一种仿肌腱支架材料的制备方法及其在肌腱损伤的再生修复中的应用与流程

本发明属于生物医药领域，特别涉及一种仿肌腱平行胶原支架材料的自组装制备方法，和该自组装材料在完全离断性肌腱缺损的再生修复中的应用，进一步涉及一种仿肌腱支架材料的制备方法及其在肌腱损伤的再生修复中的应用。

背景技术：

天然肌腱是由有序平行排列的i型胶原纤维束组成，负责传递由骨骼和肌肉产生的力量而使身体发生运动。肌腱损伤是常见的运动损伤，占运动损伤的50％。成年后的肌腱组织细胞少、血供差等因素导致损伤后很难自行愈合，因此恢复天然肌腱组织的结构和功能仍然是至今无法解决的难题。目前临床修复肌腱损伤常见的方法包括自体移植、同种异体移植、异种移植、肌腱缝合术、假体材料修复术等。然而，以上治疗方法存在明显弊端，比如移植来源不佳、疾病传播、免疫排斥、术后高复发率等。

近年来，组织工程利用支架材料构建仿生微环境，诱导干细胞向肌腱系定向分化从而促进肌腱再生修复，为肌腱损伤的治疗提供新的策略。人工肌腱支架材料研究由来已久，从最原始的蚕丝、火棉胶到后来的硅橡胶、聚四氟乙烯棒、碳纤维、小肠粘膜下层等，但这些材料都有其局限性，如生物相容性差，低降解率，不能模拟天然肌腱组织微纳拓扑结构，导致肌腱再生效果不理想。理想的肌腱组织替代材料应与天然肌腱具有一致的微纳结构和理化性能，具有良好的生物相容性和生物可降解性，力学性能及机械强度，其起到临时的细胞外基质的作用，提供良好的生长微环境，从而促进细胞分化。wang等通过模拟肌腱胶原纤维的平行排列特征，制备平行有序的pcl/gelatin支架材料，可诱导成纤维细胞向肌腱系定向分化。但静电纺丝技术制备的支架材料不具备天然肌腱纤维的纳米有序拓扑结构，且材料的生物相容性和降解性能不能满足肌腱再生的要求。

技术实现要素：

技术问题：为了解决上述出现的问题，本发明基于天然肌腱结构，利用自组装原理，在外加平行机械拉伸力的作用下，以具平行结构的透析袋为组装模板，通过i型胶原分子的动态扩散，自组装形成平行有序的三维胶原支架材料。

技术方案：本发明提供了一种仿肌腱平行胶原支架的制备方法，步骤如下：

(1)胶原自组装：

利用聚乙二醇对胶原溶液浓缩，使其浓度达4.0-5.0mg/ml；透析袋将置于中性透析液中，浓缩后的胶原溶液倒入透析袋中，使用力学器械于透析袋两端施加轴向平行、恒定的延伸拉力，将载有透析袋的容器置入摇床中，保持摇床处于低速离心旋转中，使容器底部产生由上至下渗透压流，12-24小时透析后，获得自组装平行胶原纤维；

(2)三维多孔支架的合成：

将步骤(1)得到的自组装平行胶原纤维两端保持持续的平行拉力负载，-20～-40℃冷冻20-24h，优选24h，于-90～-105℃，优选-105℃，0.12-0.45mbar冻干机真空干燥，得到三维海绵状的胶原支架；

(3)三维仿肌腱平行胶原支架的合成：

将步骤(2)得到的三维海绵状的胶原支架在含有1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐的乙醇水溶液中交联3-5h，再用甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到仿肌腱平行胶原支架材料。

作为改进，步骤(1)中，浓缩采用的聚乙二醇的分子量为8000-12000。

作为改进，步骤(1)中，透析袋的分子量为3000-4000，透析温度36-38℃，透析时间12-24h；透析液为20-35mmna2hpo4、8-18mmkh2po4、150-250mmkcl水溶液，其ph为7，优选地透析液为30mmna2hpo4、10mmkh2po4、200mmkcl水溶液，其ph为7。

