本发明属于生物医用材料
技术领域：
：，具体涉及一种具有快速粘液渗透与药物运载控释作用的复合纳米微球及其制备方法和应用。
背景技术：
：：纳米微球一般定义为1-1000nm的尺度范围的粒子，它们表现出大的比表面积、电磁性和光学行为等独特的性质。纳米微球在制备过程中可以人为的调控其组成、尺寸和表面性质，根据需要合成具有特定性质的纳米微球结构封装和保护治疗药物，使一些水溶性差的药物分子稳定的分散开来，并防止其在体内循环过程中被各种内生防御机制排出体外，这些机制包括酶催化降解、免疫降解、网状内皮系统作用、胃中酸水解和肺黏膜纤维清除作用等。另外，通过控制纳米粒子的形状大小和表面改性，使载药的纳米粒子靶向的到达特定病变部位并可控的释放药物，而不影响正常组织。一些纳米粒子自身具有优良的磁性和光学性，可用来生物成像(磁共振或荧光成像等)，实现诊疗一体化。药物输送系统(dds)[1-5]是指通过防止药物过早释放和增强药物摄取来改善药物的体内利用度，通过控制药物释放速率将药物浓度控制在治疗窗口之内，并通过靶向疾病部位和靶向癌细胞来减少副作用[6-7]。1990年，第一个经美国食品管理局(fda)批准的药物输送系统，脂质体两性霉素b上市。到目前为止已有多种dds可用于治疗癌症、真菌感染和肌肉变性等多种疾病[8-9]。在过去几十年，设计和合成各种生物相容性材料推动了dds的进步。脂质体[10]是在临床上最先使用的。最近，一些新型的材料[4]如多孔二氧化硅、四氯化三铁、碳材料和金属有机框架(mofs)[11-12]，也显示出具有作为dds载体的潜力。其中mofs材料，因为其良好的特性，如孔隙度好，表面积大和化学可调性，受到了广泛关注和研究。horcajada等人报道了，基于三价铁合成的mofs材料作为合适的纳米材料，用于有效控制输送治疗癌症和艾滋病的药物[13]；sunkeke基于la-mof、sio2、fe2o3合成复合材料，实现靶向给药，其荧光性有望对给药进行监控。在药物输送领域，mofs的大部分工作都集中在mil化合物。mil经过各种方法官能化后，再通过后合成修饰得到纳米颗粒(nps)，这些mofs在水中分解以释放它们通过共价结合的有效负载物，并且通过二氧化硅层涂覆纳米颗粒来调节释放速率[14]。这些涂覆的纳米颗粒能够穿过ht-29肿瘤细胞的细胞膜，并根据药物功能抑制细胞生长或细胞染色。此外，mil-53(fe)重新检测布洛芬的递送[15]，发现药物吸附诱导了mofs框架的扩增。该材料的解吸时间非常缓慢(20天)并且具有零级动力学，这归因于药物分子于框架的紧密结合。在mil-100中实现了32％载药率，比目前可用的药物输送平台载药高约5倍。载有药物的mofs表现出与游离药物非常相似的细胞毒性；装载有抗hiv药物的mil-100也显示出对体外病毒复制的显著抑制作用。纳米载药体系能够有效的发挥材料对药物的保护作用，协助药物跨越黏膜屏障，通过高通透性和滞留(enhancedpermeabilityandretention，epr)[16-18]效应增强药物在靶点位置的积累，改变药物在体内的分布，减少系统性毒性，目前已成为现代药物方向。金属有机框架(metal-organicframeworks，mofs)是一种新兴的多孔杂化材料，与传统纳米材料相比，mofs具有可调节的组成和拓扑结构、高度有序的空隙、大的表面积以及优良的物理化学性质，被广泛用于催化、化学传感、气体吸附等多个领域，尤其在药物装载和输送方面备受关注。沸石咪唑骨架材料(zif-8)[19-20]是mofs材料中最具有代表性的一种，其骨架结构是由金属zn离子与二甲基咪唑中的n原子相连形成四面体结构。除了具有mofs的优势外，zif-8还具有更好的载药能力，化学稳定性，良好的生物相容性以及灵敏的ph响应性，使负载的药物在肿瘤部位实现可控、精准释放，满足新型纳米材料载药体系在载药量、稳定性以及药物释放等多方面要求。zif-8的合成，本质上取决于金属中心和有机键的配位能力。与传统沸石相比，zif-8具有更好的灵活性和可控性，通过改变或化学改性阴离子咪唑连接物，可以调整zif-8尺寸和吸附性能。然而，人体内的粘液屏障，如常见的呼吸类疾病呼吸道粘液高分泌的特性使得纳米粒子很难有效穿透，降低了药物的治疗效果。