一种复合中药微生态组合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及免疫微生态领域，具体涉及一种复合中药微生态组合物及其制备方法和应用。
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部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。鸡毒支原体病作为鸡呼吸道疾病之一，给养殖业及畜牧业造成了巨大的经济损失。目前，该病主要采用抗生素及疫苗对其进行预防与治疗，无论是抗生素还是疫苗都存在着弊端。抗生素所带来的弊端包括:(1)细菌耐药性问题；(2)破坏机体免疫力；(3)严重的食品和安全隐患。传统疫苗的使用暴露出的问题有:(1)应激大诱发其他疾病的发生；(2)容易出现变异株；(3)动物出现返毒；(4)免疫效果不理想等等。中药因其疗效好、无副作用、无残留及增强机体免疫力等特点被广泛用于防治畜禽各种疾病，其中包括呼吸道疾病。益生菌具有安全、无污染、无残留、预防疾病等特点，能够显著提高饲料转化率和动物的生产性能，是替代饲用抗生素等化学合成物质首选的绿色饲料添加剂，近年来，益生菌在呼吸内科和危重症疾病中的应用研究取得了较大的进展。有研究证实，益生菌和中草药在提高机体免疫力及防治疾病方面相辅相成。目前，中药类多以粉碎后直接添加拌料用于防治动物疾病，其有效成分不能充分利用，再加上鸡的消化道比较短，不能对其有效成分进行吸收利用，造成了极大的浪费，增加了用药成本。技术实现要素：因此，本发明的目的是提供一种复合中药微生态组合物及其制备方法和应用，该复合中药微生态组合物具有较好的防治鸡毒支原体感染的作用，同时可提高鸡只免疫力，增强抗病能力，增加经济效益。具体地，本发明的技术方案如下所述：在本发明的第一方面，提供了一种复合中药微生态组合物，其以中药复方和益生菌为原料，其中，所述益生菌为植物乳杆菌和/或其发酵物；所述中药复方包含黄连、黄柏、金荞麦和鱼腥草；所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)blcc2-0125，于2020年4月24日保存于中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏编号为cctccno：m2020078。所述植物乳杆菌blcc2-0125可在mrs培养基上生长，该菌株具有细胞表面疏水性、较好的细胞粘附性、自凝聚(自聚合)能力(2h自凝聚率接近50％)、高产胞外多糖(发酵培养24小时后，胞外多糖产量可达996.67mg/l)、耐酸(在ph2.5、ph3.0以及ph6.0时存活率分别达到45％和90％和100％，可在ph大于2.0的环境下存活)、耐胆盐(在禽胆盐0.1％培养4h，存活率为92.1％，禽胆盐浓度为0.3％时仍可存活)、对胰蛋白酶及胃蛋白酶均有较强的耐受性(胰蛋白酶液中处理2h，4h后，存活率分别为92％和76％)、传代稳定性良好(连续传5代、10代、15代、20代培养物形态均为革兰氏染色阳性杆菌，活菌含量不同代次之间相差不大，发酵液ph值均在4.15左右)。本发明的植物乳杆菌blcc2-0125具有较好的免疫功能，在免疫抑制(以环磷酰胺制备免疫抑制模型)实验中，使用了本发明植物乳杆菌的动物相较于空白组、模型组、阳性药左旋咪唑对照组体重在灌胃5天后稳步增长，胸腺指数、脾脏指数相较于模型组均显著增加，脾脏指数与空白组无显著差异；在动物血清细胞因子检测实验中，相较于模型组(以环磷酰胺制备免疫抑制模型)，使用了本发明所述植物乳杆菌的动物血清中的il-2水平、ifn-γ水平、igg水平均显著提高，表明口服本发明的植物乳杆菌能够提高免疫抑制动物的血清il-2、ifn-γ和igg的水平。并且，本发明的植物乳杆菌blcc2-0125能够防治(预防和治疗，尤其预防)鸡毒支原体感染，同时对低致病性禽流感(h9n2)也有预防作用。此外，本发明的植物乳杆菌blcc2-0125具有较好的安全性，在动物经口急性毒理试验中，使用了本发明的植物乳杆菌的动物体重在给药后能够正常增长，表明口服本发明的植物乳杆菌具有安全性。本发明中所述各味中药的药性包括：黄连：性味寒凉，清热燥湿，泻火解毒之功效。黄柏：性味苦寒，有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮之功效。金荞麦：味酸、苦，性寒。归肺、胃、肝经。清热解毒；活血消痈；祛风除湿。主治肺痈；肺热咳喘；咽喉肿痛；痢疾；风湿痹证；跌打损伤；痈肿疮毒。鱼腥草：味辛，性寒凉，归肺经。能清热解毒、消肿疗疮、利尿除湿、清热止痢、健胃消食，用治实热、热毒、湿邪、疾热为患的肺痈、疮疡肿毒、痔疮便血、脾胃积热等。具有抗菌、抗病毒、提高机体免疫力、利尿等作用。本发明的中药经复配后具有一定的防治鸡毒支原体感染的作用，能够降低感染鸡毒支原体的鸡的死亡率，减少对气囊的损伤，能够在一定程度上提升鸡的免疫力，提升血清中igg、ifn-γ的水平。在本发明的中药组方中，金荞麦的加入，尤其是金荞麦与鱼腥草的同时加入尤其能够促进上述效果的实现。根据本发明的实施方式，经本发明上述的中药复方与本发明的植物乳杆菌blcc2-0125复配后，能够极大地提升防治鸡毒支原体感染的效果，显示了两者之间的极好的协同作用，特别是，复配后的本发明的复合中药微生态组合物在鸡毒支原体感染的初期就开始发挥作用，抵抗鸡毒支原体的感染，效果十分显著。在本发明的实施方式中，所述植物乳杆菌blcc2-0125和/或其发酵物可通过发酵培养植物乳杆菌blcc2-0125得到。发酵物可以为固体发酵物或者液体发酵液。发酵可采用常规的发酵方法，或者如本发明中某些实施方式中所述的方法进行，比如，在无菌条件下将植物乳杆菌blcc2-0125接种于mrs液体培养基中，37℃恒温培养箱培养16-18h。在本发明的某些实施方式中，所述复合中药微生态组合物中益生菌的活菌数为大于或等于1×109cfu/ml。随着活菌数量的增多，组合物的抑菌效果及治疗效果也会有所增长，但当其活菌浓度为1×109cfu/ml时，即可实现非常理想的效果。在本发明的一些较为优选的实施方式中，所述中药微生态组合物中益生菌的活菌数为1×109cfu/ml～1×1010cfu/ml。在本发明的一些实施方式中，所述中药复方是由以下重量份的原料制成：黄连5-8份、黄柏10-20份、金荞麦10-15份、鱼腥草10-15份。在本发明的一些实施方式中，所述中药复方中黄连的用量可以取5份、6份、7份或8份，黄柏的用量可以取10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份或20份，金荞麦的用量可以取10份、11份、12份、13份、14份或15份，鱼腥草的用量可以取10份、11份、12份、13份、14份或15份；当然，以上示例均为重量份取整的情况，各原料的重量份也可以是上述任意两个整数值之间的任意数值，比如黄连的用量可以取5.5-8份、6-8份或7.5-8份，黄柏的用量可以取10.5-20份、10.5-15份或13.5-20份，金荞麦的用量可以取10.5-15份、10-12.5份或12-14.5份，鱼腥草的用量可以取10.5-15份、10-12.5份或12-14.5份。在一些较优的实施方式中，所述中药复方是由以下重量份的原料制成：黄连6-8份，黄柏15-20份，金荞麦10-12份，鱼腥草10-12份，进一步优选为黄连6份、黄柏15份、金荞麦12份、鱼腥草12份。