喹诺里西啶类Cu+和或Fe2+螯合剂及其药用盐的用途的制作方法

本发明属于医药
技术领域：
，具体地说是一种具有cu+和/或fe2+离子螯合作用的生物碱类螯合剂及其药用盐在人类或其它哺乳动物与铜过载和/或铁过载相关的疾病中的用途。
背景技术：
：金属元素是微生物、动物及人类维持生命活动所必不可少的生命物质，通过与生物大分子相互作用如作为金属酶的结构或活性中心，引起蛋白质和核酸特定构象的改变等，而影响机体的生命活动过程。据统计近40%的已知酶系都需要金属离子作为酶活性部位的辅性因子来发挥作用，因此研究金属离子机体代谢过程将不仅有助于我们了解生命活动过程，而且对动物和人类疾病的防治以及环境污染的治理都将有极大的帮助。铜是机体内的必需微量金属元素之一，正常成人体内含铜约100~200mg，50~70％分布于肌肉和骨骼，20％在肝脏，5~10％在血液。人体每天摄入铜的量一般为2mg，最高耐受量约8mg，主要通过小肠从食物中以cu2+形式吸收入血，之后通过蛋白结合（如铜蓝蛋白结合了血液中90~95％的铜离子）输布到机体各组织中，参与到细胞色素c氧化酶、赖氨酰氧化酶、多巴胺β羟化酶、超氧化物歧化酶、酪氨酸酶等介导的氧化还原、骨骼生长、炎症免疫、神经、造血和血管新生等生命活动过程。然而，当血液中游离铜过多（包含亚铜离子cu+和铜离子cu2+,2cu2++2gsh⇋2cu++gssg+2h+），即未与铜蓝蛋白结合的游离铜过多，则会分布沉积到机体相关器官组织如肝脏、大脑、心脏、血管及肾脏中，并引起细胞内羟自由基的产生及脂质过氧化，导致氧化应激损伤，进而引发遗传性和非遗传性铜超载性疾病（铜的摄取转运与其相关基因疾病的讨论.广东化工.2016,43,97），如遗传性wilson疾病（临床上以肝损害、锥体外系症状、角膜色素环、肾脏损害、血液系统损害等为主要表现）和非遗传性铜超载糖尿病、硬皮病（copperandthesynthesisofelastinandcollagen.in:biologicalrolesofcopper.cibafoundationsymposium79.amsterdam:excerptamedica.1980,163）、口腔粘膜下纤维化（raisedtissuecopperlevelsinoralsubmucousfibrosis.joralpatholmed.2000,29,241）、着色性干皮症、糙皮症、干燥综合征、原发性肺动脉高压、心血管病、肿瘤侵袭转移、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、帕金森和阿尔茨海默病等（newrolesforcoppermetabolismincellproliferation,signaling,anddisease.jbiochem.2009,284,717；targetingcoppertotreatbreastcancer.science.2015,349,128；铜代谢及其在神经系统疾病中的作用.中国老年学杂志.2016,36,5456）。而相对于cu2+，游离的cu+更容易直接导致氧化应激损伤（cu++h2o2⇋cu2++oh˙+oh-），因此发现具有cu+螯合作用的铜螯合剂来安全有效地降低人体内过量的游离cu+和cu2+，并降低oh·等的生成以及改善其带来的氧化应激损伤，是针对铜超载引起的上述疾病的一种潜在治疗手段（chelationtherapyinwilson’sdisease:fromd-penicillaminetothedesignofselectivebioinspiredintracellularcu(i)chelators.daltontrans.2012,41,6359）。