原海葱苷A在制备治疗肝细胞肝癌药物中的用途

原海葱苷a在制备治疗肝细胞肝癌药物中的用途
技术领域
1.本发明属生物医药技术领域，涉及原海葱苷a新的制药用途，具体涉及原海葱苷a(proscillaridina)(cas466-06-8)在制备治疗肝癌尤其是肝细胞肝癌(hcc)药物中的用途。


背景技术：

2.现有技术公开了肝细胞癌(简称hcc)作为我国乃至全世界最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康。根据全球癌症统计的最新数据显示，hcc已成为全球十大致死恶性肿瘤之一，男性死亡患者明显多于女性，其中50％以上的新发和死亡病例发生在中国，且hcc发病率死亡率显现出农村高于城市，男性高于女性的趋势。
3.研究显示，hcc的发生发展与许多因素有关，如肝炎病毒感染，长期酒精摄入等。目前hcc的治疗仍以手术治疗为主，索拉非尼和瑞格非尼是现有的唯一被fda批准能用于治疗hcc的药物，然而，索拉非尼对晚期肝癌患者的总生存期增益不足3个月，因此，寻找其他靶向hcc的药物具有十分重要的意义。强心苷类化合物是一类有机化合物，主要分布于夹竹桃科、百合科、十字花科、桑科等十几个科的一百多种植物中，其由一个醇基或醇样基团(配基或苷元)与不同数量的糖分子结合而成，其结构如图1所示。强心苷类化合物主要分为两类—二烯内酯类(原海葱苷a等)及洋地黄(地高辛等)类，两者主要区别在于r结构的不同。正常情况下，na
+-k
+-atp酶可以保持细胞内外na
+
，k
+
相对稳定，强心苷类化合物可以抑制na
+-k
+-atp酶的活性从而减少na
+
外流和k
+
内流，进一步造成胞内ca
2+
浓度升高，从而提高心肌细胞传导性能，作用于心脏，加强心肌收缩力，主要用于治疗充血性心力衰竭和心律失常。
4.有研究采用上述强心苷类化合物用于癌症的治疗，迄今，尚未见原海葱苷a在制备治疗肝癌药物中的应用的报道。基于现有技术的现状，本技术的发明人拟提供原海葱苷a新的制药用途，具体涉及原海葱苷a(proscillaridina)(cas466-06-8)在制备治疗肝癌尤其是肝细胞肝癌(hcc)药物中的用途。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供原海葱苷a新的制药用途，具体涉及原海葱苷a(proscillaridina)(cas466-06-8)在制备治疗肝癌尤其是肝细胞肝癌(hcc)药物中的用途。
6.本发明的进一步目的是提供一种用于治疗肝癌尤其是肝细胞肝癌的药物，该药物以原海葱苷a作为药物前体。
7.本发明的进一步目的是提供一种治疗肝癌尤其是肝细胞肝癌的药物组合物，该药物组合物包含原海葱苷a或者以喷原海葱苷a作为药物前体的药物和药学上可接受的载体。
8.本发明所述的原海葱苷a(proa)其结构如式1所示，购于sigma-aldrich公司，货号r214310，规格1mg，淡黄色粉末，
[0009][0010]
所述原海葱苷a其分子量为530.7，分子式c30h42o8，cas466-06-8。
[0011]
本发明进行了所述的原海葱苷a对肝癌细胞系细胞增殖的抑制作用的实验，试验研究了原海葱苷a对大鼠原代肝细胞的毒性作用，进行了原海葱苷a促进肝癌细胞凋亡的实验以及原海葱苷a降低荷瘤裸鼠肿瘤大小的实验，结果显示，低浓度药物处理后，肝癌细胞明显产生生长抑制作用，且能有效促进肝癌细胞凋亡，影响细胞周期进程。
[0012]
本发明的实施例中，所述溶解药物终浓度为10mm，长期于-80℃保存，短期于-20℃保存；
[0013]
本发明所述药物作用于肝癌细胞系mhcc97h后显著抑制细胞生长；
[0014]
本发明所述药物作用于肝癌细胞系mhcc97h后显著抑制细胞周期和细胞凋亡；
[0015]
本发明所述药物作用于大鼠原代肝细胞prh无生长抑制作用。
[0016]
本发明提供了原海葱苷a(proscillaridina)(cas466-06-8)新的制药用途，尤其是在制备治疗肝癌尤其是肝细胞肝癌(hcc)药物中的用途。原海葱苷a在肝癌治疗中的新用途，能为肝癌新药物研发提供新的方法与思路所述的原海葱苷a可作为药物前体制成治疗肝癌尤其是肝细胞肝癌的药物以及制成包含原海葱苷a或者以原海葱苷a作为药物前体的药物和药学上可接受的载体的药物组合物用于治疗肝癌尤其是肝细胞肝癌。本发明为治疗肝癌尤其是肝细胞肝癌提供了新的药物和方法。
[0017]
本发明与目前已批准上市的治疗晚期肝细胞肝癌的药物索拉菲尼其易产生耐药，相比，所述原海葱苷有效作用浓度显著低于索拉菲尼。
附图说明
[0018]
图1为原海葱苷a的分子结构式。
[0019]
图2为不同浓度的原海葱苷a对肝癌细胞mhcc97h的细胞增殖影响的实验结果；
[0020]
图3为不同浓度的原海葱苷a对肝癌细胞huh7的细胞增殖影响的实验结果；
[0021]
图4为不同浓度的原海葱苷a对肝癌细胞hepg2的细胞增殖影响的实验结果；上述图2至图4中，横坐标为原海葱苷a的浓度(nm)，纵坐标为相对细胞存活率(relativecellviability)。