为了解决这一问题，急需开发一种具有粘液穿透能力的药物递送载体。主要参考文献:[1]bergera.drugdeliverysystemmaycombatcancer.britishmedicaljournal,2001,322(7278):72-72.[2]brownl,langerr.transdermaldeliveryofdrugs.annualreviewofmedicine.1988,39(39):221-229.[3]towarig,towarir,sriwastawab,etal.drugdeliverysystem:anupdatedreview.internationaljournalofpharmaceuticalinvestigation.2012,2(1):2-11.[4]sayede,haj-ahmadr,rupareliak,etal.porousinorganicdrugdeliverysystem-areview.aapspharmscitech,2017,18(5):1507-1525.[5]hejj,qixx,maioyp,etal.applicationofsmartnanostructuresinmedicine.nanomedicine,2010,5(7):1129-1138.[6]aberoumandism,mohammadhosseinim,abasie,etal.anupdateonapplicationofnanostructureddrugdeliverysystemincancertherapy:areview.artificialcellsnanomedicineandbiotechnology,2017,45(6):1058-1068.[7]sainis,kumars,choudharym,etal.microspheresascontrolleddrugdeliverysystem:anupdatedreview.internationaljournalpharmaceuticalsciencesandresearch,2018,9(5):1760-1768.[8]zhangy,chanhf,leongkm.advancedmaterialsandprocessingfordrugdelivery:thepastandthefuture.advanceddrugdeliveryreviews,2013,65(1):104-120[9]allentm,cullispr.drugdeliverysystem:enteringthemainstream.science,2004,303(5665):1818-1822.[10]tarahovskyys.“smart”liposomalnanocontainersinbiologyandmedicine.biochemistry-moscow,2010,75(7):811-824.[11]yaghiom,lih.hydrothermalsynthesisofametal-organicframeworkcontaininglargerectangularchannels.journaloftheamericanchemicalsociety,1995,117(41):10401-10402.[12]lih,eddaoudim,o’keeffem,etal.designandsynthesisofanexceptionallystableandhighlyporousmetal-organicframework.nature,1999,402(6759):276-279.[13]horcajadap,chalatit,serrec,etal.porousmetal-organic-frameworknanoscalecarriersasapotentialplatformfordrugdeliveryandimaging.naturematerials,2010,9(2):172-178.