LncRNA-LOC100294145功能性表达的抑制剂的用途的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及lncrna-loc100294145功能性表达的抑制剂的用途。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

乳腺癌是发生在女性乳腺上皮组织的恶性肿瘤，也是导致女性癌症死亡的主要原因。全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。近年我国乳腺癌发病率的增长速度高出高发国家1～2个百分点，情况并不乐观。目前乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。如何实现乳腺癌早发现早治疗，对于提高乳腺癌患者预后效果极为重要。

rna可分为编码rna和非编码rna。早期，人们对于rna的研究仅限于编码rna，但经过研究发现，该部分rna仅占基因组的1％，剩下的均为非编码rna(non-codingrna)。对于非编码rna功能的挖掘成为了近些年来科学家们关注的重点。长链非编码rna是最近发现的一类非编码rna，长度大于200nt，在肿瘤的发生发展中具有重要调控作用。但lncrna的研究目前刚处于起步阶段，在这一领域，还有很大的空白需要研究人员去填补。研究可有效用于治疗肿瘤的长链非编码rna具有重要意义。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，本发明提供lncrna-loc100294145在治疗乳腺癌中的应用，lncrna-loc100294145在乳腺癌细胞中的表达明显上调，可用于检测乳腺癌，并且通过慢病毒感染实验验证敲除lncrna-loc100294145可明显抑制乳腺癌细胞的增殖能力，并且明显促进乳腺癌细胞的调亡，可用于治疗乳腺癌。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一方面，本发明提供了lncrna-loc100294145功能性表达的抑制剂的用途为用于制备预防或治疗乳腺癌的药物组合物。所述抑制剂能够抑制lncrna-loc100294145或涉及lncrna-loc100294145下游的物质表达。

另一方面，本发明提供了一种治疗乳腺癌的药物组合物，所述药物组合物包括lncrna-loc100294145功能性表达的抑制剂。

本发明的一个或多个技术方案具有如下有益效果：

通过荧光定量pcr检测到lncrna-loc100294145在乳腺癌细胞中的表达明显上调，因此，检测lncrna-loc100294145的表达水平可用于诊断乳腺癌，通过慢病毒感染实验验证敲除lncrna-loc100294145可明显抑制乳腺癌细胞的增殖能力，并且明显促进乳腺癌细胞的调亡。敲除lncrna-loc100294145可用于预防或治疗乳腺癌，为乳腺癌的治疗提供新的思路和方案。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1中荧光定量pcr检测lncrna-loc100294145在正常乳腺上皮细胞mcf-10a以及乳腺癌细胞mda-mb-231，t47d，mcf-7中的表达情况。

图2为实施例2中gv248慢病毒感染细胞敲除lncrna-loc100294145的效率图。

图3为实施例3中edu细胞增殖检测试剂盒检测感染前后细胞的增殖能力。

图4为实施例4中流式细胞仪检测感染前后细胞的凋亡情况。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

如前所述，现有技术中实现乳腺癌早发现早治疗仍是提高乳腺癌患者预后效果的重要途径。因此，本发明提供了lncrna-loc100294145在乳腺癌细胞中的表达明显上调，可用于检测乳腺癌，敲除lncrna-loc100294145可明显抑制乳腺癌细胞的增殖能力，并且明显促进乳腺癌细胞的调亡，敲除lncrna-loc100294145可用于预防或治疗乳腺癌。

本发明所述lncrna-loc100294145位于6号染色体，rna长度为3690bp，seqname为nr_037177。

本发明的一个技术方案中提供了lncrna-loc100294145功能性表达的抑制剂用于制备预防或治疗乳腺癌的药物组合物的用途。所述抑制剂是针对lncrna-loc100294145的rnai。

本发明的一个特别优秀的实施方案中实验验证通过shrna慢病毒转入乳腺癌细胞，成功敲除lncrna-loc100294145，结果显示可明显抑制乳腺癌细胞的增殖能力，增殖能力减半，且明显促进乳腺癌细胞的调亡，细胞凋亡量增加原来的6倍。表明敲除lncrna-loc100294145可有效用于预防或治疗乳腺癌。

本领域技术人员可以知晓除shrna慢病毒外，还有多种技术手段可以同样实现抑制lncrna-loc100294145的功能性表达，或抑制涉及lncrna-loc100294145的下游的物质功能性表达，进而起到抑制lncrna-loc100294145用于预防或治疗乳腺癌的功能。这些技术手段包括但不限于其他rnai技术(通过其他sirna抑制lncrna-loc100294145的功能性表达)、成簇规律间隔短回文重复(crrspr)技术(使用一段序列特异性向导rna分子(sequence-specificguiderna，sgrna)引导核酸内切酶到靶点处，从而完成基因组的编辑，特别的，以crispr/cas9技术为代表)、锌指核酸酶(zfn)技术(通过加工改造zfn的锌指dna结合域，靶向定位于不同的dna序列)、转录激活样效应因子核酸酶(talen)技术(通过dna识别模块将talen元件靶向特异性的dna位点并结合，然后在foki核酸酶的作用下完成特定位点的剪切，并借助于细胞内固有的同源定向修复(hdr)或非同源末端连接途径(nhej)修复过程完成特定序列的插入(或倒置)、删失及基因融合)、利用同源重组载体敲除基因的技术(如cre/loxp系统或来自酵母的flp-frt系统，利用基因同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的)，本领域技术人员可以知晓这些技术手段可以分别实现抑制lncrna-loc100294145表达或者敲除lncrna-loc100294145的表达基因。

