一种基于锰基的肿瘤诊疗一体化纳米材料、制备方法和应用与流程

本发明涉及磁共振成像介导的光动力治疗诊疗一体化材料领域，特别是涉及一种基于锰基的肿瘤诊疗一体化纳米材料、制备方法和应用。

背景技术：

光动力治疗(pdt)是一种无创、光激发的癌症治疗模式。参与pdt治疗的要素有激发光、光敏剂和分子氧。在特定波长的光源激发下，可以选择性地激活光敏剂，从而产生ros，继而出现细胞毒性、血管损伤和免疫调节，最终诱导癌细胞死亡。光敏剂是实现pdt必要的一部分，常见的有卟啉相关的大环化合物、非卟啉的大环化合物(如酞菁、卟吩、金丝桃素和吩噻嗪类等)，以及金属衍生物(如tio2，w18o49等)。

pdt治疗过程中，经成像技术辅助，光源可精准定位，避开正常组织，在肿瘤中选择性滞留，精准产生和释放ros，从而实现肿瘤特异性pdt且副作用降到最低。因此，将光动力治疗和成像技术有机结合在一起是十分必要的。

常规的肿瘤影像学检查方法包括x线检查(包括普放和造影)、超声成像(us)、计算机断层成像(ct)、正电子发射断层成像(pet-ct)、磁共振成像(mri)、荧光成像(fi)及光声成像等。随着影像诊断学飞速发展，凭借敏感而准确的检测技术可以发现以前无法检测到的肿瘤，使得癌症的早期诊断成为可能，影像检查已成为了临床诊断和鉴别疾病的主要方法之一，在临床工作中扮演了重要的角色。其中，mri具有组织分辨率较高、无辐射等优势，可显示靶器官的形态学和功能，已广泛用于疾病诊断和分期等领域[4]。但是，正常组织中微小或小肿瘤诊断，很大程度上依赖于对比剂的使用，据报道统计约50％的临床mri扫描需要对比剂(ca)来提高其敏感性和诊断准确性。因此，影像诊断学仍处于不断发展中，需要不断的改进设备，使ca得到优化和创新，以此来提高肿瘤的诊断效能。

目前临床对比剂主要是顺磁性金属离子，其纵向弛豫率(r1)的高低呈浓度依赖性。钆离子(gd³⁺)有较高的纵向弛豫功能，是目前最广泛应用的对比剂。目前临床已有的gd3+小分子对比剂主要有大环类的gd-dota，gd-bt-do3a，gd-hp-do3a等和非大环类的gd-eob-dtpa，gd-bopta，gd-dtpa等。此外，锰离子(mn²⁺)和氧化铁的化合物在临床上也有使用，但主要集中在欧美国家。随着医疗管理不断优化、成像设备性能显著提升和基础科学持续发展，cas的要求越来越高。但是现有小分子cas的r1较低、体内循环时间短、缺乏靶向性等缺点。目前，因此越来越多的研究者致力于开发高r1、低毒性、具有肿瘤或组织靶向性的ca。大分子对比剂(mcas)，指大分子与金属螯合物(如gd³⁺，mn²⁺)。采用大分子载体可以提升现有临床使用小分子ca的不足，同时载体的优势可以增强mcas的性能，如多功能性、生物响应性等。目前，锰基纳米材料，主要是氧化锰纳米，包括mno2、mno、mn2o3、mn3o4和mnox及其衍生物在生物成像、生物传感、药物/基因传递和肿瘤治疗等方面有着广泛的应用。锰基纳米材料在生物成像方面的能力主要是依赖其与h⁺、过氧化氢(h2o2)、谷胱甘肽(gsh)等发生反应，从而在肿瘤微环境中降解，使靶部位mn²⁺浓度升高，提高mri成像能力。因此，锰基大分子对比剂具有很好的临床医用前景。

因此，开发一种既可以用作磁共振成像对比剂又可以用作光动力治疗的新型纳米材料，即满足上述的高效磁共振成像及光动力治疗诊疗一体化的目的，这是本领域技术人员需要解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种新的纳米材料，该纳米材料具有较高的弛豫率并且在光照(595nm)条件下具有很高光动力转化效率，可以作为磁共振对比剂和光动力治疗剂，应用于磁共振成像和光动力治疗中，以实现肿瘤的诊疗一体化。

