本发明属于益生菌制品技术领域，具体涉及一种具有改善哮喘作用的益生菌组合物及其制备方法。
背景技术：
一般认为哮喘是由于人体免疫反应过度造成的机体损伤，人体的免疫t细胞分为辅助t细胞(th2)和调节t细胞(treg)。th2细胞可以激活其它能够产生直接免疫反应的免疫细胞；调节性treg细胞则负责调节机体的免疫反应，起着维持自身耐受和避免免疫反应过度损伤机体的重要作用，两者相互协调，维持人体免疫平衡。但哮喘患者在接触过敏原后，th2细胞增加，过度活跃，使得一种免疫球蛋白的抗体ige大量释放；而调节性treg细胞的抑制，导致了免疫反应的失控。
肠道菌群的重要代谢物短链脂肪酸(scfas)能够起到维持免疫平衡的作用。研究发现，肠道菌群在分解膳食纤维时产生的短链脂肪酸能够促进免疫细胞如单核细胞的生成，这些单核细胞迁移到肺部，成为能够抑制初始t细胞分化为th2细胞的树突细胞；同时，也可促进t调节(treg)细胞的形成，从而可以抑制th2细胞的数量，维持人体免疫平衡，达到改善哮喘的作用。
人体口服益生菌能够调节肠道菌群，肠道菌群的重要代谢物短链脂肪酸(scfas)能够起到维持免疫平衡的作用。研究发现，肠道菌群在分解膳食纤维时产生的短链脂肪酸能够促进免疫细胞如单核细胞的生成，这些单核细胞迁移到肺部，成为能够抑制初始t细胞分化为th2细胞的树突细胞；同时，也可促进t调节(treg)细胞的形成，从而可以抑制th2细胞的数量，维持人体免疫平衡，达到改善哮喘的作用。
人体口服益生菌改善哮喘的作用效果，取决于口服益生菌在人体肠道内的定殖能力以及在肠道内抑制有害菌的能力。
技术实现要素：
本发明提供一种具有改善哮喘作用的益生菌组合物，该益生菌组合物可在人体肠道内长时间定殖，对哮喘的改善效果好。
本发明还提供了一种具有改善哮喘作用的益生菌组合物的制备方法
本发明的具有改善哮喘作用的益生菌组合物采用如下技术方案：一种具有改善哮喘作用的益生菌组合物，所述益生菌组合物包括约氏乳杆菌lbj456、鼠李糖乳杆菌pb-lr76和乳双歧杆菌hh-ba68，所述约氏乳杆菌lbj456的保藏号为cctccno：m20191013，所述鼠李糖乳杆菌pb-lr76的保藏号为cctccno：m2018887。
作为进一步的优选技术方案，所述益生菌组合物中的约氏乳杆菌lbj456、鼠李糖乳杆菌pb-lr76和乳双歧杆菌hh-ba68以菌粉的形式存在。
作为进一步的优选技术方案，所述益生菌组合物中含有约氏乳杆菌lbj456菌粉30-60wt％、鼠李糖乳杆菌pb-lr76菌粉30-60wt％和乳双歧杆菌hh-ba68菌粉10-40wt％。
作为进一步的优选技术方案，所述益生菌组合物的原料还包括辅料，所述辅料包括但不限于麦芽糊精、水溶性淀粉、无水葡萄糖、微晶纤维素、二氧化硅和硬脂酸镁中的任意一种或几种的组合。
作为进一步的优选技术方案，所述约氏乳杆菌lbj456、鼠李糖乳杆菌pb-lr76或乳双歧杆菌hh-ba68的活菌数分别独立的选自1.0×109～1.0×1012cfu/g。
本发明的具有改善哮喘作用的益生菌组合物的制备方法采用如下技术方案：如上述任意一项所述的具有改善哮喘作用的益生菌组合物的制备方法，包括下述步骤：将所述约氏乳杆菌lbj456、鼠李糖乳杆菌pb-lr76和乳双歧杆菌hh-ba68混合均匀即可。
作为进一步的优选技术方案，所述约氏乳杆菌lbj456或鼠李糖乳杆菌pb-lr76的制备方法为：将约氏乳杆菌lbj456或鼠李糖乳杆菌pb-lr76分别接种于mrsa液体培养基中，在36-38℃下静止培养12-72h，分离即可分别得到所述约氏乳杆菌lbj456或鼠李糖乳杆菌pb-lr76；所述乳双歧杆菌hh-ba68的制备方法为：将乳双歧杆菌hh-ba68接种于mrsb液体培养基中，在36-38℃下静止培养12-96h，分离即可得所述乳双歧杆菌hh-ba68。
作为进一步的优选技术方案，还包括将所述约氏乳杆菌lbj456、鼠李糖乳杆菌pb-lr76和乳双歧杆菌hh-ba68分别制成菌粉的步骤：将培养得到的菌液离心，收集沉淀物，得到菌泥；向所述菌泥中分别加入冻干保护剂进行乳化处理；乳化处理后真空冷冻干燥即得菌粉。