[14]taylor-pashowkml,dellaroccaj,xiezg,etal.postsyntheticmodificationoftron-carboxylatenanoscalemetal-organicframeworksforimaginganddrugdelivery.journaloftheamericanchemicalsociety,2009,131(40):14261-14263.[15]horcajadap,serrec,mauring,etal.flexibleporousmetal-organicframeworksforacontrolleddrugdelivery.journaloftheamericanchemicalsociety,2008,130(21):6774-6780.[16]perchef,torchilinvp,recenttrendsinmultifunctionalliposomalnanocarriersforenhancedtumortargeting.j.drugdelivery2013,705265doi:10.1155/2013/705265[17]nishiharah.humanpathologicalbasisofbloodvesselsandstromaltissuefornanotechnology.adv.drugdeliveryrev.74,19-27.[18]yokoik,kojicm,milosevicm,taneit,ferrarim,ziemysa.capillary-wallcollagenasabiophysicalmarkerofnanotherapeuticpermeabilityintothetumormicroenvironment.cancerres.74,4239-46.[19]nohk,leej,kimj.compositionsandstructuresofzeoliticimidazolateframeworks.israeljournalofchemistry,2018,58(9-10):1075-1088.[20]yaojf,wanght.zeoliticimidazolateframeworkscompositemembranesandthinfilms:synthesisandapplications.chemistrysocietyreview,2014,43(13):4470-4493.技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有快速粘液渗透与药物运载控释作用的复合纳米微球的制备和应用。该金属有机框架zif-8包裹的黑磷量子点和治疗药物复合纳米微球具有良好的载药能力，适用范围广，能装载多种治疗药物并且能提升药物的治疗效果，降低不良毒副作用；而使用电中性的高分子量聚乙二醇(peg)进行表面修饰后可以降低复合纳米微球的表面电荷，从而使得复合纳米微球具有“粘液惰性”能够快速渗透粘液层。同时该纳米微球的制备工艺简单、重现性好，能快速实现大规模制备。为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：一方面，本发明提供一种复合纳米微球，以金属有机框架zif-8为纳米微球主体，复合纳米微球内部包裹包有黑磷量子点和活性成分，外部使用亲水性高分子聚合物进行表面修饰；亲水性高分子聚合物选自聚乙二醇(peg)。另一方面，本发明提供一种如上所述的黑磷金属有机框架zif-8复合纳米材料的制备方法，其包括如下步骤：1)金属有机框架zif-8与黑磷量子点以及活性成分混合，得到负载黑磷量子点和活性成分的金属有机框架zif-8；2)对步骤1)制得的产品以亲水性高分子聚合物进行表面修饰获得复合纳米微球。再一个方面，本发明提供了一种药物传递组合物，其中包括上述复合纳米微球。再一个方面，本发明提供了一种检测试剂，其中包括上述复合纳米微球。再一个方面，本发明提供了本发明所述的复合纳米微球作为制备治疗呼吸道疾病的药物的用途。再一个方面，本发明提供了本发明所述的复合纳米微球作为制备检测呼吸道疾病的药检测试剂的用途。有益效果1)本发明首次将zif-8以亲水性的peg进行修饰并用于增加其粘液穿透能力，使得复合纳米颗粒的粘液穿透能力提升，提高靶向能力与穿透人体生理屏障阻碍的能力。