铁是机体内的必需微量金属元素之一，正常成人体内含铁约4～5g，每天摄入铁的量一般为10～15mg，最高耐受量约50mg。人体铁按功能可以分为功能铁和贮存铁两大类。功能性铁约占人体总铁量的70%，包括血红蛋白（约65%）、肌红蛋白（约3%）、脑红蛋白（约0.5%）和其他含铁酶类（约1%）；贮存铁约占人体总铁量的30%，主要以铁蛋白（约25%）和含铁血黄素的形式存在于肝、脾、骨髓、大脑的锥体外侧束的细胞核、肠和胎盘中。人体内铁主要通过十二指肠和空肠上段从食物中以fe2+形式吸收（thetypeivmucolipidosis-associatedproteintrpml1isanendolysosomalironreleasechannel.nature.2008,455,992），吸收的fe2+一部分在小肠黏膜上皮细胞中被氧化为fe3+后贮存于可溶性铁蛋白供机体再利用（fe2+吸收→fe3+贮存→fe2+释放利用）；另一部分吸收入血的fe2+经铜蓝蛋白氧化为fe3+并与血浆中的转铁蛋白结合输布到机体各组织，之后通过与转铁蛋白受体结合启动细胞内吞释放出fe2+并经二价金属转运蛋白转运释放到细胞质中（fe2+吸收→fe3+转运→fe2+释放利用），参与到血红蛋白、氧化/还原酶、固氮酶、过氧化物酶等介导的氧气运输、电子传递、氧化磷酸化、dna生物合成、神经递质合成、no代谢、造血及免疫防御等多种生命活动过程。然而，当血液中游离fe2+和或fe3+过多，即未与铁蛋白有效结合的fe2+、fe3+过多，则会分布沉积到机体相关器官组织如肝脏、脾脏、胰脏、骨髓、大脑、肺、肠道、肾脏、心脏中，其中过多的fe2+可以直接与h2o2通过fenton反应产生毒性更强的羟自由基oh·和fe3+，而且o2·-与fe3+通过haber-weiss反应又可产生fe2+，如此氧化还原循环反应，能产生大量的活性氧自由基，损伤细胞亚结构，诱发细胞凋亡（muhoberacbb,vidalr.frontagingneurosci.2013,5,32），进而引发遗传性和非遗传性铁超载性疾病（bodyironmetabolismandpathophysiologyofironoverload.intjhematol.2008;88,7；ironoverloadinhumandisease.nengljmed.2012,366,348），如遗传性血色病疾（临床上以皮肤色素沉着、肝硬化、继发性心脏病、关节炎、糖尿病为主要表现）、地中海贫血（临床上以贫血，肝脾肿大进行性加重，黄疸等为主要表现），以及非遗传性铁超载导致的骨髓纤维化、骨髓异常综合征、骨质疏松、慢性肾病、心梗、脑梗、脑出血（ironandiron-handlingproteinsinthebrainafterintracerebralhemorrhage.stroke.2003,34,2964）、神经退行性疾病、肝纤维化、非酒精性脂肪肝、胰腺炎、继发性血色病、迟发性皮肤卟啉病、线粒体铁超载性疾病（mitochondrialironoverload:causesandconsequences.curropingenetdev.2016,38,31），肝癌、肺癌、结肠癌、食管癌、胃肠道肿瘤、胰腺癌和乳腺癌（铁蛋白检测在临床中的应用.标记免疫分析与临床.2012,19,378）。因此，发展fe2+和或fe3+离子螯合剂，特别是发展具有fe2+螯合作用的螯合剂来安全有效地降低人体内过量的铁离子，并降低羟自由基oh·的生成以及改善其带来的氧化应激损伤，是针对铁超载引起的上述疾病的一种潜在治疗手段。