一种基于锰基的肿瘤诊疗一体化纳米材料的制备方法，在水介质中加入白蛋白、金丝桃素和氯化锰，产物自组装形成所述基于锰基的肿瘤诊疗一体化纳米材料。

所述金丝桃素(hyp)为单体金丝桃素，分子式：c30h16o8，分子量：504.45，cas号：548-04-9，其结构式如下式(ⅰ)所示：

优选的，所述白蛋白为牛血清白蛋白。

优选的，白蛋白、金丝桃素和氯化锰的投料质量比为400∶0.61∶1.2～4.8。更优选的，反应体系中白蛋白与水介质的质量体积比为400mg∶5.4ml，其中的水介质是指反应液中总的水量。

优选的，白蛋白和氯化锰为水溶液，金丝桃素溶解在二甲亚砜中，反应步骤为：将白蛋白水溶液调节ph值至10，再将金丝桃素的二甲亚砜溶液和氯化锰水溶液滴加到白蛋白水溶液中，边滴加边搅拌，滴加完毕后调节反应液ph值至9，室温避光反应。其中，室温是指常规的环境温度即可，反应不需要进行加热或降温。更优选的，室温避光反应时间不少于2h。应结束后的溶液用透析膜在去离子水中透析纯化24小时，最终冻干得到棕色粉状纳米粒。

本发明的制备方法中，氯化锰在碱性条件下，氧化形成二氧化锰(mno2)颗粒；mno2颗粒和金丝桃素嵌在白蛋白聚合物上自组装形成球状纳米级材料。

本发明又提供了所述制备方法制备的基于锰基的肿瘤诊疗一体化纳米材料。

本发明通过极其简单的一锅法将mno2颗粒和金丝桃素同时嵌在白蛋白聚合物中制备锰基纳米大分子对比剂，通过调节白蛋白、金丝桃素、氯化锰三者的浓度，得到粒径大小为67nm，弛豫率最高(ph6.0，h2o2)为9.04mm^-1s^-1的球状纳米颗粒，高于临床小分子钆对比剂的弛豫率(如gd-dtpa，r1为4.7mm^-1s^-1)和临床锰基对比剂(如mndpdp，r1为2.5mm^-1s^-1)，具有较好的体外mri造影效果。bhm纳米粒(锰基纳米大分子对比剂)在肿瘤微环境下可以分解释放mn²⁺，增强体内外的mri；同时在肿瘤部位bhm纳米粒释放hyp，使得hyp富集从而增强pdt疗效。另外，mno2会与肿瘤微环境发生反应产生氧气，从而缓解肿瘤部位的缺氧。因此，bhm纳米粒具有较好的肿瘤mri介导的pdt疗效。

本发明还提供了所述基于锰基的肿瘤诊疗一体化纳米材料在制备磁共振成像对比剂和/或光动力治疗剂中的应用。本发明制备的纳米材料在波长为595nm具有一定量的吸收，研究发现，将本发明的纳米材料作用到肿瘤细胞中，在光照条件下，能够显著抑制肿瘤细胞的增殖，因此，可以将其作为光动力治疗剂。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明通过自组装制备高效的锰基纳米级大分子对比剂，具有弛豫效率较高，体内循环时间长、肾清除迅速、靶向性、生物兼容性高和毒副作用小等优点。

(2)本发明制得的纳米材料在595nm具有较高光动力转化效率，可以作为光敏剂应用到光动力治疗中，另外借助磁共振技术监测肿瘤的位置、大小以及光治疗剂在肿瘤组织中的富集情况，用于评价治疗效果，实现磁共振成像介导的光动力治疗诊疗一体化。