2)本发明将黑磷量子点与活性成分共同负载于zif-8内，并通过外部干预方式，如近红外光转化照射，转化为热量破坏纳米微球结构促进zif-8释放活性成分，能够实现主动选择释放时间和释放部位的效果，实现了主动靶向，精准释放。3)本发明所述的纳米材料各组成成分相互配合，协同增效，能够高效发挥药物治疗作用；且纳米球具有良好的载药能力，适用范围广，能装载多种治疗药物并且能提升药物的治疗效果，降低不良毒副作用；同时具有良好的生物相容性。附图说明图1为本发明实施例1peg修饰且负载黑磷量子点和治疗药物的金属有机框架zif-8的复合纳米微球的扫描电镜图；图2为本发明实施例4的金属有机框架zif-8纳米微球的扫描电镜图；图3为本发明实施例2peg修饰且负载黑磷量子点和治疗药物的金属有机框架zif-8的复合纳米微球扫描电镜图；图4为各样品分散于pbs缓冲液5h的实物图；a为实施例4金属有机框架zif-8；b为治疗药物dox；c为黑磷，d为实施例1制得的peg修饰的包裹黑磷量子点的zif-8复合纳米微球；e为实施例1制得的peg修饰的包裹黑磷量子点和治疗药物dox的zif-8复合纳米微球；图5为不同时间段各样品渗透人工粘液层能力的观察；a为实施例4金属有机框架zif-8，b为实施例5peg修饰的金属有机框架zif-8，c为实施例6负载黑磷量子点和治疗药物的金属有机框架zif-8，d为实施例1peg修饰且负载黑磷量子点和治疗药物的金属有机框架zif-8；图6为不同时间段下peg修饰的包裹黑磷量子点和治疗药物dox的zif-8复合纳米微球在不使用或使用近红外激光照射下治疗药物dox的释放效率对比；图7为平板计数法观察各样品对大肠杆菌的抑制效果图；a为空白对照组；b为实施例4金属有机框架zif-8；c为实施例1peg修饰且负载黑磷量子点和治疗药物的金属有机框架zif-8；d为实施例1peg修饰且负载黑磷量子点和治疗药物的金属有机框架zif-8+近红外激光光照。近红外激光光照条件为使用808纳米激光(1w/cm2)照射10分钟。；图8为平板计数法观察各样品对金黄色葡萄球菌的抑制功效图；a为空白对照组；b为实施例4金属有机框架zif-8；c为实施例1peg修饰且负载黑磷量子点和治疗药物的金属有机框架zif-8；d为实施例1peg修饰且负载黑磷量子点和治疗药物的金属有机框架zif-8+近红外激光光照。近红外激光光照条件为使用808纳米激光(1w/cm2)照射10分钟。；图9为利用活/死细胞染色试剂盒观察各样品与hok细胞的生物相容性(a为空白对照组、b为黑磷、c为金属有机框架zif-8、d为peg修饰的包裹黑磷量子点的zif-8复合纳米微球)；图中标尺尺寸为10μm；图10为利用活/死细胞染色试剂盒观察各样品与cal-27细胞的生物相容性(a为空白对照组、b为黑磷、c为金属有机框架zif-8、d为peg修饰的包裹黑磷量子点的zif-8复合纳米微球)；图中标尺尺寸为10μm。具体实施方式为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。本发明具体实施方案提供了一种复合纳米微球，其包括金属有机框架zif-8，以及金属有机框架zif-8表面修饰的亲水性高分子聚合物，金属有机框架zif-8负载有黑磷量子点和活性成分，亲水性高分子聚合物选自聚乙二醇(peg)。在本发明的一些实施例中，复合纳米微球的粒径为50-1000nm，优选为50-300nm，例如50nm、70nm、100nm、150nm、180nm、200nm、220nm、250nm或300nm。复合纳米微球的粒径过大导致其纳米性能降低，穿透生物屏障的能力会下降，粒径过小会导致所制备纳米药物的渗透能力不足迅速被机体排除，导致药效不佳。在本发明的一些实施例中，所述聚乙二醇的分子量为1000-3000kd，优选为1500-2500kd。在本发明的一些实施例中，所述黑磷量子点的粒径尺寸为2-10nm，例如2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、或10nm等。所述黑磷量子点的粒径尺寸选择在2-10nm的原因是黑磷量子点的尺寸需在此区间才具有较优的稳定性与量子点效应。