进一步的，本领域技术人员可以知晓可以将lncrna-loc100294145功能性表达的抑制剂制备成治疗乳腺癌的药物组合物，该药物组合物还可以包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

进一步，所述载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。

实施例1：

通过荧光定量pcr检测正常乳腺上皮细胞mcf-10a以及乳腺癌细胞mda-mb-231，t47d，mcf-7中lncrna-loc100294145的表达情况，结果如图1显示，与正常乳腺上皮细胞mcf-10a相比，lncrna-loc100294145在乳腺癌细胞中的表达明显上调，而且在高侵袭性细胞mda-mb-231中的表达量最高，在低侵袭性细胞mcf-7中的表达量最低。

荧光定量pcr实验步骤：

1、用invitrogen的trizol提取细胞中的总rna。

1.1吸尽6孔板中正常乳腺上皮细胞mcf-10a或乳腺癌细胞mda-mb-231，t47d，mcf-7细胞的培养液，每孔加入1mltrizol，使其覆盖细胞，再用吸管或加样器吹打3次，细胞应完全裂解，然后转移至离心管中。

1.2在装有裂解物的离心管中加入0.2ml的氯仿(1mltrizol加入0.2ml氯仿)，振荡器上充分振荡混匀20秒，室温放置5分钟。12000g4℃离心10分钟，然后吸取含总rna的上层水相至一新的离心管中，每毫升trizol约可吸取0.6ml上层水相。有机相和中间层含有dna和蛋白质，应避免触及。

1.3加入和上层水相等体积的异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀5分钟。12000g4℃离心10分钟，在管底可见rna沉淀。弃上清，按每毫升trizol加入1ml75％乙醇，轻轻颠倒混匀，以清洗rna沉淀。12000g4℃离心2分钟，弃去液体，小心勿丢弃rna沉淀。室温倒置晾干5-10分钟。

1.4溶解：加入适量depc处理水使rna沉淀溶解。存放于-80℃。

2、应用m-mlv逆转录酶合成第一链cdna。

合成用试剂及条件如下：

3、用bio-rad的sybrgreen荧光定量pcr试剂盒检测细胞中lncrna-loc100294145的表达量。用2^–△△ct法计算lncrna-loc100294145的相对表达量。lncrna-loc100294145引物序列如下：forwardprimer：5’-gagccatttgttctttacgataagc-3’，reverseprimer：5’-atcaccaatcccaccctaaaacc-3’。gapdh作为内参照。

实施例2：

通过shrna慢病毒感染乳腺癌细胞mda-mb-231，成功敲除细胞中的lncrna-loc100294145，并筛选出稳转细胞株，感染rnai慢病毒的mda-mb-231细胞称为siloc100294145/mda-mb-231，感染对照慢病毒mda-mb-231细胞称为scr/mda-mb-231。

lncrna-loc100294145shrna慢病毒为上海吉凯基因公司定制，载体名称为gv248。共有三个靶点，序列分别为：5’-aagcattaggagtcttggttt-3’，5’-tagggtgggattggtgatgtt-3’，5’-gagccatttgttctttacgat-3’。敲除效率如图2。

实施例3：

edu细胞增殖检测试剂盒检测感染前后细胞的增殖能力，结果如图3显示敲除lncrna-loc100294145可明显抑制mda-mb-231细胞的增殖能力；

edu细胞增殖检测试剂盒实验步骤：

1、细胞培养

取对数生长期细胞，以每孔8×10³～2×10⁵细胞接种于24孔板中，培养至正常生长阶段。

2、edu标记

2.1用细胞培养基按1000：1的比例稀释edu溶液(试剂a)，制备适量100μmedu培养基；

2.2每孔加入200μl100μmedu培养基孵育2小时，弃培养基；

2.3pbs清洗细胞1～2次，每次5分钟。

3、细胞固定化

3.1每孔加入100μl细胞固定液(即含4％多聚甲醛的pbs)室温孵育30分钟，弃固定液；

3.2每孔加入100μl4mg/ml甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；

3.3每孔加入200μlpbs，脱色摇床清洗5分钟，弃pbs；

3.4(加强)每孔加入200μl渗透剂(0.5％tritonx-100的pbs)脱色摇床孵育10分钟；pbs清洗1次，5分钟。

4、apollo染色

4.1每孔加入200μl的染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；

4.2加入200μl渗透剂(0.5％tritonx-100的pbs)脱色摇床清洗2～3次，每次10分钟，弃渗透剂；

4.3(加强)每孔每次加入200μl甲醇清洗1～2次，每次5分钟；pbs清洗1次，每次5分钟。

5、dna染色

5.1每孔加入200μldapi反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；

5.2每孔每次加入200μlpbs清洗1～3次；

5.3通过激光共聚焦显微镜扫描获取图像。

实施例4：

流式细胞仪检测感染前后细胞的凋亡情况，结果如图4显示敲除lncrna-loc100294145可明显促进mda-mb-231细胞的凋亡。

用bd公司凋亡检测试剂盒检测凋亡实验步骤：

1、用冷pbs清洗细胞两次，然后在1×binding缓冲液中以1×10⁶细胞/ml的浓度重新培养细胞。

2、将100μl溶液(1×10⁵细胞)移入5ml培养管中。

3、加入5μlpeannexinv和5μl7-aad。

4、轻轻旋转细胞，在室温(25℃)下黑暗中培养15分钟。

5、向每个试管中加入400μl的1×binding缓冲液。1小时内用流式细胞仪分析。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

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<110>潍坊医学院

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