在本发明的第二方面，提供了一种如上第一方面中所述的复合中药微生态组合物的方法，其包括将中药复方和益生菌混合；其中，所述中药复方为中药提取液，所述益生菌为植物乳杆菌blcc2-0125和/或其发酵物。在本发明的一些实施方式中，所述方法包括：按重量份称取中药复方的原料，混合后加入8-10重量倍的水(即水的加入量为混合药材重量的8-10倍)，浸泡，加热至沸腾，水煎煮至少一次，取滤液浓缩，得复方中药浓缩滤液即中药提取液；向中药提取液中加入益生菌，混合均匀，即得复合中药微生态组合物；其中，所述益生菌可以为益生菌菌液或益生菌菌粉，比如，所述益生菌菌液，可通过发酵培养植物乳杆菌blcc2-0125获得，发酵液经进一步处理比如真空冻干燥操作后获得固体发酵物；或者，进一步地，植物乳杆菌blcc2-0125经发酵后离心可获得菌体，菌体进行真空冷冻干燥，可得益生菌粉；以上所述的真空冷冻干燥过程中可选择加入冻干保护剂，加入的方式可以为在冻干前将发酵液或菌体与冻干保护剂混合。在本发明的一些实施方式中，所述冻干保护剂可采用本领域常规使用的冻干保护剂，比如脱脂乳、蔗糖、甘油等，所述冻干保护剂的加入量可以为本领域的常规用量，或者所述冻干保护剂的加入量为混合原料重量的2-90wt％，优选为5-80wt％，尤其为40-60wt％，例如在本发明的一些实施方式中，以质量份计，所述微生态制剂中，冻干保护剂与菌泥(或菌体)的质量份数分别为120份和100份。在本发明的实施方式中，虽然常规的冻干保护剂在冻干过程中可一定程度的保护本发明的菌体，但在本发明的研究过程中发现，当选用特定组成的冻干保护剂时，能够更好的实现本发明的技术效果。比如，在本发明的一些实施方式中，所述保护剂包括或由以下成分组成：脱脂乳、海藻糖、硫酸锰、蔗糖、异vc钠和葡萄糖；或者，所述保护剂包括或由以下成分组成：脱脂乳、海藻糖、硫酸锰、蔗糖、vc、甘油和葡萄糖。在本发明的一些实施方式中，所述复合中药微生态制剂或复合中药微生态组合物中的益生菌菌粉(冻干粉)中含有的植物乳杆菌blcc2-0125活菌数不低于1.00×1010cfu/g。在本发明较为优选的实施方式中，所述微生态制剂为口服微生态制剂时，所述保护剂包括或由以下成分组成：脱脂乳、海藻糖、硫酸锰、蔗糖、异vc钠和葡萄糖。特别地，在这些实施方式中，所述保护剂中各成分的含量为：脱脂乳1-10重量份、海藻糖1-3重量份、硫酸锰0.1-0.5重量份、蔗糖0.1-0.5重量份、异vc钠0.1-0.5重量份、葡萄糖0-0.5重量份(优选为0.1-0.5重量份)，所述各成分均匀混合后以无菌水溶解即得；在一种推荐的实施方式中，优选预先把保护剂配方中的成分封口包装后辐射灭菌，再按照一定比例溶解于无菌水(比如溶解于100重量份的无菌水)中，置于干热灭菌过的玻璃瓶中备用。在本发明的一些实施方式中，所述水煎煮进行3次，包括：第一次煎煮时间为30-60min，过滤，滤液保留，向滤渣中再加入8-10重量倍的水进行第二次煎煮，煎煮时间为30-60min，过滤，滤液保留，向滤渣中再加入6-8重量倍的水进行第三次煎煮，煎煮时间为30-50min，保留滤液；水煎煮结束后，合并三次滤液。在本发明的第三方面，提供了一种复合中药微生态制剂，其包括如上述第一方面中所述的复合中药微生态组合物。本发明所述复合中药微生态制剂可以为口服液体制剂或口服固体制剂。其中，所述固体制剂使用时可用水送服或溶解于水后直接服用。本发明所述复合中药微生态制剂可根据本发明如上所述的复合中药微生态组合物的制备方法制备得到；或者，在所述本发明所述复合中药微生态组合物的基础上进一步添加其他可接受的辅料或添加剂，辅料和添加剂的作用仅为进一步便于食用或者便于制备成所需的剂型。本领域技术人员可根据需要选择合适的辅料或添加剂并按照本领域的常规方法制备得到所需剂型。在本发明的第四方面，提供了上述第一方面中所述复合中药微生态组合物或上述第三方面中所述的复合中药微生态制剂在制备防治鸡毒支原体或由鸡毒支原体引发的相关疾病的产品中的应用。其中，所述产品为药品、保健品、饲料或者饲料添加剂。相较于现有技术，本发明的有益效果包括：(1)本发明的中药复方与植物乳杆菌blcc2-0125的复配能够很好的防治(预防和治疗)鸡毒支原体的感染，并且在鸡毒支原体感染的初期就开始发挥作用效果十分显著，降低已感染的鸡的死亡率，能够在很大程度上减少气囊损伤，并且能够提高机体免疫力，增强机体抗病能力等功能。(2)本申请的植物乳杆菌具有调节胃肠微生态平衡的作用，进而提高机体的免疫指标；促进盲肠、直肠乳酸杆菌的增殖，抑制大肠杆菌的增殖，调节鸡的肠道菌群。(3)本发明将益生菌与中药联合应用，益生菌和中药在防病促生长方面是相辅相成的。中药可以促进益生菌的增殖，促进益生菌功能的发挥，益生菌可以促进中药的吸收和利用。益生菌和中药复合制剂以它天然无毒、无副作用、无残留、安全、清洁的优势，展示了广阔的发展前景。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：图1：a示出了鸡毒支原体液体培养基培养由澄清透明的玫瑰红色变成黄色半混浊状态(自左至右)；b示出了鸡毒支原体固体培养基培养呈典型的“煎蛋样儿”菌落。图2：a示出了鸡毒支原体瑞士染色结果；b示出了鸡毒支原体姬姆萨染色结果。图3：a示出了分离的鸡毒支原体的pcr鉴定结果；b示出了a中所扩增基因片段的碱基序列与鸡毒支原体16srna的碱基序列的匹配度。图4：鸡毒支原体的纯化过程及纯化产物pcr鉴定结果。图5：鸡毒支原体ccu测定结果。图6：a空白组动物气囊解剖结果，气囊透亮；b模型组动物气囊解剖结果，气囊混浊、增厚，有淡黄色干酪样渗出物。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1具有免疫活性乳酸菌的初筛1材料与方法1.1材料mrs培养基：按质量百分数计算，葡萄糖2.0％、柠檬酸钠0.2％、乙酸钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5％、吐温-800.1％，ph6.0。iec-6细胞(小肠上皮细胞)，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。1.2方法1.2.1菌悬液的制备将山东宝来利来生物工程股份有限公司生物工程研究院菌种保藏中心提供的20株乳酸菌分别接种于mrs液体培养基中，37℃培养16-18h后，4℃3000rpm离心15min，收集菌体，用pbs溶液悬浮菌体后离心，重复3次。1.2.2疏水性乳酸菌的筛选乳酸菌表面疏水性的测定采用微生物黏着碳烃化合物法(bath)。将洗涤后的菌体重新悬浮于0.1mkno3溶液中，使菌体悬液的吸光度(od＝600nm)达到0.5±0.02(a0)，取菌悬液2ml与200μl二甲苯混匀，室温静置10min，涡旋震荡2min后再静置10min，重新形成为两相体系。小心吸取水相，在600nm下测定吸光度(a1)。细胞表面疏水性计算公式：1.2.3乳酸菌黏附性筛选将iec-6细胞复苏后，置于含有dmem完全培养液的培养瓶中，于37℃5％co2培养箱中孵育，传代5次左右进行黏附试验。将iec-6细胞浓度调整至2×104cells/ml，接种于6孔培养板中(预先置入无菌盖玻片)，使细胞贴附盖玻片生长，待细胞培养至致密单层后，用pbs缓冲液漂洗2次，然后每孔加入1mldmem完全培养液和1ml制备好的菌悬液，摇晃混匀，于co2培养箱继续孵育，每株菌重复3孔。培养60min后，取出6孔培养板，用pbs缓冲液洗涤细胞5次(除去未黏附的乳酸菌)，加入无水甲醇固定20min，革兰染色后，显微镜下随机选取20个视野，计100个细胞上黏附的细菌个数，用平均每个细胞所黏附的细菌个数表示黏附能力。