一种靶向TEM-1基因疫苗及其构建与应用的制作方法

文档序号:22544150发布日期:2020-10-17 02:09阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种靶向tem-1基因疫苗,其特征在于,所述靶向tem-1基因疫苗为rtem-1-sf融合基因,其全长为3033bp,其全长序列为atgcatcatcaccatcaccatgcacaagtcattaatacaaacagcctgtcgctgttgacccagaataacctgaacaaatcccagtccgcactgggcactgctatcgagcgtttgtcttccggtctgcgtatcaacagcgcgaaagacgatgcggcaggacaggcgattgctaaccgttttaccgcgaacatcaaaggtctgactcaggcttcccgtaacgctaacgacggtatctccattgcgcagaccactgaaggcgcgctgaacgaaatcaacaacaacctgcagcgtgtgcgtgaactggcggttcagtctgcgaatggtactaactcccagtctgacctcgactccatccaggctgaaatcacccagcgcctgaacgaaatcgaccgtgtatccggccagactcagttcaacggcgtgaaagtcctggcgcaggacaacaccctgaccatccaggttggtgccaacgacggtgaaactatcgatattgatttaaaagaaatcagctctaaaacactgggacttgataagcttaatgtccaagatgcctacaccccgaaagaaactgctgtaaccgttgataaaactacctataaaaatggtacagatcctattacagcccagagcaatactgatatccaaactgcaattggcggtggtgcaacgggggttactggggctgatatcaaatttaaagatggtcaatactatttagatgttaaaggcggtgcttctgctggtgtttataaagccacttatgatgaaactacaaagaaagttaatattgatacgactgataaaactccgttggcaactgcggaagctacagctattcggggaacggccactataacccacaaccaaattgctgaagtaacaaaagagggtgttgatacgaccacagttgcggctcaacttgctgcagcaggggttactggcgccgataaggacaatactagccttgtaaaactatcgtttgaggataaaaacggtaaggttattgatggtggctatgcagtgaaaatgggcgacgatttctatgccgctacatatgatgagaaaacaggtgcaattactgctaaaaccactacttatacagatggtactggcgttgctcaaactggagctgtgaaatttggtggcgcaaatggtaaatctgaagttgttactgctaccgatggtaagacttacttagcaagcgaccttgacaaacataacttcagaacaggcggtgagcttaaagaggttaatacagataagactgaaaacccactgcagaaaattgatgctgccttggcacaggttgatacacttcgttctgacctgggtgcggttcagaaccgtttcaactccgctatcaccaacctgggcaataccgtaaataacctgtcttctgcccgtagccgtatcgaagattccgactacgcaaccgaagtctccaacatgtctcgcgcgcagattctgcagcaggccggtacctccgttctggcgcaggcgaaccaggttccgcaaaacgtcctctctttactgcgtgaattcagttgtgaagacccctgtgcccaggccccctgtgagcagcagtgtgaacctggagggccacaaggctatagctgccactgtcgccttggcttccggccagctgaggatgatccacaccgctgcgtggacacggatgagtgccagattgctggtgtgtgccagcagatgtgtgtcaactatgttggtggctttgagtgttactgcagcgagggtcacgagcttgaggcagatggtatcagctgtagccctgcaggagccatgggtgcccaggcttcccaggatctcagagatgagttgctggatgatggagaagaaggggaggatgaagaggagccctgggaggactttgatggcacctggacagaggaacaggggatcctatggctggcacctacacatccacctgactttggcctgccctataggcccaacttcccacaggatggagagcctcagagattgcacctggagcctacctggccacccccacttagtgcccccaggggcccctaccactcctcagtggtgtctgccacacggcccatggtgatctctgccactcgacccacactaccttctgcccacaagacctctgttatttcagctacacgcccacccctgagccctgtccacccacctgccatggcccctgccacacctccagctgtgttctctgagcaccagatccccaaaatcaaggccaattatccagacctgccttttggccacaagcctgggataacctcggccactcacccagcacggtctcctccgtaccagccccccattatctcaaccaactatccccaagtcttccctccccaccaggcccctatgtctccagatacccacactatcacttatttgcctccagtcccccctcaccttgatcctggggataccacttctaaagcccatcaacaccctttgctcccagatgctccaggtatcagaacccaggccccccagctttctgtctcagctctccagccccctcttcctaccaactccaggtcttctgtccatgaaactcctgtgcctgctgccaaccagcccccagccttcccttcttctcccctcccccctcagaggcccactaaccagacctcatctatcagccctacacattcctattccagagcccctctagtcccaagggaaggagttcccagtcccaaatcagtgccacagctgccctcggtgccctccacagcagctccaacagccctggcagagtcaggtcttgcaggccaaagccaaagggatgaccgctggctgctggtggcactcctggtgccaacatgtgtcttcttggtggtgctgcttgccctgggcattgtgtactgcactcgctgtggctcccacgcacccaacaagcggatcacggactgctatcgctgggtcacacatgctgggaacaagagctcaacagaacccatgccccccagaggcagccttacaggggtacagacctgtagaaccagtgtgtga。