作为进一步的优选技术方案，所述菌液的离心条件为10000-15000rpm；所述冻干保护剂选自脱脂奶粉、海藻糖、麦芽糊精、低聚果糖、甘油和乳糖中的任意一种或几种的组合；所述乳化处理的条件为：60-180rpm、搅拌5-15min；所述冷冻干燥的条件为：预冻温度-45℃、冷阱温度-60℃开始抽真空，控制解析温度28～30℃，冷冻干燥的时间为24-72h。
作为进一步的优选技术方案，还包括将所述所述约氏乳杆菌lbj456、鼠李糖乳杆菌pb-lr76和乳双歧杆菌hh-ba68混合均匀后，加入辅料再充分混合均匀的步骤。
本发明的有益效果是：本发明的益生菌组合物可在人体肠道内长时间定殖，对肠炎沙门氏菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、鼠伤寒沙门氏菌等有害菌具有很好的抑制效果，可有效改善哮喘。
本发明的具有改善哮喘作用的益生菌组合物可起到下述作用：①通过刺激肠道壁上的树突状细胞上的受体并结合，激活和活化细胞内的转译蛋白移至核内而释放大量细胞激素，通过促进白介素质12(il-12)和干扰素γ的分泌增加，可有效改善哮喘症状。②本发明的具有改善哮喘作用的益生菌组合物，能预防和改善哮喘，主要是靠通过以及平衡肠道的微生态系统，通过刺激肠道免疫系统，诱发th1细胞反应，从而改善哮喘；通过调控th1型免疫反应从而抑制免疫球蛋白ige，改善th2型免疫反应过度引起的哮喘。③本发明的具有改善哮喘作用的益生菌组合物，包括一种或多种益生菌菌株组成的益生菌组合物，能预防和改善哮喘的效果强弱，取决于所选择的功能益生菌菌株。
本发明提供了一种具有改善哮喘作用的益生菌组合物用于改善哮喘时，对哮喘的改善作用可达60％以上。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的实施例进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应当理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。
实施例1本发明的改善哮喘作用的益生菌组合物中各菌种的来源
1.1约氏乳杆菌lbj456
1.1.1菌株来源
分离自健康小鼠肠道，在营养琼脂固体培养基上，36～38℃培养24～48h，多次划线分离获得单菌落，该菌菌落凸起，全缘和无色。细胞杆状，通常规则。革兰氏阳性，不生孢。兼性厌氧，有时微好氧，在有氧时生长差，降低氧压时生长较好。
1.1.2菌株功能特性
约氏乳杆菌lbj456菌株具有很好的胃酸和胆盐耐受性以及细胞粘附性，可以在人体肠道中定殖长达60余天，对肠炎沙门氏菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、鼠伤寒沙门氏菌等有害菌具有很好的抑制效果；在动物实验中被证明具有极佳的改善哮喘的作用效果。
1.1.3菌种鉴定
分离、纯化菌种，经16srrna基因作为marker片段，通用引物扩增出基因中16srrna序列，再进行电泳检测，使用3730xl测序仪进行一代双末端测序，获得abi测序峰图文件，通过软件组装后，与nt数据库进行比对，获得近源物信息，确认为约氏乳杆菌，菌株编号为lbj456，其16srrna特征序列为：
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1.1.4菌种保藏
约氏乳杆菌(lactobacillusjohnsonii)lbj456，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m20191013。
1.2鼠李糖乳杆菌功能菌株pb-lr76
1.2.1菌株来源
分离自健康女性肠道，在mrs固体培养基上，36℃～38℃培养24～48h，多次划线分离获得单菌落，该菌菌落白色、表面光滑、中央有凸起或扁平、不透明、有光泽、质地软，菌体形态呈规则性杆状、有长杆或短杆状、呈链状排列；液体培养获得发酵菌液。
1.2.2菌株功能特性
鼠李糖乳杆菌pb-lr76菌株具有很好的胃酸和胆盐耐受性以及细胞粘附性，能在人体肠道内很好定殖，对肠道有害菌如沙门氏菌、大肠埃希氏菌、产气荚膜梭菌等有害菌具有很好的抑制效果；在动物实验中被证明具有极佳的改善哮喘的作用效果。
1.2.3菌种鉴定
