一种立体血管化活性人工组织结构及其仿生构建方法与流程

本发明涉及人工活性组织技术领域，具体涉及一种立体血管化活性人工组织结构及其仿生构建方法。

背景技术：

制造技术与生命科学的结合实现了生物组织与器官的工程化制造，组织器官制造方法经过理论论证到实验研究的发展，在人造皮肤上实现了商业化生产，并在人工软骨、骨和膀胱等方面已进入临床试验。但是在肝脏、心脏、肺和肾脏等重要实质性器官再造方面至今未取得突破性进展，存在的主要障碍之一是再生那些可以保持自然组织活性的微小血管网络。因此，研究具有立体化血管网络的人工活性组织的构建方法，有望解决器官移植供体紧张的问题，且该项目是当今国内外研究的前沿与热点。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术存在的缺点，本发明的目的在于提供一种立体血管化活性人工组织结构及其仿生构建方法，可以有效再生保持自然组织活性的微小血管网络。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种立体血管化活性人工组织结构的仿生构建方法，包括下述步骤：

1）通过计算机辅助设计出具有立体微流道的组织类基体结构模型，根据流道分叉结构进行分层，得到单层组织类基体结构模型；其中，所述组织类基体结构模型中包括组织类基体结构支架、类活性组织结构和类血管结构；

2）制备单层组织类基体结构模型的树脂模型，利用液态硅胶在真空条件下填充树脂模型，然后在常温下静置使其充分固化，固化后脱模，即获得各层组织类基体结构模型负型；

3）向成型槽中注入组织类基体结构材料溶液，将组织类基体结构模型负型浸入成型槽溶液中，控制成型槽溶液温度，使成型槽溶液固化，然后分离组织类基体结构模型负型，得到第一层单层组织类基体结构支架；

4）向第一层单层组织类基体结构支架中的类活性组织结构中打印胶原与实质细胞的混合溶液，控制温度使其固化，完成该类活性组织结构的填充；

5）向填充完类活性组织结构的第一层单层组织类基体支架中的类血管结构中打印明胶与非实质细胞的混合溶液，控制温度使其固化，自此完成单层仿生组织成型；

6）在单层仿生组织成型后，成型槽内的托盘下降距离h，重复步骤3）至步骤5），直至完成具有立体血管化活性人工组织支架的成型；

7）完成具有立体血管化活性人工组织支架的成型后，托盘向上移动，取出成型后的立体血管化活性人工组织支架，将其置于37℃温度下，使立体血管化活性人工组织流道结构内的明胶融化，即获得具有立体流道结构的活性人工组织，其中，部分非实质细胞粘附于类血管结构的内壁上。

上述：

所述的步骤1）中单层组织类基体结构模型的厚度t为1-2mm，流道结构直径为600-1800µm。

所述的步骤2）中液态硅胶在真空负压为0.05～0.15mpa的条件下填充树脂模型。

所述的步骤2）中填充液态硅胶的树脂模型在常温下静置放置24～48小时。

所述的步骤3）中组织类基体结构材料为琼脂糖溶液。

所述的步骤4）中胶原与实质细胞混合溶液按照实质细胞在胶原中的浓度为1×10⁶个/ml配制。

所述的步骤5）中明胶与非实质细胞的混合溶液按照非实质细胞在明胶中的浓度为2×10⁶个/ml配制。

所述的步骤3）中控制温度低于50℃使成型槽溶液固化；所述的步骤4）中控制温度为37℃使胶原与实质细胞的混合溶液固化；所述的步骤5）中控制温度低于30℃使明胶与非实质细胞的混合溶液固化。

所述的步骤6）中距离h等于每层组织的厚度t；当第n层具有立体血管化活性人工组织支架结构成型时，托盘的下降距离为t1+……+tn，其中n≥1。

利用上述方法构建的一种立体血管化活性人工组织结构，包括空心圆柱体和置于空心圆柱体中的枝杈状的组织类基体结构支架，在枝杈状的组织类基体结构支架中填充有胶原与实质细胞构建的类活性组织结构和明胶与非实质细胞构建的类血管结构；

所述组织类基体结构支架中设有相互贯通的立体微流道，微流道接口用于和动态生物反应器连接；

所述组织类基体结构支架由琼脂糖溶液固化构建。

综上：

利用本发明方法构建一种立体血管化活性人工组织，采用力学性能较好的生物材料构建组织类基体结构，胶原与实质细胞构建类组织活性单元，明胶与非实质细胞构建类血管结构。

其中：立体血管化活性人工组织采用细胞压印打印技术，组织类基体结构采用压印成型，保证人工组织外形和流道形态，为人工组织提供力学支撑。类组织活性单元采用打印技术，模拟自然实质组织，为人工组织实现功能表达。类血管结构采用打印技术，模拟自然组织中相互贯通的立体微流道，为细胞的粘附、生长和繁殖提供条件，仿生器官的微流道接口用于和动态生物反应器连接，人工组织血管结构与自然器官相似，以利于植入体内。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