2.如权利要求1所述靶向tem-1基因疫苗,其特征在于,该基因疫苗以鞭毛素(sf)为佐剂,以rtem-1基因为抗原,获得rtem-1-sf融合基因。

3.如权利要求1所述靶向tem-1基因疫苗,其特征在于,该所述佐剂为鞭毛素基因,以人肠道沙门氏菌j341基因组为模板进行基因克隆。

4.如权利要求1所述靶向tem-1基因疫苗,其特征在于,所述rtem-1基因,其重组核苷酸序列如下:

gaattcagttgtgaagacccctgtgcccaggccccctgtgagcagcagtgtgaacctggagggccacaaggctatagctgccactgtcgccttggcttccggccagctgaggatgatccacaccgctgcgtggacacggatgagtgccagattgctggtgtgtgccagcagatgtgtgtcaactatgttggtggctttgagtgttactgcagcgagggtcacgagcttgaggcagatggtatcagctgtagccctgcaggagccatgggtgcccaggcttcccaggatctcagagatgagttgctggatgatggagaagaaggggaggatgaagaggagccctgggaggactttgatggcacctggacagaggaacaggggatcctatggctggcacctacacatccacctgactttggcctgccctataggcccaacttcccacaggatggagagcctcagagattgcacctggagcctacctggccacccccacttagtgcccccaggggcccctaccactcctcagtggtgtctgccacacggcccatggtgatctctgccactcgacccacactaccttctgcccacaagacctctgttatttcagctacacgcccacccctgagccctgtccacccacctgccatggcccctgccacacctccagctgtgttctctgagcaccagatccccaaaatcaaggccaattatccagacctgccttttggccacaagcctgggataacctcggccactcacccagcacggtctcctccgtaccagccccccattatctcaaccaactatccccaagtcttccctccccaccaggcccctatgtctccagatacccacactatcacttatttgcctccagtcccccctcaccttgatcctggggataccacttctaaagcccatcaacaccctttgctcccagatgctccaggtatcagaacccaggccccccagctttctgtctcagctctccagccccctcttcctaccaactccaggtcttctgtccatgaaactcctgtgcctgctgccaaccagcccccagccttcccttcttctcccctcccccctcagaggcccactaaccagacctcatctatcagccctacacattcctattccagagcccctctagtcccaagggaaggagttcccagtcccaaatcagtgccacagctgccctcggtgccctccacagcagctccaacagccctggcagagtcaggtcttgcaggccaaagccaaagggatgaccgctggctgctggtggcactcctggtgccaacatgtgtcttcttggtggtgctgcttgccctgggcattgtgtactgcactcgctgtggctcccacgcacccaacaagcggatcacggactgctatcgctgggtcacacatgctgggaacaagagctcaacagaacccatgccccccagaggcagccttacaggggtacagacctgtagaaccagtgtgtga。