值得注意的是，铜离子和铁离子代谢二者之间并非相互独立；相反，它们相互之间存在着密切的联系和影响（potentiationofglutathionelossandnervecelldeathbythetransitionmetalsironandcopper:implicationsforage-relatedneurodegenerativediseases.freeradicalbiomed.2018,115,92）。例如，当血浆铜蓝蛋白不足或者结合超载时，不仅容易导致血液中游离cu+和或cu2+过多，引起铜超载性疾病，而且容易导致血浆中fe2+不能及时转化为fe3+并与转铁蛋白结合，导致血浆游离铁离子过多引起铁超载性疾病（regulationofcopperandironhomeostasisbymetalchelators:apossiblechemotherapyforalzheimer’sdisease.acc.chem.res.2018,48,1332）。又如，在帕金森氏病中，黑质中的铁浓度增加过程中，会伴随着铜蓝蛋白亚铁氧化酶活性的降低（theneurotoxicityofiron,copperandmanganeseinparkinson’sandwilson’sdiseases.jtraceelemmedbio.2015,31,193），进而引发血浆铜离子超载。再如，临床研究发现，相对于正常组，糖尿病患者血清铁（11%）、铜（8%）水平明显较高，且主要表现为游离铁和游离铜水平的增加（serumcopper,zinc,andironlevels,andmarkersofcarbohydratemetabolisminpostmenopausalwomenwithprediabetesandtype2diabetesmellitus.jtraceelemmedbio.2017,43,46）。显然，在上述情况下，单一螯合作用的金属螯合剂往往难以有效改善铜超载和/或铁超载引起的相关疾病。因此，发展能同时作用于铁离子和铜离子的螯合剂来安全有效地调节人体内过量的游离铁和游离铜水平，是针对铜和/或铁超载引起的相关疾病的一种更有效的潜在治疗手段。技术实现要素：虽然临床上已经相继上市了针对铜过载的螯合剂如青霉胺、三乙烯四胺（teta）、二巯基丁二酸（dmsa）、二巯基丙磺酸钠（dmps）、二巯基丙醇，和针对铁过载的去铁胺、去铁酮和地拉罗司，但是这类药物在临床应用过程中仍然存在很多问题。例如，铜过载螯合剂青霉胺会产生较多的过敏和消化系统副作用，甚至还会导致骨髓抑制及肾脏损害等严重副作用；而二巯基丁二酸等含巯基的金属螯合剂往往具有难闻的臭味，且长期服用容易导致肾脏损害；铁螯合剂如地拉罗司虽然具有较好的铁螯合选择性，但未见报道能有效改善铁过载引起的铜离子代谢紊乱问题。更重要的，上述金属螯合剂对cu+和或fe2+诱导的羟自由基oh·的生成及其带来的氧化应激损伤亦无显著的改善作用。因此，本领域迫切需要开发一种新的具有cu+和/或fe2+螯合作用且能降低它们导致的氧化应激损伤的金属螯合剂。基于上述分析，本发明提供一种具有cu+和/或fe2+离子螯合作用的喹诺里西啶类生物碱螯合剂及其可药用的盐，可作为治疗铜过载和/或铁过载引起的疾病中的用途。优选地，所述治疗铜过载引起的疾病主要为wilson疾病、硬皮病、口腔粘膜下纤维化、着色性干皮症、糙皮症、干燥综合征、肌萎缩性脊髓侧索硬化症。优选地，所述治疗铁过载引起的疾病主要为遗传性血色病、继发性血色病、迟发性皮肤卟啉病、线粒体铁超载性病、地中海贫血、骨髓纤维化、骨髓异常综合征。