作为改进，步骤(2)中，1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐edc占整个溶液的质量百分比为0.75-1.25％；所述甘氨酸溶液的质量百分浓度为0.5-1.5％，乙醇溶液的体积比浓度为75-85％。

同时，本发明还提供了上述仿制备方法获得的仿肌腱平行胶原支架在完全离断性肌腱缺损再生修复中的应用。

同时，本发明还提供了一种仿肌腱平行胶原支架，是由胶原纤维沿同一方向，呈180°平行分布排列，任两层胶原纤维之间分布有孔隙构成的三维平行多孔支架。

有益效果：本发明中胶原采用热动力学控制的动态扩散的自组装模式，利用透析袋与胶原分子之间的分子质量差，使得胶原分子沿着渗透压差方向动态弥散抑制胶原分子自身的静电吸引力，在两侧恒定的机械拉力的引导下，最终自组装形成仿肌腱天然结构的平行支架材料，胶原纤维平行有序排列，不管在横向或者纵向都极其模拟近似天然肌腱组织的排列分布。支架材料良好的生物相容性以及结构特异性，有利于引导肌腱干细胞向肌腱方向特异性分化并引导新生胶原基质的方向性沉积改建，实现肌腱缺损修复再生治疗。

组织工程学要求生物材料需要具备的首要条件是有良好的生物相容性，而对于肌腱组织工程来说，有序平行的细胞外基质结构影响肌腱干细胞的分化命运，本发明中材料不管在体外还是体内都具有良好的生物相容性，并且以其特征性的平行有序结构引导肌腱干细胞细胞相对平行有序在支架材料中伸展，体内体外都可以最终分化为肌腱细胞，并特异性表达肌腱相关基因。

材料与肌腱宿主之间良好的相互作用促进新生肌腱的产生，在大鼠肌腱完全离断性缺损模型当中，本发明的胶原共组装仿肌腱纳米支架材料可在无肌腱细胞和促肌腱分化因子存在下诱导结构特异性新生肌腱产生，恢复大鼠肌腱功能，再生效果可媲美自体移植肌腱。

该支架制备过程简便易行，有利于实现工业化大规模生产。

附图说明

图1为本发明仿肌腱平行胶原支架材料自主装的制备流程图。

图2(a)为天然大鼠肌腱以及本发明中自组装支架材料的扫描电镜图；图2(b)为天然大鼠肌腱以及本发明中自组装支架材料的透射电镜图。

图3(a)为本发明中肌腱干细胞在支架材料培养2天之后的单个细胞的细胞骨架蛋白f-actin的免疫荧光图；图3(b)为本发明中肌腱干细胞在支架材料培养14天之后的细胞骨架f-actin免疫荧光图。

图4(a)为本发明中载有肌腱干细胞的支架材料移植入裸鼠皮下8周后的he染色以及masson染色图；图4(b)为本发明中载有肌腱干细胞的支架材料移植入裸鼠皮下8周后肌腱相关基因col1、tnc以及增殖相关基因ki67的免疫荧光图。

图5(a)为本发明中自组装支架材料移植修复完全离断性肌腱缺损的手术示意图；图5(b)为肌腱完全离断缺损后，对照组不采取任何处理措施，实验组使用本发明中自组装支架材料修复后的第2周、4周、8周的he和masson染色图；图5(c)为肌腱完全离断缺损后，对照组不采取任何处理措施，实验组使用本发明中自组装支架材料修复后第8周的肌腱相关基因tnc、tnmd的免疫荧光图，以及对应的统计图。

图5(d)为肌腱完全离断缺损后，对照组不采取任何处理措施，实验组使用本发明中自组装支架材料修复后的第1周、4周、8周的动物足部脚印图，以及对应的统计图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中，使用的原料及采购来源如下：鼠尾i型原胶原溶液(bdbio-sciences)、透析袋(3500da,invitrogen,paisly,uk)、甘氨酸(sigma-aldrich，usa)、1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(sigma-aldrich，usa)、聚乙二醇10000(sigma-aldrich，usa)、na2hpo4(sigma-aldrich，usa)、kh2po4(sigma-aldrich，usa)、kcl(sigma-aldrich，usa)。其中图1为自组装仿肌腱平行胶原支架材料的大致制备流程图，以下实施例进行说明本发明。