5.如权利要求1所述靶向tem-1基因疫苗,其特征在于,所述rtem-1基因,其氨基酸序列如下:

dlscedpcaqapceqqcepggpqgyschcrlgfrpaeddphrcvdtdecqiagvcqqmcvnyvggfecycsegheleadgiscspagamgaqasqdlrdellddgeegedeeepwedfdgtwteeqgilwlapthppdfglpyrpnfpqdgepqrlhleptwppplsaprgpyhssvvsatrpmvisatrptlpsahktsvisatrpplspvhppamapatppavfsehqipkikanypdlpfghkpgitsathparsppyqppiistnypqvfpphqapmspdthtitylppvpphldpgdttskahqhpllpdapgirtqapqlsvsalqpplptnsrssvhetpvpaanqppafpssplppqrptnqtssispthsysraplvpregvpspksvpqlpsvpstaaptalaesglagqsqrddrwllvallvptcvflvvllalgivyctrcgshapnkritdcyrwvthagnksstepmpprgsltgvqtcrtsv。

6.如权利要求1所述靶向tem-1基因疫苗,其特征在于,所述基因疫苗采用的载体为含有amp抗生素的pcdna3.1,它对抗原rtem-1基因和鞭毛素可共表达。

7.如权利要求1或6所述靶向tem-1基因疫苗的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:

(1)获取rtem-1-sf融合基因

根据genbank中登录的tem-1的全长dna序列,应用dnastar生物信息学软件分析t淋巴细胞与b细胞表位,截取胞外表达序列并筛选t淋巴细胞和b细胞优势表位基因序列rtem-1,通过pcr合成人工rtem-1基因片段,以鞭毛素蛋白为佐剂,获得rtem-1-sf融合基因;

(2)载体与rtem-1-sf融合基因的酶切连接

用nhei和xhoi双酶切rtem-1-sf融合基因和载体,再用t4dna连接酶连接回收后的rtem-1-sf融合基因片段和载体消化片段,获得连接产物;

(3)连接产物的转化

取连接产物与大肠杆菌感受态细胞加入至ep管中,混匀,冰浴后,将ep管放入40-45℃的水浴箱进行热激,再将ep管转移至冰盒中使细胞冷却1-2min;然后向ep管中加入2×yt液体培养基,于35-39℃、180-200rpm条件下恒温摇床培养,将已转化的dh5α感受态细胞转移到含有amp抗生素的lb固体培养基平板上;最后,倒置平板,于37℃培养12-16h,出现菌斑;挑取单菌落于5ml液体lb培养基,220rpm,37℃培养过夜,20%甘油保存菌株。

(4)提取:挑取单克隆菌至1升lb培养基中,置于恒温摇床37℃220转/分增菌过夜,5000rpm×10min离心菌液后,沉淀菌体用纯化试剂盒vigorousn001抽提质粒dna,即得。

8.如权利要求1所述靶向tem-1基因疫苗在抑制肿瘤血管形成中的应用。

9.如权利要求1所述靶向tem-1基因疫苗在预防或治疗乳腺癌中的应用。

10.如权利要求1所述靶向tem-1基因疫苗在制备乳腺癌肺转移抑制剂中的应用。

11.如权利要求1所述靶向tem-1基因疫苗在制备乳腺癌肝转移抑制剂中的应用。


技术总结
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种靶向TEM‑1基因疫苗及其构建与应用,该基因疫苗以鞭毛素(SF)为佐剂,以rTEM‑1为抗原,获得rTEM‑1‑SF融合基因,并构建于真核表达质粒pcDNA3.1中;本发明的rTEM‑1/鞭毛素融合基因疫苗能够抑制乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤血管的形成、肿瘤大小和肿瘤的转移,并且抑制乳腺癌细胞向肺组织和肝脏组织转移,对于乳腺癌有预防和治疗作用。

技术研发人员:袁军;李伟;张景;李荣辉;罗力;卓召振
受保护的技术使用者:贵阳市第二人民医院
技术研发日:2020.07.06
技术公布日:2020.10.16
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