6α-乙基-23(S)-甲基胆酸在制备治疗周围神经髓鞘损伤类疾病的药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种6α-乙基-23(s)-甲基胆酸的新用途。

背景技术：

目前治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物，在治疗效果等方面存在一定缺陷，需要进一步寻找开发新的药物。6α-乙基-23(s)-甲基胆酸的作用尚未有可以制备治疗周围神经髓鞘损伤类疾病的药物的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种效果好的6α-乙基-23(s)-甲基胆酸在制备治疗周围神经髓鞘损伤类疾病的药物中的应用。

本发明的技术解决方案是：

一种6α-乙基-23(s)-甲基胆酸在制备治疗周围神经髓鞘损伤类疾病的药物中的应用。

其机理的研究方法包括下列步骤：

（1）坐骨神经夹伤模型的建立

取注射过6α-乙基-23(s)-甲基胆酸的12周龄雄性野生型c57bl/6小鼠的夹伤的坐骨神经；

（2）透射电镜形态学分析

对上述不同组别的坐骨神经横切组织1-2mm后浸泡在含4%多聚甲醛、2.5%戊二醛混合液中24小时；将组织样品放置在1%的四氧化锇中固定1小时，并包埋在epon812环氧树脂中；切片用柠檬酸铅和醋酸铀酰染色，并在80kv的透射电子显微镜下观察；g比率是轴突平均内径与纤维平均直径的比值，用imagej软件进行分析计算；

（3）行为学检测分析

转棒实验采用加速旋转棒装置，在试验前，让小鼠在试验室中习惯30分钟；通过摆动小鼠，将小鼠放在旋转木马上，并在旋转木马上以3分钟和5分钟的间隔以加速模式训练3天；以恒定速度重复训练，直到小鼠能够在杆上停留至少300秒；对于正式试验，将小鼠置于旋转鼓上，并将旋转木马设置为加速模式；在测量下落之前，记录在杆上移动的时间；

步态实验通过digigait成像系统对小鼠的足迹分析来评估四足动物的步态动力学，以8cm/s的速度评估后肢的步幅；通过以下四种测量方法分析脚印：与对侧脚的距离、脚印长度、第一和第五脚趾之间的最大脚趾伸展以及第二和第四脚趾中心之间的爪子伸展；

（7）结果

结果显示与夹伤后的野生型小鼠相比，6α-乙基-23(s)-甲基胆酸的处理促进了夹伤后小鼠坐骨神经髓鞘再生进程；透射电镜结果指出小鼠坐骨神经髓鞘厚度，髓鞘再生进程加速，运动平衡能力增强；步态实验结果指出，坐骨神经夹伤后，6α-乙基-23(s)-甲基胆酸处理组小鼠的运动恢复能力远优于野生型小鼠。

本发明提供了激动剂6α-乙基-23(s)-甲基胆酸的新用途，且效果好；研究机理的方法简便，准确。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是int777促进夹伤后坐骨神经髓鞘的再生示意图。

图2是int777对夹伤后坐骨神经髓鞘厚度影响的统计示意图。

图3是int777对坐骨神经夹伤小鼠运动平衡能力的影响示意图。

图4是int777对坐骨神经夹伤小鼠运动功能恢复的影响示意图。

具体实施方式

一种6α-乙基-23(s)-甲基胆酸在制备治疗周围神经髓鞘损伤类疾病的药物中的应用。

其机理的研究方法包括下列步骤：

一、实验步骤

1、坐骨神经夹伤模型的建立

12周龄雄性野生型c57bl/6小鼠腹腔注射6α-乙基-23(s)-甲基胆酸（int777，cas：1199796-29-6）（浓度为10µg/g），隔天注射一次，4d后进行坐骨神经夹伤，14d后进行后续研究。夹伤模型建立过程如下：在皮下注射3%戊巴比妥钠（1ml/kg）麻醉。切开臀部以下的皮肤，用精细的手术剪刀和镊子将肌肉钝性切开，露出大腿中部的右侧坐骨神经。神经在腓肠、腓总支和胫支断裂处上方0.5厘米处被压碎。对于挤压，首先用直尖锯齿状5.0细镊子压迫坐骨神经15s，直到出现明显的半透明区。以右后肢未受损伤的坐骨神经为对照。所有动物实验方案均经南通大学动物保护与利用委员会和江苏省动物保护伦理委员会批准。小鼠坐骨神经损伤模型的建立是按照批准的指南进行的。

