对no含量的影响。
38.图4为中药组方对炎症细胞因子基因il-6表达的影响。
39.图5为中药组方对炎症细胞因子基因ccl2表达的影响。
40.图6为不同配比的中药组方对炎症细胞因子il-6表达的影响。
具体实施方式
41.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
42.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
43.实施例1
44.中药组合物的制备
45.1.制备1号抗炎中药组合物
46.将火麻仁、干姜、陈皮、大青叶粉碎成80-100目粉末，将火麻仁2.5g、干姜2.5g、陈皮2.5g、大青叶2.5g混合得到混合物粉末，加入150ml的90％乙醇水溶液(135ml无水乙醇加入15ml去离子水，摇匀制得)，标准索氏提取3h，索氏提取温度78.5℃干燥20min，收集得到15ml左右提取液，提取液45度浓缩至体积为2-3ml，转移至冻干机减压冻干24h制成提取物冻干粉，该冻干粉即为1号抗炎中药组合物。
47.称取50mg抗炎中药组合物，溶于1mldmso中制成1号抗炎中药组合物母液，-20℃保存，以供后续实验使用。
48.2.制备2-6号抗炎中药组合物
49.2.1将火麻仁粉碎成80-100目粉末，加入150ml的90％乙醇水溶液，标准索氏提取3h，将提取液浓缩20min至体积为2ml，转移至冻干机减压冻干24h，制成火麻仁提取物冻干粉。
50.2.2将步骤2.1中的火麻仁替换为干姜，相同的方法，得到干姜提取物冻干粉。
51.2.3将步骤2.1中的火麻仁替换为陈皮，相同的方法，得到陈皮提取物冻干粉。
52.2.4将步骤2.1中的火麻仁替换为大青叶，相同的方法，得到大青叶提取物冻干粉。
53.2.5按照表1中的重量比例，一次称取步骤2.1-2.4中制备火麻仁提取物冻干粉、干姜提取物冻干粉、陈皮提取物冻干粉和大青叶提取物冻干粉，得到2号抗炎中药组合物、3号抗炎中药组合物、4号抗炎中药组合物、5号抗炎中药组合物和6号抗炎中药组合物。将2号抗炎中药组合物溶于1mldmso中得到2号抗炎中药组合物母液；将3号抗炎中药组合物溶于1mldmso中得到3号抗炎中药组合物母液；将4号抗炎中药组合物溶于1mldmso中得到4号抗炎中药组合物母液；将5号抗炎中药组合物溶于1mldmso中得到5号抗炎中药组合物母液；将6号抗炎中药组合物溶于1mldmso中得到6号抗炎中药组合物母液。
54.表1不同配比的中药组方称量重量
[0055][0056]
实施例3
[0057]
1号抗炎中药组合物对炎症细胞因子il-6、tnf-α表达的影响
[0058]
利用qpcr技术，检测实施例1中的1号抗炎中药组合物对炎症细胞因子il-6、tnf-α表达的影响，具体包括如下步骤：
[0059]
1.thp1细胞(国家实验细胞资源共享服务平台)以40万/孔铺于12孔板中，同时加入100ng/ml pma(sigma)处理细胞24h，将细胞诱导为巨噬细胞，此时细胞由悬浮状态转变为贴壁状态。
[0060]
2.实验设3组，分别为诱导+抗炎组、对照组和诱导组。每组设5次生物重复，无技术重复。
[0061]
诱导+抗炎组(formula)：向步骤1中的部分细胞悬液中加入实施例1的1号抗炎中药组合物母液和脂多糖lps(一种革兰氏阴性菌细胞壁外壁的组成成分,用于刺激炎症发生，源叶生物)，使1号抗炎中药组合物的含量为100μg/ml，使lps的含量为1μg/ml，37℃培养24h。作为诱导+抗炎组；
[0062]
对照组(control)：向步骤1中的部分细胞悬液中加入与1号抗炎中药组合物母液等体积的溶剂dmso，37℃培养1h，作为对照组；
[0063]