1.2.4自凝聚能力乳酸菌的筛选将pbs溶液洗涤菌体两次，重悬于pbs溶液中，使菌体悬液的吸光度(od＝600nm)达到0.5±0.02(a0h)。以pbs溶液为空白对照，取4ml调整好菌浓度的菌悬液于试管中，室温静置2h后吸取1ml上层溶液测600nm吸光值(a2h)。自凝聚能力计算公式：2结果2.1疏水性乳酸菌的筛选见表1，20株乳酸菌的表面疏水性差异较大，共有8株乳酸菌表面疏水性超过45％，分别是1、4、9、11、14、15、16、20号菌株，表面疏水性在30％～45％的乳酸菌共有4株。其中1号乳酸菌的表面疏水性最高，达到62％，其次是16号菌株，达到54％。表1乳酸菌表面疏水性的测定注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。2.2乳酸菌黏附性筛选不同乳酸菌对iec-6细胞黏附情况如表2所示。不同乳酸菌对细胞黏附菌数差异较大，黏附数量大于10个的乳酸菌有8个，分别是1、4、9、11、14、15、16、20号菌株，其中16号乳酸菌的黏附数最高达到18个。表2乳酸菌对iec-6细胞的黏附数(n＝3，)注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。2.3自凝聚能力乳酸菌的筛选20种乳酸菌的自聚合能力如表3所示。不同菌种之间的聚合能力差别较大，在37％以上的有10株菌，分别是1、4、9、11、12、14、15、16、17、20号菌株。16号菌的自聚合能力最强，达到48％，其次为1号、9号和15号菌，为46％，最低的为5号菌株和19号菌株，自凝聚率只有11％。表3乳酸菌自凝聚能力的测定注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。实施例2具有免疫活性乳酸菌的复筛1材料与方法1.1材料mrs培养基：按质量百分数计算，葡萄糖2.0％、柠檬酸钠0.2％、乙酸钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5％、吐温-800.1％，ph6.0。固体培养基需要加1.5％琼脂粉。改良的mrs培养基：用蔗糖代替葡萄糖，其他同mrs培养基。1.2方法1.2.1产胞外多糖乳酸菌初筛(菌落拉丝法)将实施例1中初筛的8株乳酸菌(见表4)接种于mrs培养基中进行活化，采取平板划线法将活化好的乳酸菌接种于改良的mrs固体培养基中，37℃培养24h，观察菌落形态。1.2.2产胞外多糖乳酸菌复筛(苯酚-浓硫酸法)将本实施例1.2.1初筛获得的菌株接种于改良的mrs液体培养基中，37℃静置发酵24h。取发酵液，全程在4℃条件下进行，10000rpm，离心15min，取上清液加三氯乙酸至终质量分数4％，反应12h后，10000rpm，离心15min，收集上清液，加入3倍体积95％(体积分数)的乙醇溶液浸提12h，10000rpm离心15min，收集沉淀，用无水乙醇洗涤后，用去离子水溶解定容，溶液用去离子水透析(8000～14000da)3d，每8h换一次水，透析结束后减压真空浓缩至原体积即为粗多糖溶液。2结果2.1产胞外多糖乳酸菌初筛筛选结果如表4所示，选取菌落表面黏稠且可拉丝的1号、4号、15号和16号单菌落，保藏于mrs培养基斜面，置于4℃冰箱保存。表4产胞外多糖乳酸菌初筛结果注：“+”：是，“-”：否。2.2产胞外多糖乳酸菌复筛复筛结果如表5所示，结果表明，其中1、16号菌株的胞外多糖的产量在700～800mg/l之间，而15号菌株的胞外多糖产量可以达到996.67mg/l。因此选择1、15、16号菌株进行免疫功能检测。表5产胞外多糖乳酸菌复筛结果注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。实施例3乳酸菌免疫功能检测实验1材料与方法1.1材料健康昆明小鼠，购自山东泰邦生物制品有限公司；小鼠白细胞介素2(il-2)elisa检测试剂盒、小鼠γ干扰素(ifn-γ)elisa试剂盒、小鼠免疫球蛋白g(igg)elisa试剂盒均购自北京方程生物科技有限公司。1.2方法1.2.1乳酸菌免疫功能检测试验选用健康昆明小鼠210只，雌雄各半，体重18-20g，置于安静、温暖、避强光的环境中饲养适应3d后，随机分6组，每组35只，分别为空白组、模型组、阳性对照组、1号菌株组、15号菌株组、16号菌株组。实验开始前，对除空白组外其余组通过采取连续3d(d-2-d0)腹腔注射80mg/kg的环磷酰胺方法建立免疫低下小鼠模型，免疫抑制作用由小鼠体重来衡量。免疫抑制后连续灌胃3周，空白组和模型组给予灭菌生理盐水，阳性对照组给予左旋咪唑(浓度为50mg/kg)，按0.1ml/10g/d剂量灌胃，1号菌株组、15号菌株组、16号菌株组均按照108cfu/0.2ml/只/天灌胃，灌胃期间每隔4天称重一次。最后一次灌胃后第2天，分别取空白组和其他组各5只小鼠称体重、采集全血用于免疫指标的检测，称脾脏、胸腺重量，并观察小鼠活动及有无死亡，详细纪录。2结果2.1小鼠体重分析在整个试验过程中，对小鼠进行了6次称重。结果如表6所示，在灌胃试验开始前2天(d-2)的初始体重没有明显差异。随后，与空白组相比，其余五组小鼠在注射环磷酰胺后显示体重急剧下降，说明环磷酰胺的注射造成了小鼠免疫抑制。在灌胃治疗期间，与模型组相比，1号菌株组、15号菌株组、16号菌株组的小鼠体重在开始灌胃后第5天均有一定增加，并逐渐稳步增长。表6小鼠体重随时间的变化注：d-2指灌胃试验开始前两天，d1、d5、d10、d15、d20分别指灌胃第1、5、10、15、20天。2.2小鼠免疫器官指数的检测如表7所示，对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响：与模型组小鼠相比，空白组和1号菌株组、15号菌株组、16号菌株组的小鼠胸腺指数均显著提高(p<0.05)；相较于模型组，1号菌株组、15号菌株组和阳性对照组小鼠的脾脏指数均显着增加(p<0.05)，另外，15号菌株组和空白组小鼠脾脏指数没有显著差异(p>0.05)。表73种乳酸菌对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。2.3小鼠血清细胞因子的检测将血清在室温下融化后，采用elisa法检测血清中il-2和ifn-γ和igg水平。结果见表8，由表中数据可知，与模型组相比，1号菌株组、15号菌株组、16号菌株组小鼠血清中的il-2水平均显著提高(p<0.05)，并且不同乳酸菌(1、15、16)之间均差异显著(p<0.05)，其中15号菌株组il-2水平最高。分析结果表明乳酸菌具有体内免疫活性，能够提高小鼠血清il-2水平。ifn-γ：由表中数据可以看出，与模型组相比，1号菌株组、15号菌株组、16号菌株组小鼠血清中的ifn-γ水平均显著提高(p<0.05)，其中15号菌株组的ifn-γ水平显著高于1号乳酸菌组。分析结果表明，这3株乳酸菌具有体内免疫活性，能够提高免疫抑制小鼠血清ifn-γ水平。igg：igg是存在于血液、淋巴、腹腔液以及脑脊液中的主要免疫球蛋白，其占血清总免疫球蛋白的75％以上。由表中数据可以看出：与模型组小鼠相比，1号菌株组、15号菌株组、16号菌株组均能够提高免疫抑制小鼠血清中的igg水平，并且差异显著(p<0.05)。分析结果表明，这3株乳酸菌具有体内免疫活性，能够提高免疫抑制小鼠血清igg水平，其中15号菌株效果最为明显。