2、透射电镜形态学分析

上述不同组别的坐骨神经组织快速取出，并横切组织1-2mm后浸泡在含4%多聚甲醛、2.5%戊二醛混合液中24小时。将组织样品放置在1%的四氧化锇中固定1小时，并包埋在epon812环氧树脂中。切片用柠檬酸铅和醋酸铀酰染色，并在80kv的透射电子显微镜（日本，jeo有限公司）下观察。g比率（g-ratio）是轴突平均内径与纤维平均直径（含髓鞘）的比值，用imagej软件进行分析计算。

3、行为学检测分析

为了进一步明确6α-乙基-23(s)-甲基胆酸（int777，cas：1199796-29-6）对坐骨神经髓鞘再生及运动恢复的影响，我们进行了行为学转棒实验检测及步态实验。

转棒实验采用的是加速旋转棒装置（le8500型，pan实验室），在试验前，让小鼠在试验室中习惯30分钟。通过轻轻摆动小鼠，将小鼠轻轻放在旋转木马上，并在旋转木马上以3分钟和5分钟的间隔以加速模式（4-40转/分）训练3天。以恒定速度（16转/分）重复训练，直到小鼠能够在杆上停留至少300秒。对于正式试验，将小鼠置于旋转鼓上，并将旋转木马设置为加速模式，即在5分钟内以4至40转/分的速度加速。在测量下落之前，记录在杆上移动的时间。

步态实验通过digigait成像系统对小鼠的足迹分析来评估四足动物的步态动力学，以8cm/s的速度评估后肢的步幅。通过以下四种测量方法分析脚印：与对侧脚的距离、脚印长度、第一和第五脚趾之间的最大脚趾伸展以及第二和第四脚趾中心之间的爪子伸展。

二、实验结果

tgr5（gprotein-couplebileacidreceptor1）是g蛋白偶联受体，主要表达于褐色脂肪、肝脏和肌肉。前人研究指出在肥胖小鼠中tgr5能够激发能量消耗，降低饮食诱导的肥胖发生概率。6α-乙基-23(s)-甲基胆酸（int777，cas：1199796-29-6）是tgr5的激活剂，特异性增加tgr5的活性。已有研究报道指出激动剂int-777可以减轻小鼠急性胰腺炎胰腺腺泡细胞坏死，还能够对aβ1-42诱导的小鼠认知障碍、神经炎症、细胞凋亡和突触功能障碍起到保护作用。

周围神经系统在机体内分布广泛且起到靶器官与中枢神经系统进行信号传递的作用。轴突的髓鞘化是神经系统执行功能的基础保障，髓鞘化过程异常会导致多种疾病的发生。周围神经损伤是临床常见病征，尤其是交通事故、战争、地震等意外创伤导致的损伤处神经元轴突脱髓鞘，神经冲动无法传递而引起的疾病。大量研究指出，髓鞘的再生需要大量的能量供应，而tgr5是激活能量代谢的关键因子，因此，我们推测int777激活tgr5活性后，可能有助于坐骨神经髓鞘的再生。

为了研究6α-乙基-23(s)-甲基胆酸（int777，cas：1199796-29-6）是否可以促进坐骨神经髓鞘的再生，我们构建了坐骨神经夹伤模型，进行了形态学及行为学的分析，结果显示与夹伤后的野生型小鼠相比，6α-乙基-23(s)-甲基胆酸（int777）的处理促进了夹伤后小鼠坐骨神经髓鞘再生进程。如图所示，透射电镜结果指出小鼠坐骨神经髓鞘厚度，髓鞘再生进程加速（图1，2），运动平衡能力增强（图3），步态实验结果指出，坐骨神经夹伤后，6α-乙基-23(s)-甲基胆酸（int777）处理组小鼠的运动恢复能力远优于野生型小鼠（图4）。

以上结果说明tgr5的激动剂6α-乙基-23(s)-甲基胆酸（int777）可促进坐骨神经髓鞘的再生修复，可能为周围神经损伤修复提供新的治疗药物。