实施例1

制备仿肌腱胶原支架材料的方法，具体步骤如下：

(1)胶原自组装：采用热动力学控制的动态扩散自组装模式，将提取并纯化的i型鼠尾原胶原溶液采用聚乙二醇8000进行浓缩，使其浓度达4.5mg/ml；用透析袋(3500分子量)置于中性透析液中，使用力学器械于透析袋两端施加轴向平行、恒定的延伸拉力，将载有透析袋的容器置入37℃摇床中，保持摇床处于低速离心旋转中，使容器底部产生由上至下渗透压流，12小时透析后，即得自组装平行胶原；透析液为30mmna2hpo4、10mmkh2po4、200mmkcl水溶液，其ph为7；

(2)三维多孔支架的合成：

将步骤(1)得到的自组装平行胶原纤维两端保持持续的平行拉力负载，-20～-40℃冷冻24h，于-105℃，0.12-0.45mbar冻干机真空干燥，得到三维海绵状的胶原支架；

(3)三维仿肌腱平行胶原支架的合成：

将步骤(2)得到的三维海绵状的胶原支架在含有1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐的乙醇水溶液中交联3h，再用甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到仿肌腱平行胶原支架材料。1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐edc占整个溶液的质量百分比为1％；所述甘氨酸溶液的质量百分浓度为1％，乙醇溶液的体积比浓度为80％。

实施例2

制备仿肌腱胶原支架材料的方法，具体步骤如下：

(1)胶原自组装：采用热动力学控制的动态扩散自组装模式，将提取并纯化的i型鼠尾原胶原溶液采用聚乙二醇10000进行浓缩，使其浓度达5mg/ml；用透析袋(3000分子量)置于中性透析液中，使用力学器械于透析袋两端施加轴向平行、恒定的延伸拉力，将载有透析袋的容器置入36℃摇床中，保持摇床处于低速离心旋转中，使容器底部产生由上至下渗透压流，24小时透析后，即得自组装平行胶原；透析液为30mmna2hpo4、10mmkh2po4、200mmkcl水溶液，其ph为7；

(2)三维多孔支架的合成：

将步骤(1)得到的自组装平行胶原纤维两端保持持续的平行拉力负载，-20～-40℃冷冻20h，于-100℃，0.12-0.45mbar冻干机真空干燥，得到三维海绵状的胶原支架；

(3)三维仿肌腱平行胶原支架的合成：

将步骤(2)得到的三维海绵状的胶原支架在含有1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐的乙醇水溶液中交联3h，再用甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到仿肌腱平行胶原支架材料。1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐edc占整个溶液的质量百分比为0.75％；所述甘氨酸溶液的质量百分浓度为1.5％，乙醇溶液的体积比浓度为75％。

实施例3

制备仿肌腱胶原支架材料的方法，具体步骤如下：

(1)胶原自组装：采用热动力学控制的动态扩散自组装模式，将提取并纯化的i型鼠尾原胶原溶液采用聚乙二醇12000进行浓缩，使其浓度达4.0mg/ml；用透析袋(4000分子量)置于中性透析液中，使用力学器械于透析袋两端施加轴向平行、恒定的延伸拉力，将载有透析袋的容器置入36.5℃摇床中，保持摇床处于低速离心旋转中，使容器底部产生由上至下渗透压流，19小时透析后，即得自组装平行胶原；透析液为30mmna2hpo4、10mmkh2po4、200mmkcl水溶液，其ph为7；

(2)三维多孔支架的合成：

将步骤(1)得到的自组装平行胶原纤维两端保持持续的平行拉力负载，-20～-40℃冷冻22h，于-95℃，0.12-0.45mbar冻干机真空干燥，得到三维海绵状的胶原支架；(3)三维仿肌腱平行胶原支架的合成：