诱导组(lps组)：向步骤1中的部分细胞悬液中加入与1号抗炎中药组合物母液等体积的溶剂dmso，并加入lps使lps的含量为1μg/ml，37℃培养24h，作为诱导组。
[0064]
3.利用试剂盒分别提取诱导+抗炎组、对照组、诱导组中细胞的rna并反转为cdna。
[0065]
4.以步骤3中得到的cdna为模板，使用il-6引物(il-6-f:actcacctcttcagaacgaattg(序列1)；il-6-r:ccatctttggaaggttcaggttg(序列2))对进行qpcr反应，程序：95℃，3min；(95℃，3s；60℃，30s)40个循环。以空白对照组的基因表达量为1，药物处理组基因表达量大于1为基因表达上调，小于1为下调。qpcr五次实验结果见表2、图1和图2。
[0066]
5.以步骤3中得到的cdna为模板，分别使用tnf-α引物(tnf-α-f:
cctctctctaatcagccctctg(序列3)；tnf-α-r:gaggacctgggagtagatgag(序列4))对进行qpcr反应，程序：95℃，3min；(95℃，3s；60℃，30s)40个循环。以空白对照组的基因表达量为1，药物处理组基因表达量大于1为基因表达上调，小于1为下调。qpcr五次实验结果见表2、图1和图2。
[0067]
表2实施例2中3组实验组的qpcr结果
[0068][0069][0070]
注：表中的数值为基因表达量的平均值。
[0071]
本实施例以thp1细胞为例，thp1是人单核细胞系，在pma作用下可体外诱导分化为巨噬细胞。在正常情况下，巨噬细胞的炎症因子表达量处于一个很低的水平，即图1和图2中所示对照组。在鼻炎等炎症发生过程中，巨噬细胞表达的炎症因子水平迅速升高，本实施例中用lps诱导巨噬细胞分泌大量炎症因子，旨在模拟人体内炎症发生的病态过程，即图1和图2中所示lps组。在lps诱导的基础上，再加入抗炎方粗提物加以“治疗”，细胞表达的炎症水平又降低到正常水平，即图1和图2中所示诱导+抗炎组。结合图1-2和表2，qpcr结果显示，实施例1的1号抗炎中药组合物可以显著下调炎症细胞因子基因il-6和tnf-α的表达。
[0072]
实施例4
[0073]
1号抗炎中药组合物对炎症细胞因子il-6、ccl2表达的影响
[0074]
利用qpcr技术，检测实施例1中的抗炎中药组合物对炎症细胞因子il-6、ccl2表达的影响，具体包括如下步骤：
[0075]
1.hmc-1细胞以30万/孔铺于12孔板中，得到细胞悬液；
[0076]
2.实验设3组，分别为诱导+抗炎组、对照组和诱导组。每组设5次生物重复。
[0077]
诱导+抗炎组(formula)：向步骤1中的部分细胞悬液中加入实施例1的抗炎中药组合物母液、pma和a23187(abcam，用于刺激炎症发生)，使抗炎中药组合物的含量为100μg/ml，pma的浓度为50nm，a23187的浓度为1μm，37℃培养6h，作为诱导+抗炎组；
[0078]
对照组(control)：向步骤1中的部分细胞悬液中加入与抗炎中药组合物母液等体积的溶剂dmso，37℃培养1h，作为对照组；
[0079]
诱导组(pma+a23187)：向步骤1中的部分细胞悬液中加入溶剂dmso，并加入pma和a23187，使pma的浓度为50nm pma，a23187(用于刺激炎症发生)的浓度为1μm，37℃培养6h，作为诱导组。
[0080]
3.利用试剂盒分别提取诱导+抗炎组、对照组、诱导组中细胞的rna并反转为cdna。
[0081]
4.以步骤3中得到的cdna为模板，分别使用表3中引物对进行qpcr反应，qpcr反应程序：95℃，3min；(95℃，3s；60℃，30s)40个循环。
[0082]
表3，实施例1中的引物序列为：
[0083][0084][0085]
5.数据处理：以空白对照组的基因表达量为1，药物处理组基因表达量大于1为基因表达上调，小于1为下调。qpcr四次实验结果见表4、图3和图4。