所述的喹诺里西啶类生物碱cu+和/或fe2+离子螯合剂及其可药用的盐用于遗传性wilson疾病的治疗，更优选的，用于改善wilson疾病引起的肝损害、锥体外系症状、角膜色素环、肾脏损害、血液系统损害症状。所述的喹诺里西啶类生物碱cu+和/或fe2+离子螯合剂及其可药用的盐用于地中海贫血的治疗，更优选的，用于改善地中海贫血引起的遗传性溶血性贫血、肝脾肿大进行性加重和黄疸症状。所述的喹诺里西啶类生物碱cu+和/或fe2+离子螯合剂及其可药用盐，优选地，所述喹诺里西啶类生物碱为苦参碱，氧化苦参碱，槐果碱，氧化槐果碱，槐定碱，氧化槐定碱，主结构如式为：。本发明还提供上述喹诺里西啶类生物碱金属螯合剂可药用的盐。如本文所用，术语“药学上可药用的盐”是指主结构式化合物的非毒性酸盐。这些盐可在最终分离和纯化主结构式化合物时原位制得、或分别将合适的有机或无机酸与碱性官能团反应制得。代表性的酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、苯基丁酸、富马酸、富马酸单甲酯、草酸、丙二酸、丙戊酸、水杨酸、苹果酸、葡萄糖庚酸、二葡萄糖酸、天冬氨酸、藻酸、乳酸、苦味酸、琥珀酸、甘油磷酸、庚酸、烟酸、草酸、己酸、琥珀酸、扁桃酸、抗坏血酸、马来酸、酒石酸、苯磺酸、甲磺酸、牛磺酸或羟乙磺酸（参照：成盐药物的研究与开发.药学进展.2012,36,151）。此外，含氮的碱性基团可被如下试剂季铵盐化：烷基卤化物，如甲基、乙基、丙基、丁基的氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸盐，如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸酯；长链卤化物如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基的氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物如苄基和苯乙基溴化物等。由此得到水溶性或油溶性或可分散产品。根据本发明的第二方面，提供一种治疗cu+和或fe2+过载导致的相关疾病的药物组合物，其中含有治疗安全有效量的至少一种选自主结构式的化合物或其可药用的盐制备而成的口服药剂，或脂质体、白蛋白、高分子聚合物、无机纳米颗粒辅助制备的纳米药物注射制剂，或敷剂，或喷雾制剂，或与其他药物联合的组合物。有益效果1.相对于现有的铜螯合剂如三乙烯四胺，本发明喹诺里西啶类生物碱螯合剂不仅具有螯合cu+的优势，且能显著抑制cu+催化h2o2导致的羟自由基的产生，降低机体氧化应激损伤。2.相对于现有的铁螯合剂如地拉罗司，本发明喹诺里西啶类生物碱螯合剂不仅具有螯合fe2+的优势，且能显著抑制fe2+催化h2o2导致的羟自由基的产生，降低机体氧化应激损伤。3.本发明首次报道了喹诺里西啶类生物碱具有显著的螯合cu+和或fe2+的作用，从而创造性的为喹诺里西啶类生物碱相关药物临床的精准、合理用药提供重要指导。附图说明图1是本发明苦参碱给药铁过载模型大鼠骨髓铁染色图。图2是本发明苦参碱给药对着色性干皮症小鼠表皮相对厚度的影响。具体实施方式为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。实施例1.喹诺里西啶类生物碱对cu+螯合作用研究实验原理：2,9-二甲基菲咯啉（dmphen）和cu+在弱酸及中性溶液中生成一种稳定的黄色络合物cu(dmphen)2+，其吸光度与浓度关系符合朗伯-比尔定律。而加入亚铜螯合剂可以与2,9-二甲基菲咯啉竞争性螯合cu+而使吸光度发生降低性变化。