在本发明的一些实施例中，黑磷量子点与金属有机框架zif-8的质量比为1:4-10，优选为1:5-8。在本发明的一些实施例中，活性成分与金属有机框架zif-8的质量比为1:4-12，优选为1:5-10。在本发明的一些实施例中，活性成分为任意具有治疗或预防作用的成分，其包括但不限于抗肿瘤药物、抗生素类药物、抗病毒药物、激素、作用于呼吸道疾病的药物。抗肿瘤药物优选为影响dna结构化学药物阿霉素(dox)，烷化类，干扰转录及蛋白类药物。在本发明的一些实施例中，复合纳米微球还可以标记标签，所述标签选自荧光分子，所述的荧光分子选自异硫氰酸荧光素(fitc)、罗丹明等。通过表面的标记可以实现对纳米球的定位示踪观察和浓度检测等。本发明具体实施方案还提供了复合纳米微球的制备方法，其包括如下步骤：1)金属有机框架zif-8与黑磷量子点以及活性成分混合，得到负载黑磷量子点和活性成分的金属有机框架zif-8水溶液；2)对步骤1)制得的产品以亲水性高分子聚合物进行表面修饰获得复合纳米微球；所述亲水性高分子聚合物选自聚乙二醇。在本发明的一些实施例中，步骤2)中表面修饰的方法为，将亲水性高分子聚合物加入到步骤1)所得水溶液中，混合均匀后离心去除多余亲水性高分子聚合物，即得。在本发明的一些实施例中，步骤2)中，将亲水性高分子聚合物加入到步骤1)所得水溶液中的浓度为过量peg，优选为4mg/ml以上。本发明中使用的金属有机框架zif-8是沸石咪唑酯骨架材料(zifs)中最重要的一种具有沸石骨架结构的金属有机骨架材料。沸石咪唑酯骨架材料中的过渡金属为zn，咪唑或咪唑衍生物为有机连接配体。咪唑酯是具有共轭性质的五元环，通过失去一个质子能与金属离子配体，形成了一个接近于145度的m-im-m键角，其连接方式刚好对应于传统沸石中的si-o-si结构。本发明使用的zif-8可以采用现有技术中的任意方法获得。在本发明的一些实施例中，金属有机框架zif-8通过以下方法获得，将锌盐与咪唑基配体分别溶解，并将咪唑基配体溶液与锌盐配体溶液混合，分离沉淀，获得。在本发明的一些优选的实施例中，制备金属有机框架zif-8的过程中，所使用的锌盐选自硝酸锌、六水合硝酸锌、醋酸锌、硫酸锌，优选为硝酸锌、六水合硝酸锌。在本发明的一些优选的实施例中，制备金属有机框架zif-8的过程中，所使用的咪唑基配体选自2-甲基咪唑。在本发明的一些优选的实施例中，制备金属有机框架zif-8的过程中，所使用的溶剂为无水甲醇、无水乙醇或无水丙醇。在本发明的一些优选的实施例中，锌盐与咪唑基配体的摩尔比为20-50:1，优选为30-40:1。优选地，在制备金属有机框架zif-8的过程中，所述金属有机框架zif-8溶液中zif-8的浓度为20-32mg/ml，例如20mg/ml、22mg/ml、24mg/ml、26mg/ml、28mg/ml、30mg/ml、32mg/ml等。所述zif-8的浓度会影响金属有机框架zif-8的制备，选择在20-32mg/ml范围内的原因是超过此浓度值会导致纳米粒子出现团聚现象，在溶液中的分散性不佳，小于此浓度值会不利于金属有机框架zif-8形成纳米粒子。在本发明的一些实施例中，黑磷量子点通过现有技术中已知的方法制备或者通过市售获得。在本发明的一些实施例中，黑磷量子点通过以下方法获得，在真空环境下将块状黑磷研磨后分散于第一有机溶剂中，将分散液与第二有机溶剂和氢氧化钠进行混合，再将混合液加热、冷却、离心，收集上清液，得到黑磷量子点分散液。优选地，所述块状黑磷的粒径为10-200μm，例如10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、180μm、或200μm。优选地，所述第一有机溶剂包括n-甲基吡咯烷酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、甲醇、异丙醇、三氯甲烷或二氯甲烷中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如n-甲基吡咯烷酮和二甲基甲酰胺的组合、二甲基亚砜和四氢呋喃的组合、甲醇和异丙醇的组合等。优选地，所述分散液的浓度为3-4mg/ml，例如3mg/ml、3.2mg/ml、3.4mg/ml、3.5mg/ml、3.6mg/ml、3.7mg/ml、3.8mg/ml或4mg/ml。