将步骤(2)得到的三维海绵状的胶原支架在含有1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐的乙醇水溶液中交联3h，再用甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到仿肌腱平行胶原支架材料。1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐edc占整个溶液的质量百分比为1.25％；所述甘氨酸溶液的质量百分浓度为0.5％，乙醇溶液的体积比浓度为85％。

实施例4

为了验证自组装形成的仿肌腱平行胶原支架材料的微观结构近似于天然肌腱组织，通过扫描电镜以及透射电镜实验比较组装的支架材料和天然肌腱的胶原纤维排列情况。

进行以下处理：

1.分离6-8周sd大鼠的achilles肌腱组织，充分剥离表面的筋膜和附着的肌肉后，pbs将血液冲洗干净后，置于2.5％戊二醛固定3小时后；

a.扫描电镜观察天然肌腱组织的微观表面形貌：使用0.1mol/l二甲胂酸钠缓冲液(ph为7.4)反复漂洗，经梯度酒精脱水(50％－100％)，并冻干，喷金后，在15kv电压下使用扫描电镜观察组织表面形貌。

b.透射电镜观察天然肌腱组织胶原纤维横向和纵向截面的排列分布情况：使用0.1mol/l二甲胂酸钠缓冲液(ph为7.4)反复漂洗，经梯度酒精脱水(50％－100％)，树脂渗透，包埋聚合后，使用超薄切片的方法切厚为50-70nm厚度的薄片，置于枸缘酸钠染液中染色，1％naoh溶液洗一次，水洗三次后，干燥后使用透射电镜观察胶原纤维的排列和分布情况。

2.实施例1-3任一制备得到仿肌腱平行胶原支架材料

a.扫描电镜观察支架材料的微观表面形貌：将实施例1制备得到的支架材料经梯度酒精脱水后(50％－100％)，并冻干，喷金后，在15kv电压下使用扫描电镜观察组织表面形貌。

b.透射电镜观察支架材料胶原纤维横向和纵向截面的排列分布情况：经梯度酒精脱水(50％－100％)，树脂渗透，包埋聚合后，使用超薄切片的方法切厚为50-70nm厚度的薄片，置于枸缘酸钠染液中染色，1％naoh溶液洗一次，水洗三次后，干燥后使用透射电镜观察胶原纤维的排列和分布情况。

扫描电镜结果显示：仿肌腱平行胶原支架材料具有和天然肌腱类似的平行有序排列的胶原纤维结构，见图2a。

透射电镜结果显示；仿肌腱平行胶原支架材料不管在横截面还是纵截面具有和天然肌腱近似的胶原纤维排列分布情况，胶原纤维直径略小于天然肌腱组织，见图2b。

实施例5

为了验证仿肌腱平行胶原支架材料的微观结构影响肌腱干细胞的形态以及肌腱向分化。

进行以下处理：

预先将支架材料紫外线消毒2小时后，浸没于75％的酒精当中，每2-3小时更换新的75％酒精溶液，之后使用无菌的pbs溶液反复冲洗三次后，置于12孔板当中，加入无血清培养基，置孔板于37度孵箱中，隔夜放置，第二天加入1x104个肌腱干细胞于材料上，更换15％胎牛血清的dmem培养基；

a.于培养第2天弃去培养基，无菌pbs轻柔清洗2-3次后，加入10％多聚甲醛溶液固定30分钟，进行tublin和f-acin免疫荧光细胞染色；

结果显示：单个肌腱干细胞沿着胶原纤维排列方向平行向两端伸展，见图3a。

b.于培养第14天弃去培养基，无菌pbs轻柔清洗2-3次后，加入10％多聚甲醛溶液固定30分钟，进行细胞骨架蛋白f-acin和肌腱细胞相关基因col1、tnmd的免疫荧光细胞染色；