[0086]
表4实施例4中3组实验组的qpcr结果
[0087]
基因il-6ccl2对照组1.221.03诱导组6.94206.40诱导+抗炎组3.7024.17
[0088]
注：表中的数值为基因表达量的平均值。
[0089]
本实施例以hmc-1细胞为例，hmc-1是人肥大细胞系，肥大细胞在人体发生一型过敏反应过程中，发挥主导作用。在正常情况下，肥大细胞的炎症因子表达量处于一个很低的水平，即图3和图4所示对照组。在鼻炎等炎症发生过程中，肥大细胞表达的炎症因子水平迅速升高，本实施例使用pkc激活剂pma和钙离子载体a23187组合来诱导肥大细胞分泌大量炎症因子，旨在模拟人体内过敏反应发生的病态过程，即图3和4所示pma+a23187组。在诱导的基础上，再加入1号抗炎中药组合物加以“治疗”，细胞表达的炎症水平又降低到正常水平，即图3和4所示诱导+抗炎组。结合图3-4和表4，qpcr结果显示，实施例1的1号抗炎中药组合物可以显著下调炎症细胞因子基因il-6和ccl2的表达。
[0090]
实施例5
[0091]
1号抗炎中药组合物对炎症细胞的血管内皮舒张因子no释放量的影响
[0092]
利用硝酸还原法，检测中药组方提取物对炎症细胞内血管内皮舒张因子no含量的影响，具体实验过程为：
[0093]
1.raw264.7细胞(国家实验细胞资源共享服务平台)以40万/孔铺于12孔板中，得到细胞悬液。
[0094]
2.实验设3组，分别为诱导+抗炎组、对照组和诱导组。每组设5次生物重复。
[0095]
诱导+抗炎组(formula)：向步骤1中的部分细胞悬液中实施例1的1号抗炎中药组合物母液和lps，使抗炎中药组合物的含量为100μg/ml，使lps的含量为1μg/ml，37℃培养24h。作为诱导+抗炎组；
[0096]
对照组(control)：向步骤1中的部分细胞悬液中加入与1号抗炎中药组合物母液等体积的溶剂dmso，37℃培养1h，作为对照组；
[0097]
诱导组(lps组)：向步骤1中的部分细胞悬液中加入与1号抗炎中药组合物母液等体积的溶剂dmso，并加入lps使lps的含量为1μg/ml，37℃培养24h，作为诱导组。
[0098]
3.分别提取诱导+抗炎组、对照组、诱导组中的培养基上清，与试剂盒试剂反应，用酶标仪在550nm读数，计算no含量(单位μmol/l)。五次实验结果见表5和图5。
[0099]
表5实施例5中3组实验组的no结果
[0100] no含量对照1.00诱导11.84诱导+抗炎5.08
[0101]
本实施例以raw264.7细胞为例，raw264.7是小鼠巨噬细胞系。在正常情况下，巨噬细胞几乎不释放no，即图5所示对照组。在鼻炎等炎症发生过程中，巨噬细胞释放的no迅速增多，本实施例中用lps诱导巨噬细胞产生大量no，旨在模拟人体内炎症发生的病态过程，即图5所示lps组。在lps诱导的基础上，再加入抗炎方粗提物加以“治疗”，细胞释放的no又降低到正常水平，即图5所示诱导+抗炎组。结合表5和图5中的数据，no检测结果显示，1号中药组抗炎方提取物可以下调炎症细胞释放的no含量。
[0102]
实施例6
[0103]
按照实施例3中方法，利用qpcr技术，检测实施例1中的2-6号抗炎中药组合物对炎症细胞因子il-6、tnf-α表达的影响，具体包括如下步骤：
[0104]
1.thp1细胞(国家实验细胞资源共享服务平台)以40万/孔铺于12孔板中，同时加入100ng/ml pma(sigma)处理细胞24h，将细胞诱导为巨噬细胞，此时细胞由悬浮状态转变为贴壁状态。
[0105]
2.实验设3组，分别为诱导+抗炎组、对照组和诱导组。每组设5次生物重复，无技术重复。
[0106]