附图说明

图1为动态光散射粒度仪(dls)测定bhm纳米粒的平均粒径(67nm)和粒径分布(pdi＝0.17)。

图2为透射电子显微镜(tem)观察和测定bhm纳米粒的形貌、分布和粒径大小。

图3为纳米材料bhm磁共振对比剂在不同环境下的弛豫率与锰浓度的关系曲线图。

图4为纳米材料bhm各个浓度在不同环境下的体外磁共振成像图。

图5为纳米材料bhm水、金丝桃素单体在二甲亚砜溶液中或水溶液中的紫外-可见光吸收波长分析图。

图6为在有或无激光照射下，常氧培养后，bhm对4t1细胞增值效果图(595nm，0.25mwcm^-2，5min)。

图7为在有或无激光照射下，厌氧培养后，纳米材料bhm对4t1细胞增值效果图。

图8为实施例合成的纳米材料bhm作为磁共振对比剂增强原位乳腺肿瘤磁共振成像图(a)以及信号强度定量图(b)。

图9为纳米材料bhm作为磁共振对比剂增强小鼠肾脏层面和肝脏层面的冠状位磁共振成像图。

图10为纳米材料bhm对4t1乳腺癌细胞荷瘤balb/c小鼠肿瘤的抑制实验中肿瘤生长曲线图。

图11为纳米材料bhm对4t1乳腺癌细胞荷瘤balb/c小鼠肿瘤的抑制实验过程中，balb/c小鼠体重变化曲线图。

具体实施方式

实施例1

1、纳米材料的制备

(1)金丝桃素(hyp)(0.61mg)溶于200μl二甲亚砜(dmso)中。称取氯化锰(1.2mg)溶于200μl去离子水中。牛血清白蛋白(bsa)(400mg)溶于5.0ml去离子水中，滴加1mnaoh滴入bsa溶液中调节ph值至10，然后将hyp和mncl2溶液依次缓慢滴加入bsa溶液中，随后滴加1mnaoh将混合物的ph值调至9。

(2)室温下、避光反应2小时。

(3)透析膜(3500da)在去离子水中透析纯化24小时。

(4)冻干得到棕色粉状bhm纳米粒。

2、纳米材料的性能分析

(1)使用动态光散射仪(dls)检测上述bhm纳米粒，结果如图1所示，动态光散射粒度仪(dls)测定bhm纳米粒的平均粒径为67nm，粒径分布pdi＝0.17。

(2)使用透射电子显微镜(tem)观察和测定bhm纳米粒的形貌、分布和粒径大小。取0.5mgml^-1(1ml)的bhm纳米粒溶液浸没在铜网(400目，碳支持膜)中5分钟左右，镊子轻轻取出铜网，再用洁净的滤纸吸除多余液体并烘干得到样品。如图2所示，镜下观察发现tem再次验证了纳米颗粒的尺寸，并且可以看到纳米粒呈较规则的均一球形，而且大小都比较均匀，透射电镜(tem)观察到纳米材料bhm的粒径为67nm左右，与dls测得的粒径结果相符。

(3)检测纳米材料bhm纳米粒作为磁共振对比剂在不同环境下(分为四组：①ph＝6.0；②ph＝6.0并加入100μmh2o2；③ph＝7.4；④ph＝7.4并加入100μmh2o2)的弛豫率与锰浓度的关系曲线图。结果如图3所示，由图可知在ph＝7.4溶液中，无论有无h2o2的参与，bhm纳米粒的r1均较低；在ph＝6.0，bhm纳米粒r1有小幅度升高，为2.6mm^-1s^-1；而在ph＝6.0，并且加入h2o2，bhm纳米粒r1明显升高，为9.04mm^-1s^-1。bhm纳米粒在酸性和h2o2环境下易水解，释放mn²⁺，表明bhm纳米粒在肿瘤的微环境中有增强mri的作用。

(4)检测纳米材料bhm各个浓度在不同环境下(分为四组：①ph＝6.0；②ph＝6.0并加入100μmh2o2；③ph＝7.4；④ph＝7.4并加入100μmh2o2)的体外磁共振成像图，结果如图4所示，随着浓度的增加，纳米材料用作对比剂时的mri图像更亮；ph＝6.0，并且加入h2o2，亮度最高，因而能够展示出更优越的成像效率。

(5)检测纳米材料bhm水、金丝桃素单体在二甲亚砜溶液中或水溶液中的紫外-可见光吸收波长。结果如图5所示，金丝桃素在dmso溶液中的吸收峰主要出现在595nm处，在bhm纳米粒水溶液亦可见595nm吸收峰，说明bhm中有金丝桃素原料。而在金丝桃素水溶液中，595nm处的吸收强度明显的下降，说明其单体在水中溶解度低，不易被检测到。

(6)在有或无激光照射下，常氧培养后，检测bhm对4t1细胞增值效果(595nm，0.25mwcm^-2，5min)，结果如图6所示，bhm+光照组和hyp单体+光照组两组对4t1细胞系的毒性均较强，ic50值在0.24～0.45μgml^-1之间，均有较高的光毒性。而hyp单体和bhm单独使用时抗肿瘤效果欠佳。hyp单体的pdt杀伤肿瘤细胞效果较好，但是其单体水溶性差，体内给药难度大；而bhm纳米粒在各介质中有良好的分布，配合光照具有高效的抗肿瘤效果。