（1）提出了模拟自然组织的立体分级多尺度流道网络，有利于构建可供移植的活体组织；

（2）提出多材料多细胞组合式构建活性组织，有利于模拟自然组织结构，实现仿生组织的生理功能；

（3）提出基于“压印/打印”细胞打印工艺的立体血管化活性组织自动化成形工艺，具有立体流道网络可控性好、多细胞多材料同时成形的特点。

附图说明

图1为本发明所提供的立体血管化活性人工组织结构的示意图；

图2为本发明所提供的立体血管化活性人工组织结构的制作流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明实施例中，提供了一种立体血管化活性人工组织结构的仿生构建方法，对于该方法实现的具体流程请参阅图2所示，图中：图a是向成型槽注入琼脂糖溶液示意图；图b是单层琼脂糖水凝胶压印示意图；图c是单层琼脂糖水凝胶类基体结构示意图；图d是向琼脂糖水凝胶类组织活性结构内注入胶原与实质细胞的混合溶液示意图；图e是向琼脂糖水凝胶类血管结构内注入明胶与非实质细胞的混合溶液示意图；图f是托盘下降距离h后，再次向成型槽注入琼脂糖溶液示意图；图g是第二层琼脂糖水凝胶压印示意图；图h是第二层琼脂糖水凝胶类基体结构示意图；图i是再次向琼脂糖水凝胶类组织活性结构内注入胶原与实质细胞的混合溶液示意图；图j是再次向琼脂糖水凝胶类血管结构内注入明胶与非实质细胞的混合溶液示意图；图k是立体活性组织制造完成示意图；图l是托盘上移示意图；图m是取出的立体活性组织示意图；图n是立体活性组织在37°培养箱中培养去除明胶示意图；图o是制造完成的立体活性组织示意图。

由上可知，所述的仿生构建方法应包括如下步骤：

1）通过计算机辅助设计出具有立体微流道的组织类基体结构模型，根据流道分叉结构进行分层，得到单层组织类基体结构模型；其中，所述组织类基体结构模型中包括组织类基体结构支架、类活性组织结构和类血管结构；

2）制备单层组织类基体结构模型的树脂模型，利用液态硅胶在真空条件下填充树脂模型，然后在常温下静置使其充分固化，固化后脱模，即获得各层组织类基体结构模型负型；

3）向成型槽中注入组织类基体结构材料溶液，将组织类基体结构模型负型浸入成型槽溶液中，控制成型槽溶液温度，使成型槽溶液固化，然后分离组织类基体结构模型负型，得到第一层单层组织类基体结构支架；

4）向第一层单层组织类基体结构支架中的类活性组织结构中打印胶原与实质细胞的混合溶液，控制温度使其固化，完成该类活性组织结构的填充；

5）向填充完类活性组织结构的第一层单层组织类基体支架中的类血管结构中打印明胶与非实质细胞的混合溶液，控制温度使其固化，自此完成单层仿生组织成型；

6）在单层仿生组织成型后，成型槽内的托盘下降距离h，重复步骤3）至步骤5），直至完成具有立体血管化活性人工组织支架的成型；

7）完成具有立体血管化活性人工组织支架的成型后，托盘向上移动，取出成型后的立体血管化活性人工组织支架，将其置于37℃温度下，使立体血管化活性人工组织流道结构内的明胶融化，即获得具有立体流道结构的活性人工组织，其中，部分非实质细胞粘附于类血管结构的内壁上。

综上所述，在本发明实施例中，以构建立体血管化肝脏组织为例，对立体血管化肝脏组织的结构及制作方法加以详述：

1）通过计算机辅助设计出具有立体微流道的组织类基体结构模型，该模型具体如图1所示，包括空心圆柱体和置于空心圆柱体中的枝杈状的组织类基体结构支架ⅰ，在枝杈状的组织类基体结构支架ⅰ中填充有胶原与实质细胞构建的类活性组织结构ⅲ和明胶与非实质细胞构建的类血管结构ⅱ；其中，组织类基体结构支架中设有相互贯通的立体微流道，微流道接口用于和动态生物反应器连接；组织类基体结构支架ⅰ由琼脂糖水凝胶构建；

根据流道分叉结构进行分层，分层依据为在类血管结构分叉和拐角处进行分层，其中，单层组织类基体结构模型的厚度t为1-2mm，流道结构直径为600-1800µm，得到单层组织类基体结构模型。

2）制备单层组织类基体结构模型的物理模型，利用液态硅胶在真空条件下填充物理模型，真空负压为0.05～0.15mpa，然后在常温下静置放置24小时使其充分固化，固化后脱模，即获得各层组织类基体结构模型负型。

3）参照图2，利用一号注射泵1向成型槽3中注入琼脂糖溶液2，如图a所示，其中，注入体积为12-25µl，使得组织类基体结构模型负型浸入成型槽3中的琼脂糖溶液2内，控制温度低于50℃使其凝胶固化，如图b所示，在硅橡胶模具4中分离组织类基体结构模型负型，得到第一层组织类基体结构支架，琼脂糖水凝胶结构（类基体结构）5如图c所示。

4）采用传统的3d打印技术，利用二号注射泵6第一层单层组织类基体结构支架中的类活性组织结构中打印胶原与肝细胞的混合溶液，胶原与实质细胞混合凝胶（类组织活性单元）7如图d所示，控制温度37℃使其固化，完成该类活性组织结构的填充。

5）采用传统的3d打印技术，利用三号注射泵8向填充完类活性组织结构的第一层单层组织类基体支架中的类血管结构中打印明胶与内皮细胞的混合溶液，明胶与非实质细胞（类血管结构）9如图e所示，控制温度低于30℃使其固化，自此完成单层仿生组织成型。

6）在单层仿生组织成型后，成型槽内的托盘下降距离h，如图f所示，重复步骤3）至步骤5），如图f至图k所示，直至完成具有多层立体血管化肝脏组织支架的成型，其中，距离h等于每层组织的厚度t，当第n层结构成型时，托盘需下降的距离为t1+……+tn,其中n≥1；

7）当完成需要的多层仿生组织成型后，托盘向上移动，如图l所示，将成型后的立体血管化肝脏组织取出，如图m所示，然后置于37℃温度下，使立体血管化肝脏组织流道结构内的明胶融化，如图n所示，获得具有立体血管结构的人工肝脏组织，其中，部分内皮细胞粘附于类血管结构的内壁上，如图o所示。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。