表83种乳酸菌对小鼠血清il-2、ifn-γ、igg水平的影响注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。综上所述，15号菌株的免疫效果最强，因此准备将15号菌株保藏进行后续试验。实施例415号乳酸菌生物学特性检测及其鉴定1材料与方法1.1材料mrs培养基：按质量百分数计算，葡萄糖2.0％、柠檬酸钠0.2％、乙酸钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5％、吐温-800.1％，ph6.0。固体培养基需要加1.5％琼脂粉。健康成年spf级km小鼠，购自山东泰邦生物制品有限公司。1.2方法1.2.1耐酸性试验15号乳酸菌培养15h，按1％(v/v)的接种量分别接种于ph2.0、2.5、3.0的mrs培养基中，以ph6.0的mrs培养基为对照，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却备用。37℃培养4h，取样进行菌落计数，计算乳酸菌的存活率。存活率(％)＝(待测ph的菌液活菌数/初始菌液活菌数)×1001.2.2耐胆盐实验15号乳酸菌培养16h，按1％(v/v)的接种量分别接种于禽胆盐浓度为0.1％、0.2％、0.3％的mrs培养基中，以不加禽胆盐的mrs培养基为对照，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却备用。将菌株以2％(v/v)的接种量接种到上述处理后的培养基中，37℃培养4h，取样进行菌落计数，进行存活率测定。存活率(％)＝(待测禽胆盐浓度菌液活菌数/初始菌液活菌数)×1001.2.3消化酶耐受性试验将15号乳酸菌在mrs固体平板上37℃过夜培养，菌液离心，取菌泥，用等量的生理盐水复溶，稀释10倍备用；取1ml菌悬液与9ml胃蛋白酶液混合，37℃静置培养4h，于0h、2h、4h分别计数。将1ml菌悬液与9ml胰蛋白酶液混合，37℃静置培养4h，于0h、4h分别计数。1.2.4动物经口急性毒理试验选用18～22g的健康成年spf级km小鼠20只，雌雄各半，分为两组，对照组和试验组。按照20.0ml/kg体重的比例进行灌胃，试验组灌胃15号乳酸菌菌液，活菌数为1×1010cfu/ml，空腹灌胃一次，对照组空腹灌胃无菌生理盐水。灌胃后立即观察其活动表现、体重以及身体状况变化，观察期为7天。1.2.5传代稳定性测定将15号乳酸菌在mrs琼脂平板上37℃培养48小时后，挑取单菌落于mrs液体培养基中，37℃恒温培养箱培养16小时作为第1代菌液，以1％(v/v)比例接种于mrs液体培养基中，37℃恒温培养箱培养16小时作为第2代菌液，如此连续接种传至第20代。对5代、10代、15代、20代细菌培养物进行菌液计数并测定其ph值，记录结果。1.2.6菌种鉴定15号乳酸菌接种于mrs培养基中培养20h，采用天根公司的试剂盒提取菌体dna，并对其进行16srdna序列扩增。所用引物为通用引物：r5'-ggttaccttgttacgactt-3'(seqidno.2)，f5'-agagttgatcctggctcag-3'(seqidno.3)，pcr扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min。pcr产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定。2结果2.115号乳酸菌耐酸性检测由表9可以看出，15号乳酸菌在ph2.5和ph3.0时存活率达到45％和90％，说明该菌株具有较强的耐酸性。表915号乳酸菌耐酸性检测2.215号乳酸菌耐胆盐检测由表10可以看出，15号乳酸菌在禽胆盐0.1％培养4h，存活率为92.1％，随着禽胆盐浓度的升高，存活率明显下降，在胆盐浓度0.3％时，存活率为4.1％，由此可以看出15号乳酸菌具有较强的禽胆盐耐受能力。表1015号乳酸菌耐胆盐检测2.3消化酶耐受性试验结果由表11可知，胃蛋白酶液中处理2h、4h后，15号乳酸菌存活率分别为84％和46％。胰蛋白酶液中处理2h、4h后，15号乳酸菌存活率分别为92％和76％，由此可知15号乳酸菌对胰蛋白酶及胃蛋白酶均有较强的耐受性。表1115号乳酸菌消化酶耐受性试验结果2.415号乳酸菌的安全性试验由表12知，使用菌液对小鼠灌胃后，小鼠体重在给药前后正常增长，此外，小鼠食欲正常，饮水正常，毛色光洁不潮湿，精神方面无异常，综上说明，在试验浓度范围内，15号乳酸菌对小鼠是安全的。表1215号乳酸菌灌胃后小鼠体重变化2.515号乳酸菌的传代稳定性测定由表13可知，15号乳酸菌连续传5代、10代、15代、20代培养物形态均为革兰氏染色阳性杆菌，活菌含量不同代次之间相差不大，发酵液ph值均在4.15左右，说明15号乳酸菌菌株传代稳定性良好。表1315号乳酸菌的传代稳定性测定结果2.6菌种鉴定15号乳酸菌在固体mrs培养基上的菌落形态呈白色圆形，中央凸起，菌落表面细密而光滑。测序结果与数据库进行比对分析，所分离菌株的16srdna与植物乳杆菌jy53具有很高的同源性(100％)，因此被确认为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)blcc2-0125，于2020年4月24日保存于中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏编号为cctccno:m2020078。16srdna序列(seqidno.1)如下：cggctggttcctaaaaggttaccccaccgactttgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaatggctttaagagattagcttactctcgcgagttcgcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctcaccagagtgcccaacttaatgctggcaactgataataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtatccatgtccccgaagggaacgtctaatctcttagatttgcatagtatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcagcactgaagggcggaaaccctccaacacttagcattcatcgtttacggtatggactaccagggtatctaatcctgtttgctacccatactttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgcacttcttcggttgagccgaaggctttcacatcagacttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaaataccgtcaatacctgaacagttactctcagatatgttcttctttaacaacagagttttacgagccgaaacccttcttcactcacgcggcgttgctccatcagactttcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgattaccctctcaggtcggctacgtatcattgccatggtgagccgttaccccaccatctagctaatacgccgcgggaccatccaaaagtgatagccgaagccatctttcaaactcggaccatgcggtccaagttgttatgcggtattagcatctgtttccaggtgttatcccccgcttctgggcaggtttcccacgtgttactcaccagttcgccactcactcaaatgtaaatcatgatgcaagcaccaatcaataccagagttcgttcgacttgcattata实施例5植物乳杆菌blcc2-0125菌粉的制备1菌泥制备将上述筛选出的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)blcc2-0125菌株接种至mrs液体培养基，30℃静置培养20h，镜检无杂菌后按5％接种量接至mrs液体培养基，30℃静置培养20h，220rpm扩大培养。