分离、纯化菌种，经16srrna基因作为marker片段，通用引物扩增出基因中16srrna序列，再进行电泳检测，使用3730xl测序仪进行一代双末端测序，获得abi测序峰图文件，通过软件组装后，与nt数据库进行比对，获得近源物信息，确认为鼠李糖乳杆菌，菌株编号为pb-lr76，其16srrna序列为：
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1.2.4菌种保藏
鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)pb-lr76，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2018887。
1.3乳双歧杆菌hh-ba68：可从郑州和合生物工程技术有限公司购买得到。
实施例2具有改善哮喘作用的益生菌组合物的制备
2.1获取约氏乳杆菌lbj456、鼠李糖乳杆菌pb-lr76和乳双歧杆菌hh-ba68
2.1.1约氏乳杆菌lbj456的获取
将约氏乳杆菌lbj456接种在mrsa液体培养基中，在36～38℃下静止培养24h得到发酵菌液；
2.1.2鼠李糖乳杆菌pb-lr76的获取
将鼠李糖乳杆菌pb-lr76接种在mrsa液体培养基中，在36～38℃下静止培养24h得到发酵菌液；
2.1.3乳双歧杆菌hh-ba68的获取
将乳双歧杆菌hh-ba68接种在mrsb液体培养基中，在36～38℃下静止培养48h得到发酵菌液。
2.2菌粉的制备
将上述2.1部分制备得到的3种菌种的发酵菌液，分别离心(离心条件：12000rpm)，收集沉淀物，分别得到菌泥；向所得3种菌泥中分别添加冻干保护剂(保护剂固体成分百分比组成为脱脂奶粉40％、海藻糖30％、麦芽糊精20％、低聚果糖5％、甘油3％、乳糖2％；固体保护剂加过滤水溶解，配制成20％浓度的液体保护剂，经115灭菌处理15分钟，冷却后按菌泥：液体保护剂＝1:3的比例添加液体保护剂)，进行乳化处理(乳化条件：100rpm，搅拌10min)，并进行真空冷冻干燥处理43h(冷冻干燥条件：预冻温度-45℃、冷阱温度-60℃开始抽真空，控制解析温度28～30℃)，分别得到冷冻干燥菌饼，经粉碎20目过筛处理，分别得到菌粉。2.3具有改善哮喘作用的益生菌组合物
将上述2.2制备得到的约氏乳杆菌lbj456菌粉、鼠李糖乳杆菌pb-lr76菌粉、乳双歧杆菌hh-ba68菌粉，分别按比例称量(3种菌粉的质量百分数分别为60％、30％、10％)，称量后充分混合均匀，得到混合菌粉(总活菌数为3.0×1011cfu/g)，再添加辅料(辅料固体成分百分比组成为麦芽糊精90％、微晶纤维素9％、硬脂酸镁1％；按混合菌粉：固体辅料＝1:2的比例添加固体辅料)，再进行充分均匀混合(三维混合机，混合15min)，即得到该益生菌组合物(总活菌数为1.0×1011cfu/g)。
经上述制备方法所制得的一种具有改善哮喘作用的益生菌组合物，包括一株约氏乳杆菌功能菌株lbj456，一株鼠李糖乳杆菌功能菌株pb-lr76；两种功能菌株与乳双歧杆菌hh-ba68，共同组成一种具有改善哮喘作用的益生菌组合物。该益生菌组合物经120例人群试食试验统计结果证明，对改善哮喘作用的有效率达到65％。
实施例3具有改善哮喘作用的益生菌组合物的制备
3.1获取约氏乳杆菌lbj456、鼠李糖乳杆菌pb-lr76和乳双歧杆菌hh-ba68
3.1.1约氏乳杆菌lbj456的获取
将约氏乳杆菌lbj456接种在mrsa液体培养基中，在36～38℃下静止培养20h得到发酵菌液；
3.1.2鼠李糖乳杆菌pb-lr76的获取
将鼠李糖乳杆菌pb-lr76接种在mrsa液体培养基中，在36～38℃下静止培养20h得到发酵菌液；
3.1.3乳双歧杆菌hh-ba68的获取
将乳双歧杆菌hh-ba68接种在mrsb液体培养基中，在36～38℃下静止培养36h得到发酵菌液。
3.2菌粉的制备
将上述3.1部分制备得到的3种菌种的发酵菌液，分别离心(离心条件：10000rpm)，收集沉淀物，分别得到菌泥；向所得3种菌泥中分别添加冻干保护剂(保护剂固体成分百分比组成为脱脂奶粉40％、海藻糖35％、麦芽糊精20％、乳糖5％；固体保护剂加过滤水溶解，配制成30％浓度的液体保护剂，经115灭菌处理15分钟，冷却后按菌泥：液体保护剂＝1:2的比例添加液体保护剂)，进行乳化处理(乳化条件：120rpm，搅拌8min)，并进行真空冷冻干燥处理45h(冷冻干燥条件：预冻温度-45℃、冷阱温度-60℃开始抽真空，控制解析温度28～30℃)，分别得到冷冻干燥菌饼，经粉碎40目过筛处理，分别得到菌粉。