试液与配制：(1)0.1g/l铜标准溶液：称取0.025g的cucl，用2nhcl溶液7ml溶解并移入1l容量瓶中，然后加蒸馏水稀释至0.1g/l。(2)1mol/lnaac溶液。(3)1.5g/l的2,9-二甲基菲咯啉水溶液：临用时配制。(4)10%的盐酸羟胺溶液。(5)苦参碱类待测样品：配制浓度分别为0、10-5、10-4、10-3、10-2mol/l的苦参碱水溶液。实验方法：取3支试管，分别定义试管1为2,9-二甲基菲咯啉(admphen)，试管2为空白参比(a参)，试管3为样品(a样)，按照表1要求分别加入0.1g/l的cucl标准液2ml，体积分数10%的盐酸羟胺1ml，不同浓度的苦参碱类待测样品溶液2ml，1.5g/l的2,9-二甲基菲咯啉2ml，1mol/lnaac5ml，每加入一种试剂都应初步混匀。然后，用去离子水定容至50ml，充分摇匀。最后，用自动酶标读数仪比色(波长457nm)，测定吸光度(a)值，a值越小表示铜离子螯合能力越强。每个样品重复3次，取平均值。表1.喹诺里西啶类生物碱螯合剂cu+螯合作用实验研究加样表dmphen(2ml)铜标准液(2ml)样品其他试剂试管1（aphen）++-+试管2（a参）+--+试管3（a样）++++*样品对cu+的螯合作用可用公式表示为：c=[aphen-a样]/[aphen-a参)]×100%。检测指标：绘制浓度—螯合作用曲线，由曲线得到螯合作用为50％时对应的浓度，定义为半数螯合浓度ec50，实验结果见表2。表2.喹诺里西啶类生物碱螯合剂cu+螯合作用化合物cu+螯合ec50化合物cu+螯合ec50苦参碱b苦参碱富马酸单甲酯盐a氧化苦参碱a苦参碱富马酸盐a槐果碱c苦参碱丙戊酸盐b氧化槐果碱b槐果碱富马酸单甲酯盐b苦参碱盐酸盐b槐果碱马来酸盐b苦参碱甲磺酸盐b槐果碱丙戊酸盐b苦参碱马来酸盐a三乙烯四胺c注：a:＜100μm；b:100~500μm；c:＞500μm。实施例2.喹诺里西啶类生物碱对fe2+螯合作用研究实验原理：邻二氮菲（phen）和fe2+在ph=3~9的溶液中生成一种稳定的橙红色络合物fe(phen)32+，其吸光度与浓度关系符合朗伯-比尔定律。而亚铁螯合剂可以与邻二氮菲竞争性螯合fe2+而使吸光度发生降低性变化。试液与配制：(1)0.1g/l铁标准溶液：称取0.1g的(nh4)2fe(so4)2·6h2o，用2nhcl溶液7ml溶解并移入1l容量瓶中，然后加蒸馏水稀释至0.1g/l。(2)1mol/lnaac溶液。(3)1.5g/l的邻二氮菲水溶液：临用时配制。(4)10%的盐酸羟胺溶液。(5)苦参碱类待测样品：配制浓度分别为0、10-5、10-4、10-3、10-2mol/l的苦参碱水溶液。实验方法：取3支试管，分别定义试管1为邻二氮菲(aphen)，试管2为空白参比(a参)，试管3为样品(a样)，按照表3要求分别加入标准液（nh4)2fe(so4)2·12h2o0.1g/l)2ml，体积分数10%的盐酸羟胺1ml，不同浓度的苦参碱类待测样品溶液2ml，1.5g/l的邻二氮菲2ml，1mol/lnaac5ml，每加入一种试剂都应初步混匀。然后，用去离子水定容至50ml，充分摇匀。最后，用自动酶标读数仪比色(波长510nm)，测定吸光度(a)值，a值越小表示铁离子螯合能力越强。每个样品重复3次，取平均值。表3.苦参碱螯合剂fe2+螯合作用实验研究加样表phen(2ml)铁标准液(2ml)样品其他试剂试管1（aphen）++-+试管2（a参）+--+试管3（a样）++++*样品对fe2+的螯合作用可用公式表示为：c=[aphen-a样]/[aphen-a参)]×100%。