离心收集菌体，加入一定体积无菌水，调菌浓度至不低于1×108cfu/ml。2保护剂制备配方为脱脂乳3.4g、海藻糖1.8g、硫酸锰0.25g、蔗糖0.2g、异vc钠0.1g、葡萄糖0.1g。预先把该配方中的试剂用透明包装袋封口包装辐射灭菌备用，将其溶解于100ml无菌水中，置于干热灭菌过的玻璃瓶中备用。3真空冷冻干燥菌泥和保护剂，无菌条件下混合，冻干保护剂与菌泥的质量份数分别为120份和100份。将盛有菌液的玻璃瓶放入预冷真空冷冻干燥机，-20℃预冻2h后，开启真空泵，干燥24h，即得植物乳杆菌菌粉，其中植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)blcc2-0125的活菌数不低于1.00×1010cfu/g。实施例6植物乳杆菌blcc2-0125免疫效果研究1材料与方法1.1材料本发明实施例5制备的菌粉(植物乳杆菌blcc2-0125含量≥1.00×1010cfu/g)，h9n2亚型禽流感病毒，鸡分泌型免疫球蛋白a(siga)elisa试剂盒、鸡免疫球蛋白g(igg)elisa检测试剂盒、鸡ifn-γelisa检测试剂盒(购自北京方程生物科技有限公司)，喷雾器(购自山东聚诚五里雾环境科技有限公司)。aa肉鸡150只(购自鼎固山农业)，随机平均分为5组，分别为(1)空白组；(2)攻毒对照组；(3)保护剂组；(4)菌粉组；(5)疫苗组。1.2方法1.2.1免疫方案空白组、攻毒对照组：不做任何处理；菌粉组：15、16日龄连续两天产品(本发明实施例5制备的口服微生态制剂)饮水，使用无菌水将口服微生态制剂稀释到1.00×108cfu/ml，按照5ml/只的量，2h内集中饮完；保护剂组：15、16日龄连续两天口服保护剂；其成分与本发明实施例5的制备的菌粉的差异在于未添加菌体；使用保护剂时，饮水量与饮水方式与菌粉组相同。疫苗组：8日龄开始进行新支120点眼(1.5羽份)、新支流三联皮下注射0.3ml/只；15日龄进行法氏囊饮水(2羽份)、22日龄nd四系饮水(2羽份)、29日龄法氏囊饮水(2羽份)。1.2.2免疫方法各组按免疫方案实施；菌粉组、保护剂组直接加入饮水中使用。1.2.3攻h9n2亚型禽流感病毒病毒繁殖后eld50＝10-8.15/0.2ml，除空白组外，对23日龄肉鸡进行攻毒，翅静脉注射病毒原液0.8ml。1.2.4样品采集分别在7日龄、19日龄、30日龄、42日龄鸡每组随机选择5只翅静脉采血，并且随机选择3只安乐死，取其气管和肠道保存待检。攻毒7天后各组随机选择10只，分别取泄殖腔棉拭子。1.2.5样品检测将采集的血清采用elisa试剂盒检测igg抗体、ifn-γ含量，血凝抑制试验检测血清中h9抗体含量；将不同日龄不同分组得到的气管及肠道黏液采用elisa试剂盒检测siga抗体含量。将采集的泄殖腔棉拭子采用血凝试验检测排泄病毒的效价。2结果2.1盲肠黏膜中siga消长规律见表14，菌粉组盲肠黏膜中siga抗体始终保持最高水平。19日龄、30日龄菌粉组显著高于对照组，与疫苗组没有显著性差异，而在42日龄的样品结果显示菌粉组显著高于其余组(p＜0.05)。表14不同日龄肉鸡盲肠黏膜中siga抗体水平的测定结果(ng/ml)注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。2.2气管黏膜中siga消长规律见表15，菌粉组气管黏膜中siga抗体始终保持最高水平。19日龄菌粉组显著高于其余组(p＜0.05)。表15不同日龄肉鸡气管中siga抗体水平的测定结果(ng/ml)注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。2.3血清中igg抗体消长规律见表16，菌粉组血清中ifn-γ始终保持最高水平。菌粉组在19日龄、30日龄和42日龄均显著高于其余组(p＜0.05)。表16不同日龄肉鸡血清中igg抗体水平的测定结果(μg/ml)注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。2.4血清中ifn-γ消长规律见表17，菌粉组血清中ifn-γ始终保持最高水平。菌粉组在42日龄显著高于空白组和保护剂组(p＜0.05)，而与疫苗组没有显著性差异。表17不同日龄肉鸡血清中ifn-γ水平的测定结果(pg/ml)注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。2.5血清中h9抗体消长规律见表18，菌粉组血清中h9抗体始终保持较高水平。虽然随着母源抗体消失，h9抗体水平逐渐降低，但菌粉组延缓了抗体下降的趋势。表18不同日龄肉鸡血清中h9抗体水平的测定结果注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。2.6血凝试验见表19，菌粉组在泄殖腔分泌物抗原效价上要显著低于攻毒对照组，说明口服本产品可有效降低机体的病毒含量。表19攻毒后各组泄殖腔分泌物h9n2抗原效价注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。实施例7攻毒保护率的测定1实验方法在实施例6中23日龄攻毒的肉鸡，攻毒7d后每组随机选择8只对其进行安乐死，剖检取气管，刮取气管黏膜进行病毒rna的提取，以cdna为模板，使用禽流感通用引物进行pcr，琼脂糖凝胶电泳后，各组分别计算感染率、保护率。2结果见表20，使用产品后各组的感染率均有不同程度的降低，其中菌粉组效果最好。表20攻毒后各组感染率及保护率实施例8鸡毒支原体的分离培养、鉴定及分离纯化1鸡毒支原体的分离培养：试验用的鸡毒支原体菌株是从泰安市宁阳县某鸡厂病鸡的气囊中分离所得，无菌条件下取其气囊剪碎，放入鸡毒支原体液体培养基4℃过夜，0.22μm滤器过滤后接入液体培养基37℃、5％co2进行培养，观察培养基颜色由玫瑰红色变黄时立即进行传代。培养基变化图如图1所示。所用培养基是鸡毒支原体基础培养基(购自海博生物公司)，每1l液体培养基中加入100ml无菌马血清、辅酶10.1g、l-半胱氨酸0.1g、精氨酸0.4g和青霉素80万单位。2鸡毒支原体的鉴定：2.1方法：主要通过瑞士染色和姬姆萨染色以及pcr方法进行鉴定，pcr鉴定具体方法如下：(1)dna模板的制备：按照磁珠法支原体基因组dna提取试剂盒(购自英芮成生化科技有限公司)操作步骤进行dna的提取。(2)引物设计：根据genbank中ab680686.1，使用primer3plus引物设计软件，针对保守基因16srrna设计了1对特异性引物，引物序列如下：f:5’-cggatttattgggcgtaaaa-3’(seqidno.4)r:5’-tgttaactgcagcaccgaag-3’(seqidno.5)进行常规pcr，产物大小为308bp。