3.3具有改善哮喘作用的益生菌组合物
将上述3.2制备得到的约氏乳杆菌lbj456菌粉、鼠李糖乳杆菌pb-lr76菌粉、乳双歧杆菌hh-ba68菌粉，分别按比例称量(3种菌粉的质量百分数分别为60％、25％、15％)，称量后充分混合均匀，得到混合菌粉(总活菌数为5.0×1011cfu/g)，再添加辅料(辅料固体成分百分比组成为麦芽糊精70％、无水葡萄糖20％、二氧化硅10％；按混合菌粉：固体辅料＝1:9的比例添加固体辅料)，再进行充分均匀混合(三维混合机，混合10min)，即得到该益生菌组合物(总活菌数为5.0×1010cfu/g)。
经上述制备方法所制得的一种具有改善哮喘作用的益生菌组合物，包括一株约氏乳杆菌功能菌株lbj456，一株鼠李糖乳杆菌功能菌株pb-lr76；两种功能菌株与乳双歧杆菌hh-ba68，共同组成一种具有改善哮喘作用的益生菌组合物。该益生菌组合物经120例人群试食试验统计结果证明，对改善哮喘作用的有效率达到62％。
实施例4具有改善哮喘作用的益生菌组合物的制备
4.1获取约氏乳杆菌lbj456、鼠李糖乳杆菌pb-lr76和乳双歧杆菌hh-ba68
4.1.1约氏乳杆菌lbj456的获取
将约氏乳杆菌lbj456接种在mrsa液体培养基中，在36～38℃下静止培养18h得到发酵菌液；
4.1.2鼠李糖乳杆菌pb-lr76的获取
将鼠李糖乳杆菌pb-lr76接种在mrsa液体培养基中，在36～38℃下静止培养18h得到发酵菌液；
4.1.3乳双歧杆菌hh-ba68的获取
将乳双歧杆菌hh-ba68接种在mrsb液体培养基中，在36～38℃下静止培养32h得到发酵菌液。
4.2菌粉的制备
将上述4.1部分制备得到的3种菌种的发酵菌液，分别离心(离心条件：11000rpm)，收集沉淀物，分别得到菌泥；向所得3种菌泥中分别添加冻干保护剂(保护剂固体成分百分比组成为脱脂奶粉30％、海藻糖40％、麦芽糊精20％、乳糖5％、甘油5％；固体保护剂加过滤水溶解，配制成25％浓度的液体保护剂，经115灭菌处理15分钟，冷却后按菌泥：液体保护剂＝1:2.5的比例添加液体保护剂)，进行乳化处理(乳化条件：80rpm，搅拌12min)，并进行真空冷冻干燥处理38h(冷冻干燥条件：预冻温度-45℃、冷阱温度-60℃开始抽真空，控制解析温度28～30℃)，分别得到冷冻干燥菌饼，经粉碎30目过筛处理，分别得到菌粉。
4.3具有改善哮喘作用的益生菌组合物
将上述4.2制备得到的约氏乳杆菌lbj456菌粉、鼠李糖乳杆菌pb-lr76菌粉、乳双歧杆菌hh-ba68菌粉，分别按比例称量(3种菌粉的质量百分数分别为60％、15％、25％)，称量后充分混合均匀，得到混合菌粉(总活菌数为5.0×1011cfu/g)，再添加辅料(辅料固体成分百分比组成为麦芽糊精60％、水溶性淀粉40％；按混合菌粉：固体辅料＝0.5:9.5的比例添加固体辅料)，再进行充分均匀混合(三维混合机，混合12min)，即得到该益生菌组合物(总活菌数为2.5×1010cfu/g)。
经上述制备方法所制得的一种具有改善哮喘作用的益生菌组合物，包括一株约氏乳杆菌功能菌株lbj456，一株鼠李糖乳杆菌功能菌株pb-lr76；两种功能菌株与乳双歧杆菌hh-ba68，共同组成一种具有改善哮喘作用的益生菌组合物。该益生菌组合物经120例人群试食试验统计结果证明，对改善哮喘作用的有效率达到67％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>郑州和合生物工程技术有限公司
<120>一种具有改善哮喘作用的益生菌组合物及其制备方法
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1532
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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