[0022]
图5为不同浓度的原海葱苷a对大鼠原代肝细胞(prh)细胞增殖影响的实验结果；横坐标为原海葱苷a的浓度(μm)，纵坐标为相对细胞存活率(relativecell viability)。
[0023]
图6和图7为不同浓度的原海葱苷a促进肝癌细胞mhcc97h的细胞凋亡的流式分析及其统计分析实验结果；
[0024]
图8和图9为不同浓度的原海葱苷a促进肝癌细胞huh7的细胞凋亡的流式分析及其统计分析实验结果；
[0025]
图10和图11为不同浓度的原海葱苷a促进肝癌细胞hepg2的细胞凋亡的流式分析及其统计分析实验结果；
[0026]
图7、图9和图11中，横坐标为原海葱苷a的浓度(nm)，纵坐标为细胞凋亡率，**代表p<0.01,***代表p<0.001。
[0027]
图12为实施例4中实验组与对照组小鼠的皮下肿瘤的体积对比图；
[0028]
图13为实施例4中实验组与对照组小鼠的皮下肿瘤的瘤重分布图，***代表p<0.001。
具体实施方式
[0029]
本发明在药物筛选的过程中发现已知化学物质“原海葱苷a”对肝癌细胞具有显著的杀伤力，可以应用于制备治疗肝癌的药物。
[0030]
关于原海葱苷a，其英文名称为proscillaridina，分子式为c30h42o8，具体分子结构如图1所示。原海葱苷a，正常状态下呈无臭、白色或接近白色的晶体或粉末，溶于二甲亚砜(dmso)，不易溶于水。关于该物质的稳定性：一般在散装情况下，有光或60℃温度下可以保持稳定，室温下溶解于dmso，可以将原海葱苷a溶解于dmso后的母液浓度调节至10mm，长期于-80℃保存，短期于-20℃保存。
[0031]
作为强心苷类药物的一员，原海葱苷a也是一种na
+
/k
+
atp酶抑制剂，在结构上，na
+
/k
+
atp泵是一种异源二聚体，由一个起催化功能的α亚基和一个糖基化β亚基构成。α亚基含有atp，na+,k+和强心苷类(如地高辛，g毒毛旋花苷)结合位点。
[0032]
实施例1：原海葱苷a对肝癌细胞系细胞增殖的抑制作用的实验
[0033]
本实验采用三种不同的肝癌细胞：mhcc97h、huh7、hepg2细胞，以5000个/孔细胞量铺96孔板，一个对照组，六个实验组，每组五个重复，24小时后，将dmem培养基与药物混合，配制成10nm，50nm，100nm，500nm，1000nm，5000nm混合液；空白组加入等量dmso，分别加入各孔中，48小时后使用同仁cck-8终点法试剂盒检测药物对细胞的毒性作用，30分钟后使用酶标仪测量450nm处的吸光度；
[0034]
结果如图2至图4所示，图2为不同浓度的原海葱苷a对肝癌细胞mhcc97h的细胞增殖影响的实验结果；图3为不同浓度的原海葱苷a对肝癌细胞huh7的细胞增殖影响的实验结果；图4为不同浓度的原海葱苷a对肝癌细胞hepg2的细胞增殖影响的实验结果，结果显示随着药物浓度增加，实验组与对照组的比值越来越小，显示随着药物浓度的增加，活细胞数量急剧下降，可以推算，原海葱苷a对多种肝癌细胞均有明显毒性作用。
[0035]
实施例2：原海葱苷a对大鼠原代肝细胞的毒性作用试验
[0036]
使用大鼠肝静脉灌流分离大鼠原代肝细胞(详细分离方法见何文辉博士论文《乙型肝炎病毒感染模型的建立及其早期入侵的分子机制的研究》)，含有胶原的96孔板铺板，并使用原代肝细胞培养基进行培养，其余实施方法与实施例1中所述实验方法相同；
[0037]
结果如图5显示，随着原海葱苷a浓度增加，在50μm以下浓度，各实验组活细胞数量相对于对照组并未见明显下降，说明在实施例1原海葱苷a对肝癌细胞起杀伤作用的浓度条件下，对大鼠原代肝细胞没有细胞毒性。
[0038]
实施例3：原海葱苷a促进肝癌细胞凋亡的实验
[0039]
细胞凋亡：将mhcc97h、huh7、hepg2细胞接种于12孔板，分别加入对应浓度原海葱苷a，空白组加入等量dmso。48小时后收取细胞，使用同仁细胞凋亡试剂盒进行检测；
[0040]
结果如图6至图11所示，已知，凋亡细胞会被染料annixv和pi染色，分别位于图中q1+q2+q3象限(图6，图8和图10)，随着药物浓度增加，发生凋亡的细胞数目越来越多(图6，图8和图10)，经数据统计(图7、图9、图11)证明原海葱苷a可以促进细胞凋亡。
[0041]
实施例4：原海葱苷a降低荷瘤裸鼠肿瘤大小的实验
[0042]
将mhcc97h细胞用pbs缓冲液重悬后，按照2
×
106个/ml的浓度进行裸鼠皮下接种，每组8只小鼠，接种细胞一周后，实验组按照7mg/kg皮下注射药物(原海葱苷a的灭菌水溶液)，每三天接种一次药物，对照组注射灭菌水，注射药物3周后将裸鼠处死，测量实验组和对照组的体积和瘤重；
[0043]
如图12和图13所示，相比对照组，实验组的肿瘤体积减少，重量减少，证明原海葱苷a在小鼠体内有杀伤肿瘤的作用。
[0044]
本发明的实验结果显示，低浓度药物处理后，肝癌细胞明显产生生长抑制作用，且能有效促进肝癌细胞凋亡，影响细胞周期进程；本发明提供了原海葱苷a在肝癌治疗中的应用，进一步为肝癌新药物研发提供了新的方法与思路。