诱导+抗炎组1(简称2号抗炎中药组合物)：向步骤1中的部分细胞悬液中加入实施例1的2号抗炎中药组合物母液和脂多糖lps(一种革兰氏阴性菌细胞壁外壁的组成成分,用于刺激炎症发生，源叶生物)，使2号抗炎中药组合物的含量为100μg/ml，使lps的含量为1μg/ml，37℃培养24h。
[0107]
诱导+抗炎组2(简称3号抗炎中药组合物)：向步骤1中的部分细胞悬液中加入实施例1的3号抗炎中药组合物母液和脂多糖lps(一种革兰氏阴性菌细胞壁外壁的组成成分,用于刺激炎症发生，源叶生物)，使3号抗炎中药组合物的含量为100μg/ml，使lps的含量为1μg/ml，37℃培养24h。
[0108]
诱导+抗炎组3(简称4号抗炎中药组合物)：向步骤1中的部分细胞悬液中加入实施例1的4号抗炎中药组合物母液和脂多糖lps(一种革兰氏阴性菌细胞壁外壁的组成成分,用于刺激炎症发生，源叶生物)，使4号抗炎中药组合物的含量为100μg/ml，使lps的含量为1μg/ml，37℃培养24h。
[0109]
诱导+抗炎组4(简称5号抗炎中药组合物)：向步骤1中的部分细胞悬液中加入实施例1的5号抗炎中药组合物母液和脂多糖lps(一种革兰氏阴性菌细胞壁外壁的组成成分,用于刺激炎症发生，源叶生物)，使5号抗炎中药组合物的含量为100μg/ml，使lps的含量为1μg/ml，37℃培养24h。
[0110]
对照组(control)：向步骤1中的部分细胞悬液中加入与1号抗炎中药组合物母液等体积的溶剂dmso，37℃培养1h，作为对照组；
[0111]
诱导组(lps组)：向步骤1中的部分细胞悬液中加入与1号抗炎中药组合物母液等体积的溶剂dmso，并加入lps使lps的含量为1μg/ml，37℃培养24h，作为诱导组。
[0112]
3.利用试剂盒分别提取诱导+抗炎组、对照组、诱导组中细胞的rna并反转为cdna。
[0113]
4.以步骤3中得到的cdna为模板，使用il-6引物(il-6-f:actcacctcttcagaacgaattg(序列1)；il-6-r:ccatctttggaaggttcaggttg(序列2))对进行qpcr反应，程序：95℃，3min；(95℃，3s；60℃，30s)40个循环。以诱导组(lps组)的基因表达量为1，药物处理组基因表达量大于1为基因表达上调，小于1为下调。结果如表6和图6所示。
[0114]
表6中药组方对il6基因的调控结果
[0115]
分组第一次第二次第三次平均值ttestlps组1.00001.00001.00001.0000 2号抗炎中药组合物0.30490.16080.19430.22000.00313号抗炎中药组合物0.28420.11390.16680.18830.00384号抗炎中药组合物0.25810.13680.09270.16250.00355号抗炎中药组合物0.15460.19700.49070.28080.02096号抗炎中药组合物0.21560.12630.16470.16890.001
[0116]
本实施例以thp1细胞为例，thp1是人单核细胞系，在pma作用下可体外诱导分化为巨噬细胞。在正常情况下，巨噬细胞的炎症因子表达量处于一个很低的水平。在鼻炎等炎症发生过程中，巨噬细胞表达的炎症因子水平迅速升高，本实施例中用lps诱导巨噬细胞分泌大量炎症因子，旨在模拟人体内炎症发生的病态过程，即图6中所示lps组。在lps诱导的基础上，再加入抗炎方粗提物加以“治疗”，细胞表达的炎症水平又降低到正常水平，即图6中所示不同比例的抗炎方组。结合图6和表6，qpcr结果显示，实施例2的2-6号抗炎中药组合物均可以显著下调炎症细胞因子基因il-6和的表达，即不同比例的中药组合物均可以显著下调炎症细胞因子表达。
[0117]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。