检测指标：绘制浓度—螯合作用曲线，由曲线得到螯合作用为50％时对应的浓度，定义为半数螯合浓度ec50，实验结果见表4。表4.苦参碱螯合剂fe2+螯合作用化合物fe2+螯合ec50化合物fe2+螯合ec50苦参碱b苦参碱富马酸单甲酯盐a氧化苦参碱a苦参碱富马酸盐a槐果碱c苦参碱丙戊酸盐b氧化槐果碱b槐果碱富马酸单甲酯盐b槐定碱b槐定碱马来酸盐b苦参碱甲磺酸盐b槐果碱丙戊酸盐b苦参碱马来酸盐a去铁酮a注：a:＜50μm；b:50~100μm；c:100~500μm；d:＞500μm。实施例3.喹诺里西啶类生物碱螯合剂对cu+诱导的羟自由基清除实验实验原理：羟自由基可由cu+-h2o2体系通过拟fenton反应产生，而罗丹明b与其发生反应后，其吸光度显著降低。抗氧化剂可以与oh·反应而使吸光度降低程度减弱。试液的配制：(1)罗丹明b溶液：准确称取罗丹明b24mg，用蒸馏水定容于250ml容量瓶中，得到浓度为2×10-4mol/l的溶液。(2)cucl溶液：:5mmol/l，准确称取cucl405mg，用水溶解，定容于100ml容量瓶中。(3)过氧化氢溶液：准确量取30％的h2o2溶液0.55ml，用蒸馏水定容于250ml容量瓶中，得到浓度为20mmol/l的溶液。(4)硫酸溶液：准确量取98％的浓硫酸0.5g，用蒸馏水定容于250ml容量瓶中，得到浓度为0.02mmol/l的溶液。实验方法：取三支试管分别定义试管1为空白参比（a参），试管2为羟自由基（a羟），试管3为样品（a样），按表5顺序加入试剂，启动反应后用蒸馏水稀释至20ml，5min后在550nm下测定吸光度。每个样品重复3次，取平均值。表5.苦参碱螯合剂清除羟自由基加样表罗丹明(0.7ml)硫酸(2ml)cucl(0.3ml)样品h2o2(0.2ml)试管1（a参）++---试管2（a羟）+++-+试管3（a样）+++++*样品对羟自由基的清除率s可用公式表示为：s=[a样-a羟]/[a羟-a参)]×100%检测指标：绘制浓度—清除率曲线，由曲线得到清除率为50％时对应的浓度，定义为半数抑制浓度ic50,实验结果见表6。表6.喹诺里西啶类生物碱清除cu+诱导的羟自由基清除作用化合物ic50化合物ic50苦参碱a苦参碱富马酸单甲酯盐a氧化苦参碱a苦参碱富马酸盐a槐定碱b苦参碱丙戊酸盐b氧化槐果碱b苦参碱马来酸盐a三乙烯四胺d槐果碱丙戊酸盐b注：a:＜50μm；b:50~100μm；c:100~500μm；d:＞500μm。实施例4.喹诺里西啶类生物碱螯合剂对fe2+诱导的羟自由基清除实验：实验原理：羟自由基可由fe2+-h2o2体系通过fenton反应产生，而罗丹明b与其发生反应后，其吸光度显著降低。抗氧化剂可以与oh·反应而使吸光度降低程度减弱。试液的配制：(1)罗丹明b溶液：准确称取罗丹明b24mg，用蒸馏水定容于250ml容量瓶中，得到浓度为2×10-4mol/l的溶液。(2)硫酸亚铁溶液：准确称取feso40.19g，用蒸馏水定容于250ml容量瓶中，得到浓度为5mmol/l的溶液。(3)过氧化氢溶液：准确量取30％的h2o2溶液0.55ml，用蒸馏水定容于250ml容量瓶中，得到浓度为20mmol/l的溶液。(4)硫酸溶液：准确量取98％的浓硫酸0.5g，用蒸馏水定容于250ml容量瓶中，得到浓度为0.02mmol/l的溶液。实验方法：取三支试管分别定义试管1为空白参比（a参），试管2为羟自由基（a羟），试管3为样品（a样），按表7顺序加入试剂，启动反应后用蒸馏水稀释至20ml，5min后在550nm下测定吸光度。每个样品重复3次，取平均值。表7.