(7)鉴于在纳米粒的表征实验中发现bhm纳米粒在酸性和h2o2类肿瘤微环境下可快速分解，因此本实验在厌氧环境下观察hyp与bhm纳米粒的细胞毒性。结果如图7所示，在厌氧环境下，hyp+光照组对4t1细胞的杀伤能力明显下降；而bhm纳米粒对两种细胞的杀伤能力较大。在bhm纳米粒酸性和h2o2类肿瘤微环境下，mno2与h2o2反应生成氧气，缓解了肿瘤微环境的缺氧，有利于pdt进行肿瘤细胞杀伤作用，从而增强抑瘤的效果。

(8)检测纳米材料bhm作为磁共振对比剂在增强原位乳腺肿瘤磁共振成像以及信号强度方面的作用。如图8所示，(a)注射欧乃影(omniscan)或bhm纳米粒前，肿瘤与周边肌肉的t1信号接近，信号均较低。注射欧乃影或bhm纳米粒5分钟后，两组肿瘤周围均出现了明显的强化。随着时间的延长，欧乃影组肿瘤信号逐渐降低，对比剂欧乃影从肿瘤中迅速排出；而bhm纳米粒组的肿瘤信号不断增强，在60分钟达到高峰，而后信号逐渐下降。(b)注射bhm纳米粒后肿瘤cnr明显升高，明显高于欧乃影。注射bhm纳米粒60分钟后肿瘤的cnr最高，约为62，而注射欧乃影的cnr均明显低于bhm，5分钟的cnr达到最高为34，并随时间逐渐下降。更重要的是，在30分钟至120分钟之间，bhm纳米粒的肿瘤cnr明显高于欧乃影，且具有统计学差异(p<0.05)。bhm纳米粒具有较长的血液循环时间，可通过高通透性和滞留效应在肿瘤中积累，由于bhm纳米粒在肿瘤微环境中的分解和氧化还原，大量mn²⁺释放使其肿瘤部位的t1信号明显升高，可观察时间窗较长。由此可见，bhm纳米粒在小鼠乳腺癌模型中有出色的增强磁共振成像能力，大大提高了其检测肿瘤的敏感性。如图9所示，肝脏在bhm纳米粒注射后3小时高度强化，易与周围组织分离；注射后1天，肝脏信号明显降低，提示bhm纳米粒一部分可被肝脏摄取、降解并从消化道排出。肾脏在bhm纳米粒注射后3小时也有明显的强化，注射后6小时肾实质与肾盂容易区分，具有较高的对比度，主要是由于mn²⁺在肾脏的高分布。bhm纳米粒注射后1天与注射后7天磁共振成像图可见，肾脏和肝脏的信号衰减到与未打药前基本一致，证实了bhm可在体内代谢排出。

(9)前文在体外证明了bhm纳米粒有出色的细胞光动力杀伤效果，本实验进一步研究其在体内的光动力抑瘤效果。将4t1乳腺癌细胞荷瘤balb/c小鼠随机分成4组(n＝5)：pbs组、金丝桃素单药+光照组(金丝桃素当量5μgkg^-1)、bhm纳米粒组和bhm纳米粒+光照组(595nm，2.5wcm^-2，5min)。仅一次给药，随后密切观察小鼠状态，每两天测量肿瘤。结果如图10所示，bhm联合光动力治疗组的肿瘤完全消失，而仅bhm组、金丝桃素组联合光动力组和pbs组三组肿瘤生长较快。在研究过程中可看出，bhm纳米粒具备高效的光动力抑瘤能力。如图11所示，实验组与其他三组对照组的小鼠均未出现明显的体重下降。表明bhm纳米粒具有良好的生物相容性，经尾静脉注入后在短时间内不会引起急性毒性。

实施例2

根据表1的反应条件制备纳米材料，工艺流程参照实施例1制得的纳米材料粒径见表1。

表1

由表1可知，当牛血清白蛋白、金丝桃素与氯化锰的质量比为400∶0.61∶1.2时，所获纳米材料的粒径最好。当氯化锰的浓度为不断增加时，纳米材料的粒径分布不断增大，过大的纳米颗粒无法经epr效应富集在肿瘤组织附近，且容易被网状内皮系统截留，使磁共振造影和光动力治疗效果下降。