(3)pcr反应体系如下：(4)反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，共30个cycles，最后72℃延伸10min，4℃终止反应。(5)进行测序(6)测序结果在ncbi中进行核酸比对2.2结果：pcr鉴定结合鸡毒支原体瑞士染色以及姬姆萨染色的结果(图2和图3a)结果表明，pcr所扩增的基因片段的碱基序列与鸡毒支原体16srna的碱基序列的匹配度高达99％(图3b)。3鸡毒支原体的分离纯化：3.1方法：鸡毒支原体的纯化主要是通过在固体培养基上培养后挑取单菌落进行液体培养，反复进行3次从而达到纯化的目的。3.2结果：通过反复3次纯化，最终得到纯化的鸡毒支原体液体培养物，pcr仍然得到目的条带(图4)。4鸡毒支原体ccu的测定：4.1测定方法：96孔细胞培养板中每孔加入培养基180μl，于每排的第一个孔分别加入待测样品20μl，然后10倍倍比稀释至第12孔后弃去多余的20μl，其中两排不加入待测物作为空白对照。加盖后用封口膜封住周围以防漏气，37℃培养，每日观察记录ph变化，当变色孔不再增加时确定终点。将导致颜色改变的待测物的最高稀释度看作1ccu/ml。4.2测定结果：经过7天的持续观察，如图5所示，前9列培养基颜色均发生变化，也就是说鸡毒支原体培养物ccu可达109/ml。实施例9体外筛选抑制鸡毒支原体增殖的中药待筛选中药：金荞麦、鱼腥草、板蓝根、白鲜皮、黄柏、黄莲、当归、艾叶；每味中药均采用以下方法分别进行提取：称取50g中药，分别加入10重量倍的蒸馏水，浸泡2h，加热至沸腾，第一次煎煮时间为60min，过滤，滤渣中再加入10重量倍的水进行第二次煎煮，煎煮时间为50min；过滤，滤渣中再加入8重量倍的水进行第三次煎煮，煎煮时间为30min，合并滤液，浓缩至滤液浓度为1g/ml。(1)8种中药的最小有效抑制支原体的生长浓度(mic)：取无菌96孔细胞培养板，于每排第l孔加入培养基150μl，第2-11孔加入培养基100μl，第12孔加入培养基200μl。接着在第1孔加入药液50μl，并用微量加样器从第1孔开始倍比稀释药液至第10孔，混匀后于第10孔吸出100μl弃去。取支原体培养物，用相应的液体培养基稀释到1x104ccu/ml,作为工作菌液。然后于第1-11孔加入工作菌液100μl，使得所有孔的液体总体积200μl，第11孔为阳性对照孔(即生长对照孔)，第12孔为阴性对照孔。药物的终浓度从第1-10依次为(单位：mg生药/ml)250.00、125.00、62.50、31.25、15.625、7.81、3.91、1.95、0.98、共9个稀释梯度；酒石酸泰乐菌素药液的终浓度10mg/ml。盖上板盖，置恒温培养箱内37c孵育。当阳性对照孔发生颜色改变(即培养液中酚红指示剂由红色变为黄色或橘黄色)且无混浊时作第一次结果判定(加药孔发生颜色变化的前1管的最小药物浓度为最小抑菌浓度即mic值)。5d后，当所有孔不再发生颜色变化作第二次结果判定。第一次判定的结果为起始最小抑菌浓度,第二次判定的结果为最终最小抑菌浓度。(2)试验结果通过最小抑菌浓度的测定试验，根据同类实验文献报道的判断标准为依据进行判定，即mic≤7.81mg生药/ml时较为敏感，mic为7.81-250mg生药/ml时为中度敏感，当mic≥250mg生药/ml时为不敏感。得出黄柏、黄莲均属于敏感范畴，金荞麦、鱼腥草属于中度敏感，当归、艾叶、板蓝根和白鲜皮属于不敏感。详见下表21。表218种中药粗提物抑制鸡毒支原体的mic值实施例10建立鸡毒支原体动物模型1建立方法12日龄spf鸡30只，分正常对照组(15只)与模型组(15只)，除正常对照组外，其余采用气管攻毒法进行攻毒，菌液浊度为1×109ccu/ml，0.5ml/只，同时，创造应激条件诱导发病，如降低温度、增加湿度、断料2d、卫生条件及通风条件差。正常对照组用生理盐水代替鸡毒支原体菌液，攻毒后每天观察并记录spf鸡的临床症状，连续观察7d后进行病理剖检，观察气管、气囊、肺的病理变化。2造模结果攻毒后鸡群出现鸡毒支原体病典型的临床症状和病理变化，主要表现为甩头、咳嗽、伸颈呼吸、且精神不振、食欲减退、少数出现呼吸道啰音等临床症状，气管内有淡黄色分泌物；气管黏膜增厚，气管壁有不同程度的充血和出血；气囊混浊、增厚，有大量混浊黏液状渗出物或淡黄色干酪样渗出物。所以，在制备mg动物模型时，攻毒方式采用气管内攻毒，菌液浊度为1×109ccu/ml，攻毒剂量为0.5ml/只，用于后续动物体内药物疗效试验。实施例11复合中药微生态制剂的制备配方：黄莲6份、黄柏15份、金荞麦12份、鱼腥草12份、益生菌菌粉。益生菌为植物乳杆菌blcc2-0125，益生菌菌粉的制备方法同实施例5，其中，益生菌菌粉中的blcc2-0125活菌数不低于1.00×1010cfu/g。复合中药微生态制剂的制备方法：按重量份称取黄莲、黄柏、金荞麦和鱼腥草，混合，加入10重量倍的水(水的加入量为混合药材重量的10倍)，浸泡2h，加热至沸腾，第一次煎煮时间为60min，过滤，滤渣中再加入10重量倍的水进行第二次煎煮，煎煮时间为50min；过滤，滤渣中再加入8重量倍的水进行第三次煎煮，煎煮时间为30min，合并滤液，浓缩至滤液浓度为1g/ml；向浓缩后的滤液中加入益生菌菌粉，混合均匀，即得复合中药微生态制剂，制备的复合中药微生态制剂中植物乳杆菌blcc2-0125的活菌数不低于1.0×109cfu/ml。实施例12复合中药微生态制剂的制备配方：黄连5份、黄柏10份、金荞麦15份、鱼腥草15份、益生菌菌粉。益生菌为植物乳杆菌blcc2-0125，益生菌菌粉的制备方法同实施例5，其中，益生菌菌粉中的blcc2-0125活菌数不低于1.00×1010cfu/g。制备方法同实施例11，制备的复合中药微生态制剂中植物乳杆菌blcc2-0125的活菌数不低于1.0×109cfu/ml。实施例13复合中药微生态制剂的制备配方：黄连8份、黄柏20份、金荞麦10份、鱼腥草10份、益生菌菌粉。益生菌为植物乳杆菌blcc2-0125，益生菌菌粉的制备方法同实施例5，其中，益生菌菌粉中的blcc2-0125活菌数不低于1.00×1010cfu/g。制备方法同实施例11，制备的复合中药微生态制剂中植物乳杆菌blcc2-0125的活菌数不低于1.0×109cfu/ml。实施例14复合中药微生态制剂预防鸡毒支原体病的效果试验1材料与方法1.1实验材料：1日龄健康spf鸡，购自济南赛斯家禽科技有限公司。1.2试验设计：150只spf鸡随机平均分为5组，每组30只，正常对照组、攻毒对照组、高剂量组(使用本发明实施例11制备的复合中药微生态制剂，按30％(v:v)的添加量饮水)、中剂量组(使用本发明实施例11制备的复合中药微生态制剂，按20％(v:v)的添加量饮水)、低剂量组iii组(使用本发明实施例11制备的复合中药微生态制剂，按10％(v:v)的添加量饮水)，6日龄开始集中饮水使用，连续用5d，11日龄时，采用气管攻毒法攻毒，菌液浊度为1×109ccu/ml，0.5ml/只，攻毒后连续观察2周。1.3饲养管理采用自由采食和饮水。舍内光照、温度和湿度严格按照常规饲养管理要求进行控制。每日换食换水前进行食槽和饮水器杀菌消毒。试验期间详细记录各组试验鸡的健康状况。1.4样品采集及检测指标试验结束即spf鸡25日龄时，每组随机剖检10只，观察气囊、气管和肺的病理变化，对气囊损伤程度进行分级评分，并评价气囊损伤率及死亡率。1.5试验方法1.5.1死亡率感染后每日观察并记录spf鸡的生存状态，出现鸡毒支原体典型临床症状及病理变化并死亡的判定为感染死亡，计算死亡率。