喹诺里西啶类生物碱螯合剂清除羟自由基加样表罗丹明(0.7ml)硫酸(2ml)feso4(0.3ml)样品h2o2(0.2ml)试管1（a参）++---试管2（a羟）+++-+试管3（a样）+++++*样品对羟自由基的清除率s可用公式表示为：s=[a样-a羟]/[a羟-a参)]×100%检测指标：绘制浓度—清除率曲线，由曲线得到清除率为50％时对应的浓度，定义为半数抑制浓度ic50,实验结果见表8。表8.喹诺里西啶类生物碱清除fe2+诱导的羟自由基清除作用化合物ic50值化合物ic50值苦参碱a苦参碱富马酸单甲酯盐a氧化苦参碱a苦参碱富马酸盐a槐定碱b苦参碱丙戊酸盐b氧化槐果碱b苦参碱马来酸盐a三乙烯四胺d槐果碱丙戊酸盐b注：a:＜50μm；b:50~100μm；c:100~500μm；d:＞500μm。实施例5.喹诺里西啶类生物碱螯合剂对肝豆状核变性模型鼠铜水平的影响：实验动物分组：动物及分组纯系健康雄性wistar大鼠60只，质量220-280g。实验前先适应性饲养1周，随机分为正常对照组、模型组、苦参碱类给药组和青霉胺阳性药对照组，每组各10只。实验动物模型制作及药物干预：大鼠进行分笼饲养。正常组（10只）大鼠喂食无铜基础饲料；实验组（50只）大鼠喂饲铜负荷饮食（含硫酸铜lg/kg的粉状饲料和0.185％硫酸铜去离子水）8周；第5周开始，将存活的60只模型大鼠随机分为6组，正常组：10只；模型对照组：10只；苦参碱组：10只，予以100mg／kg每日1次灌胃；氧化苦参碱组：10只予以100mg／kg每日1次灌胃；苦参碱富马酸盐组：10只予以100mg／kg每日1次灌胃；阳性对照组：10只，予以100mg／kg青霉胺每日1次灌胃，均为4周。实验方法及检测：铜负荷饮食8周结束后禁食18h并麻醉动物，腹主动脉取血2ml置予抗凝管静置半小时，4℃3000r/min离心10min，分离血清，测血清铜含量。剖腹取肝组织，标本先用0.9％nacl反复洗净，于净滤纸吸于并秤取湿重500mg，用浓硝酸10ml低温加热进行消化，等组织完全溶解至黄色澄清透明后，采用原子吸收分光广度法测定铜离子含量。24h尿铜离子测定：处死前5d单只置于代谢笼连续取3d(72h尿液)，摇匀后准确量出尿液体积，测定时取2ml尿液加0.1mlh2so4。混匀待测，采用原子吸收分光光度法测定。统计学方法计量数据均以均数±标准差(x±s)表示，统计学方法采用单因素方差分析及lsd-t检验。表9.苦参碱类螯合剂对肝豆状核变性模型鼠体内铜水平的影响组别肝铜(μg/g)尿铜(μg/24h)血清铜（μmol/l）正常对照组5.90±0.592037.27±868.2523.98±2.47模型组78.70±10.67△△3656.20±1688.43△△60.34±5.73△△苦参碱28.95±3.85##7335.26±1038.10##34.76±3.56##氧化苦参碱34.90±4.26##7037.27±1172.25##36.21±3.42##苦参碱富马酸盐27.24±3.28##7215.29±1232.13##32.32±3.16##青霉胺29.87±4.56##7235.60±1156.59##35.28±4.42##注：与正常组比较，△△p<0.01；与模型组比较，#p<0.05，##p<0.01。实施例6.苦参碱类螯合剂对铁过载大鼠骨髓、肝、脾和血清铁的影响实验动物分组：雄性wistar大鼠(spf级)60只，体重140-180g，适应性喂养一周后按随机数字表法分为四组：正常对照组、模型组、苦参碱类给药组和去铁酮阳性药对照组，每组各10只。实验动物模型制作及药物干预：大鼠进行分笼饲养，按照ain-93g配方，制备无铁基础饲料。正常组（10只）喂食无铁基础饲料；实验组（50只）喂食无铁基础饲料基础上隔日经腹腔单剂量注射给与右旋糖酐铁12mg12周。