结果显示：肌腱干细胞在支架材料上经过连续14天培养后，细胞数目明显增多，f-actin免疫荧光染色显示细胞数目虽然增多，但是细胞依然沿着平行的胶原纤维有序平行延伸，并且免疫荧光染色显示14天后支架材料上的细胞大多阳性表达肌腱细胞相关基因col1和tnmd，见图3b。

实施例6

为了验证仿肌腱平行胶原支架材料在体内具有良好的生物相容性，具备异位形成肌腱样组织的能力。

进行以下处理：

预先将支架材料紫外线消毒2小时后，浸没于75％的酒精当中，每2-3小时更换新的75％酒精溶液，之后使用无菌的pbs溶液反复冲洗三次后，置于12孔板当中，加入无血清培养基，置孔板于37度孵箱中，隔夜放置，第二天加入1x105个肌腱干细胞于材料上，更换15％胎牛血清的dmem培养基，于培养第3天更换新鲜培养基，将载有肌腱干细胞的支架材料移植入balb/c裸鼠背部皮下，经过八周后，取出移植的支架材料，使用无菌pbs冲洗干净后，使用10％多聚甲醛固定，之后脱水、包埋、切片。

a.对8周后的肌腱样组织切片进行he和masson染色。

结果显示：8周后支架材料改建形成平行有序排列的肌腱样胶原纤维结构，胶原纤维上均匀附着分化的肌腱细胞，见图4a。

b.对8周后的肌腱样组织切片进行肌腱细胞相关基因col1、tnc和增殖相关标志物ki67的免疫荧光染色。

结果显示：8周后的支架材料上的分化的肌腱细胞大部分特异性表达肌腱细胞相关基因col1和tnc，且部分细胞阳性表达增殖标志物ki67,显示材料具有良好的生物相容性和肌腱结构特异性，见图4b。

实施例7

为了验证仿肌腱平行胶原支架材料可以修复缺损肌腱组织的结构和功能。

进行以下处理：

构建大鼠肌腱全切缺损模型，在肌腱中1/3处去除4-5mm长度肌腱组织，对照组离断后保持离断缺损状态，不给予任何处理，实验组将支架材料沿着断端两端嫁接缝合，使用6-0型手术缝合线缝合皮肤，手术后实验侧后肢制动一周，具体流程见图5a。

a.在手术后第2周、第4周、第8周后，解剖分离出再生的肌腱组织，使用无菌pbs冲洗干净后，使用10％多聚甲醛固定，之后脱水、包埋、切片，分布进行he和masson染色。

结果显示：手术第2周后，实验组支架材料仍然较好地维持在损伤区域，呈现相对平行有序的分布，有较多炎性细胞浸润，对照组可见断断续续的散在胶原纤维以及空泡样病变；第4周后，实验组支架材料间的孔隙逐渐被沉积的胶原基质填充，但沉积的胶原依旧保持较为平行有序，对照组缺损区域仍旧未完全修复；第8周后，实验组支架材料逐渐改建形成平行有序排列的肌腱样胶原纤维结构，细胞数目较第4周显著减少，对照组胶原纤维部分连接，但仍存在离断区域；见图5b。

b.对8周后组织切片进行肌腱相关基因tnmd、tnc的免疫荧光染色。

结果显示：手术第8周后，实验组再生的肌腱组织中大部分阳性表达肌腱相关基因tnmd、tnc，而对照较少或者不表达肌腱相关基因tnmd、tnc，表明支架材料再生的平行胶原纤维结构具备肌腱特异性，实验组和对照组相比具有统计学意义，见图5c。

c.对1周、4周、8周的对照组和实验组大鼠的足印情况进行记录评价，检测支架材料对肌腱功能恢复的促进效果。

结果显示：手术第1周时，实验组和对照组对象足部无法正常伸展，五指较为靠拢。

手术第4周后，实验组对象足部伸展情况改善很明显，而对照组足部伸展稍改善，较实验组差；手术第8周后，实验组对象足部伸展情况几乎完全改善，接近正常未损伤对象足部伸展情况，而对照组与第4周对比改善不明显，依旧伸展受限，实验组和对照组相比具有统计学意义，见图5d。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。