死亡率＝试验组鸡只死亡数/该试验组的鸡只总数×100％。1.5.2气囊损伤率对气囊损伤程度进行分级评分，并评价气囊损伤率，参照h.wyoder评分标准，将气囊病理损伤分为5级：0级:气囊正常，薄而透明，记0分；1级:气囊仅有稍增厚的灰色区或黄色渗出斑点，记2分；2级:部分气囊易见到灰至黄色渗出，有时出现泡沫，气囊增厚，记4分；3级:大部分气囊增厚，布满大量黄白色干酪物，记6分；4级:几乎整个气囊布满黄白色干酪样渗出物，气囊严重增厚，记8分；平均气囊病理损伤度(计分)＝所有鸡气囊损伤度总和/被检鸡数根据气囊损伤计分结果计算气囊损伤减少百分率：气囊损伤减少率＝(攻毒对照组每只鸡气囊损伤平均分-试验组每只鸡气囊损伤平均分)/攻毒对照组每只鸡气囊损伤平均分2数据统计和处理数据采用graphpadprismtm(graphpadsoftware,inc.california,usa)软件分析处理，所有数据均以mean±sd表示，p＜0.05表示数据差异性显著。3试验结果3.1对鸡死亡率的影响结果由表22可见，与攻毒对照组相比，不同剂量复合中药微生态制剂的使用均能降低spf鸡死亡率，其中高剂量组使用后，鸡的死亡率最低为3.3.％。表22对模型鸡死亡率的影响结果3.2对气囊损伤减少率的试验结果由表23可以看出，不同剂量复方中药微生态制剂使用后，气囊病理损伤度都有所下降。其中，高剂量组的使用效果最佳，气囊损伤减少率高达70％，其次为中剂量组，气囊损伤减少率为50％。表23对气囊损伤减少率的结果正常对照攻毒对照高剂量组中剂量组低剂量组平均气囊病理损伤度(计分)04.01.22.02.8气囊损伤减少率(％)----7050304.试验结论：通过使用不同剂量的复合中药微生态制剂，评估其预防鸡毒支原体病的效果试验，得出复合中药微生态制剂高剂量组预防鸡毒支原体病的效果最佳。实施例15本发明的复合中药微生态制剂的预防效果1材料与方法1.1实验材料：1日龄健康spf鸡，购自济南赛斯家禽科技有限公司。1.2试验设计：300只spf鸡随机平均分为10组，每组30只，正常对照组(i组)、攻毒对照组(ii组)、复合中药微生态制剂(iii组，本发明实施例11制备的复合中药微生态制剂)、益生菌(iv组，本发明实施例5制备的益生菌菌粉)、v组(本发明实施例11中的复合中药浓缩滤液)、vi组(按本发明实施例11的方法制备的黄连和黄柏的复合中药浓缩滤液)、vii组(按本发明实施例11的方法制备的金荞麦和鱼腥草的复合中药浓缩滤液)、viii组(按本发明实施例11的方法制备的黄连、黄柏和鱼腥草的复合中药浓缩滤液)，ix组(按本发明实施例11的方法制备的黄莲、黄柏和金荞麦的复合中药浓缩滤液)，x组(泰乐菌素)，6日龄开始集中饮水使用，iii组-ix组均按30％(v:v)的添加量饮水使用，x组按500mg/l饮水使用，连续用5d，11日龄时，采用气管攻毒法攻毒，菌液浊度为1×109ccu/ml，0.5ml/只，攻毒后连续观察2周。1.3饲养管理同实施例14。1.4.样品采集及检测指标试验结束即spf鸡25日龄时，每组随机剖检10只，观察气囊、气管和肺的病理变化，对气囊损伤程度进行分级评分,并评价气囊损伤率。试验过程中分别在spf鸡6日龄、11日龄、18日龄、25日龄时采集血液分离血清，通过elisa试剂盒检测鸡毒支原体抗体、血清免疫球蛋白igg和细胞因子ifn-γ的含量。1.5试验方法1.5.1死亡率：同实施例14。1.5.2气囊损伤率：同实施例14。1.5.3免疫指标将试验过程中收集的4次血清，用elisa试剂盒分别检测鸡毒支原体抗体、igg和ifn-γ的含量，严格按照试剂盒的说明书进行操作，具体操作步骤如下：(1)检测试剂盒在室温平衡20min后，进行检测。(2)设置阴阳性对照孔和样本孔，阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照各50μl；(3)待测样本孔先加待测样本10μl，再加样本稀释液40μl；(4)随后阴、阳性对照孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化酶(hrp)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应空，37℃恒温箱温浴60min。(5)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。(6)每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。(7)每孔加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔的od值。2.数据统计和处理：同实施例14。3.试验结果3.1.对鸡死亡率的影响结果由表24可见，与ii组(攻毒对照组)相比，各用药组均能降低鸡毒支原体导致的spf鸡的死亡率，其中复合中药微生态制剂组(iii组)的死亡率最低为6.7％，其次为iv组(益生菌组)和v组(4种中药)，其死亡率也显著降低。表24预防试验-对模型鸡死亡率的影响结果i组ii组iii组iv组v组vi组vii组viii组ix组x组试验鸡数30303030303030303030死亡数014268101211915死亡率(％)046.76.72026.733.34036.730503.2对气囊损伤减少率的试验结果由表25可以看出，除了x组(泰乐菌素)，其余各组气囊病理损伤度都有不同程度的下降，其中，iii组(复合中药微生态制剂组)的效果最佳，气囊损伤减少率高达65.2％。表25预防试验-对气囊损伤减少率的结果3.3mg抗体检测结果通过鸡毒支原体抗体(mg抗体)检测(表26)发现，spf鸡在攻毒后7d(18日龄)和14d(25日龄)，只有i组(正常对照)、iii组(复合中药微生态制剂)血清中鸡毒支原体抗体为阴性，说明本发明的复合中药微生态制剂在鸡毒支原体感染的初期就开始发挥作用，抵抗鸡毒支原体的感染。表26预防试验-血清中鸡毒支原体抗体的检测结果(od值)3.4igg和ifn-γ的检测结果通过检测血清中igg和ifn-γ的含量，结果见表27和表28，发现spf鸡在攻毒后14d(25日龄)，与攻毒对照组比较，iii组、iv组、v组和ix组中igg含量均显著升高，iii组和iv组中ifn-γ的含量显著升高，且均为iii组的含量最高，即本发明的复合中药微生态制剂可显著提高spf鸡的免疫指标。表27预防试验-血清中igg的含量检测结果(pg/ml)注：与攻毒对照组比较，*p＜0.05表28预防试验-血清中ifn-γ的含量检测结果(pg/ml)注：与攻毒对照组比较，*p＜0.05实施例16本发明的复合中药微生态制剂的治疗效果1材料与方法1.1实验材料：1日龄健康spf鸡1.2试验设计：300只spf鸡随机平均分为10组，每组30只，正常对照(i组)、攻毒对照组(ii组)、复合中药微生态制剂(iii组，本发明实施例11制备的复合中药微生态制剂)、益生菌(iv组，本发明实施例5制备的益生菌菌粉)、v组(本发明实施例11中的复合中药浓缩滤液)、vi组(按本发明实施例11的方法制备的黄连和黄柏的复合中药浓缩滤液)、vii组(按本发明实施例11的方法制备的金荞麦和鱼腥草的复合中药浓缩滤液)、viii组(按本发明实施例11的方法制备的黄连、黄柏和鱼腥草的复合中药浓缩滤液)，ix组(按本发明实施例11的方法制备的黄莲、黄柏和金荞麦的复合中药浓缩滤液)，x组(泰乐菌素)，11日龄时，采用气管攻毒法攻毒，菌液浊度为1×109ccu/ml，0.5ml/只，攻毒7d后开始集中饮水用药，iii组-ix组均按30％(v:v)的添加量饮水使用，x组按500mg/l饮水使用，连续用5d，继续观察2周。