6周后，将实验组随机模型大鼠随机分为5组，模型对照组：10只；苦参碱组：10只，予以100mg／kg每日1次灌胃；氧化苦参碱组：10只予以100mg／kg每日1次灌胃；苦参碱富马酸盐组：10只予以100mg／kg每日1次灌胃；阳性对照组：10只，予以100mg／kg去铁酮每日1次灌胃，均为6周。实验方法及检测：实验结束后，大鼠禁食8小时，10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉采血，取脏器待测。骨髓铁染色：腹主动脉取血后，立即剔除大鼠右腿股骨肌肉与筋膜，用10μl胎牛血清冲洗骨髓腔，迅速推片。采用普鲁士蓝染色法半定量定性计数骨髓细胞外铁：低倍镜下观察全部骨髓膜，找到骨髓小粒中蓝绿色颗粒、小珠或小块，再换油镜鉴别阳性程度(见图2)。肝、脾组织铁、血清铁：剪取适量肝、脾组织，加生理盐水制备成10%的组织匀浆液，比色法测肝、脾组织铁含量；新鲜抗凝血静置半小时，4℃3000r/min离心10min，分离血清，测血清铁含量(严格按照组织铁、血清铁试剂盒说明书操作)。统计学方法利用spss19.0软件对结果进行统计分析。计量资料均以均数±标准差（x±s）表示，统计学方法采用单因素方差分析及lsd-t检验。表10.苦参碱类螯合剂对铁过载模型鼠体内铁水平的影响组别肝铁(μg/g)脾铁(μg/g)血清铁（μmol/l）正常对照组44.25±9.3431.27±5.2875.57±10.55模型组128.70±10.67△△46.20±8.43△△120.34±9.74△△苦参碱给药组62.92±4.83##35.12±5.10##85.75±9.66##氧化苦参碱给药组74.31±5.25##37.27±4.95##96.23±10.42##苦参碱富马酸盐57.86±4.58##31.23±4.13##82.38±8.16##去铁酮给药组69.67±7.10##35.62±5.49##95.28±10.07##注：与正常组比较，△△p<0.01；与模型组比较，#p<0.05，##p<0.01。实施例7.苦参碱类螯合剂对着色性干皮症的干预作用实验动物分组：12只c57bl/6小鼠（雄性、8-10周、20-25g、spf级，由扬州大学比较医学中心提供），12只小鼠随机分为空白对照组（control，n=4）、模型组（model，n=4）和给药组（anti-itchessentialoil，n=4）。小鼠提前进行适应性饲养，实验开始前48小时用电动脱毛机对小鼠颈背部实验区域进行剃毛，随后称重，同一组内的小鼠在尾巴处进行编号。实验动物模型制作及药物干预：采用丙酮-乙醚-0.1%cucl水溶液建立着色性干皮症模型。将浸泡在混合溶液（丙酮和乙醚按1：1比例配制的混合物）中的化妆棉片轻微挤去多余的液体，敷在小鼠颈背部剃毛部位的皮肤上15s，然后用纯水浸泡过的棉片，敷在小鼠颈背部剃毛相同部位30s，同样棉片保证不可太湿也不可太干，每天在固定时间早晚共两次进行混合液刺激，空白组(control)的试剂均用水代替。给药组在第6-9天连续给药（0.1m苦参碱水溶液）。在造模第9天，处死小鼠，取小鼠颈背部皮肤组织(1cm×1cm)，4%多聚甲醛4℃固定48h，后置于20%的蔗糖溶液沉糖24小时。沉糖结束后，用otc包埋剂在-80℃速冻包埋沉糖后的组织（包埋前修剪为皮肤0.5*1cm大小的长方形），随后用冰冻切片机进行切片，切片厚度为16μm，切完的片子在-20℃冰箱保存。之后对片子进行he染色，中性树胶封片，拍照（明场），分析表皮厚度。实验结果如附图2所示。当前第1页12