1.3饲养管理：同实施例141.4.样品采集及检测指标试验结束即spf鸡36日龄时，每组随机剖检10只，观察气囊、气管和肺的病理变化，对气囊损伤程度进行分级评分,并评价气囊损伤率。试验过程中分别在spf鸡11日龄、18日龄、29日龄、36日龄时采集血液分离血清，通过elisa试剂盒检测鸡毒支原体抗体、血清免疫球蛋白igg和细胞因子ifn-γ的含量。1.5试验方法1.5.1死亡率：同实施例141.5.2气囊损伤率：同实施例141.5.3免疫指标：同实施例142.数据统计和处理：同实施例143.试验结果3.1.对鸡死亡率的影响结果通过各用药组治疗鸡毒支原体感染的试验，从表29得出，与攻毒对照组相比，iii组(复合中药微生态制剂组)的死亡率最低达13.3％，其次是iv组(益生菌组)和x组(泰乐菌素组)，死亡率为16.7％。表29治疗试验-对模型鸡死亡率的影响结果组别i组ii组iii组iv组v组vi组vii组viii组ix组x组试验鸡数30303030303030303030死亡数01345711121195死亡率(％)043.313.316.723.336.74036.73016.73.2对气囊损伤减少率的试验结果由表30可以看出，iii组(复方中药微生态制剂组)气囊损伤减少率最高达42.9％，其次为x组(泰乐菌素)和iv组(益生菌组)，气囊损伤减少率均为23.8％。表30治疗试验-对气囊损伤减少率的结果3.3mg抗体检测结果通过elisa试剂盒检测，结果发现(表31)，除了iii组(复方中药微生态制剂组)和x组(泰乐菌素)在用药后7d和14d鸡毒支原体抗体均呈阴性，剩余试验组抗体均呈阳性，说明本发明的复方中药微生态制剂具有治疗鸡毒支原体感染的作用。表31治疗试验-血清中支原体抗体的检测结果(od值)3.4igg和ifn-γ的检测结果由表32可以看出，spf鸡用药7d后(29日龄)，与攻毒对照组比较，iii组、iv组和v组血中igg含量均显著升高；用药14d(36日龄)后，只有iii组igg含量显著高于攻毒对照组。spf鸡用药7d后(29日龄)，与攻毒对照组比较，iii组、iv组和v组血中ifn-γ含量都显著升高，用药14d(36日龄)后，只有iii组的ifn-γ含量显著高于攻毒对照组。表32治疗试验-血清中igg的含量检测结果(pg/ml)注：与攻毒对照组比较，*p＜0.05表33治疗试验-血清中ifn-γ的含量检测结果(pg/ml)注：与攻毒对照组比较，*p＜0.05以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>山东宝来利来生物工程股份有限公司<120>一种复合中药微生态组合物及其制备方法和应用<130>202021307<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>1439<212>dna<213>植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)blcc2-0125<400>1cggctggttcctaaaaggttaccccaccgactttgggtgttacaaactctcatggtgtga60cgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattact120agcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaatggcttta180agagattagcttactctcgcgagttcgcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtg240tagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtc300accggcagtctcaccagagtgcccaacttaatgctggcaactgataataagggttgcgct360cgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctg420tatccatgtccccgaagggaacgtctaatctcttagatttgcatagtatgtcaagacctg480gtaaggttcttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggccccc540gtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcggaatgcttaatgcgt600tagctgcagcactgaagggcggaaaccctccaacacttagcattcatcgtttacggtatg660gactaccagggtatctaatcctgtttgctacccatactttcgagcctcagcgtcagttac720agaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgcta780cacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgcacttctt840cggttgagccgaaggctttcacatcagacttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgccc900aataaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagc960cgtggctttctggttaaataccgtcaatacctgaacagttactctcagatatgttcttct1020ttaacaacagagttttacgagccgaaacccttcttcactcacgcggcgttgctccatcag1080actttcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtc1140tcagtcccaatgtggccgattaccctctcaggtcggctacgtatcattgccatggtgagc1200cgttaccccaccatctagctaatacgccgcgggaccatccaaaagtgatagccgaagcca1260tctttcaaactcggaccatgcggtccaagttgttatgcggtattagcatctgtttccagg1320tgttatcccccgcttctgggcaggtttcccacgtgttactcaccagttcgccactcactc1380aaatgtaaatcatgatgcaagcaccaatcaataccagagttcgttcgacttgcattata1439<210>2<211>19<212>dna<213>人工<400>2ggttaccttgttacgactt19<210>3<211>19<212>dna<213>人工<400>3agagttgatcctggctcag19<210>4<211>20<212>dna<213>人工<400>4cggatttattgggcgtaaaa20<210>5<211>20<212>dna<213>人工<400>5tgttaactgcagcaccgaag20当前第1页12