优选地，所述第二有机溶剂为n-甲基吡咯烷酮。优选地，所述加热的温度为100-150℃，例如100℃、105℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、140℃、145℃或150℃。优选地，所述加热的时间为18-24h，例如18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h。优选地，所述冷却是指冷却至16-24℃，例如16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃或24℃。再一个方面，本发明提供了本案发明所述的复合纳米微球作为制备治疗呼吸道疾病的药物的用途。再一个方面，本发明提供了本案发明所述的复合纳米微球作为制备检测呼吸道疾病的药检测试剂的用途。实施例1peg修饰且负载黑磷量子点和治疗药物的金属有机框架zif-8本实施例提供一种复合纳米微球以金属有机框架zif-8为纳米微球主体，复合纳米微球内部包裹包有黑磷量子点和治疗药物，外部使用peg进行表面修饰。其制备方法为：(1)在真空环境下将粒径为80μm的块状黑磷研磨后分散于n-甲基吡咯烷酮和二甲基甲酰胺的混合溶剂中，将浓度为2mg/ml的分散液与n-甲基吡咯烷酮和氢氧化钠进行混合，再将混合液在130℃下加热18h、冷却至24℃、离心，收集上清液，得到黑磷量子点分散液；(2)制备金属有机框架zif-8的方法为：称取0.31g的六水合硝酸锌完全溶解在5ml的无水甲醇中。准确称取3g(48.72mmol/l)2-甲基咪唑溶解在另一份8ml的无水甲醇中，将其滴入前一份甲醇溶液中，室温下搅拌10min。将所得的白色沉淀用无水甲醇和去离子水分别洗涤3次，在转速9000rpm离心机中离心分离。将所得的白色固体在真空干燥烘箱中干燥；(3)将步骤(2)制得的金属有机框架zif-8与预备好的黑磷量子点和治疗药物阿霉素(dox)混合，加入20ml玻璃瓶中进行搅拌反应，得到负载黑磷量子点和治疗药物的金属有机框架zif-8的复合纳米材料，混合后黑磷量子点与金属有机框架zif-8的质量比为1:6；阿霉素与金属有机框架zif-8的质量比为1:7.5。(4)以peg修饰步骤3)所得复合纳米材料，peg的分子量2000kd，将peg与前述复合纳米材料的投料比为5mg/ml，即过量的peg，peg混合均匀后8000r/min离心3分钟并用去离子水清洗去除未修饰上的peg。实施例2peg修饰且负载黑磷量子点和治疗药物的金属有机框架zif-8制备一种金属有机框架zif-8纳米微球，其制备方法与实施例1的区别仅在于第(2)步骤中，以0.2g的硝酸锌替换0.31g的六水硝酸锌，其他保持不变。实施例3peg修饰且负载黑磷量子点的金属有机框架zif-8制备一种金属有机框架zif-8纳米微球，其制备方法与实施例1的区别仅在于省略步骤(3)中的治疗药物。实施例4金属有机框架zif-8制备一种金属有机框架zif-8纳米微球，仅采用实施例1中的步骤(2)制得。实施例5peg修饰的金属有机框架zif-8制备一种金属有机框架zif-8纳米微球，(1)在真空环境下将粒径为80μm的块状黑磷研磨后分散于n-甲基吡咯烷酮和二甲基甲酰胺的混合溶剂中，将浓度为2mg/ml的分散液与n-甲基吡咯烷酮和氢氧化钠进行混合，再将混合液在130℃下加热18h、冷却至24℃、离心，收集上清液，得到黑磷量子点分散液；(2)制备金属有机框架zif-8的方法为：称取0.31g的六水硝酸锌完全溶解在5ml的无水甲醇中。准确称取3g(48.72mmol/l)2-甲基咪唑溶解在另一份8ml的无水甲醇中，将其滴入前一份甲醇溶液中，室温下搅拌10min。将所得的白色沉淀用无水甲醇和去离子水分别洗涤3次，在转速9000rpm离心机中离心分离。将所得的白色固体在真空干燥烘箱中干燥；获得金属有机框架zif-8。(3)以peg修饰金属有机框架zif-8，peg的分子量2000kd，将peg与金属有机框架zif-8的投料比为5mg/ml，peg混合均匀后8000r/min离心3分钟并用去离子水清洗去除未修饰上的peg。实施例6负载黑磷量子点和治疗药物的金属有机框架zif-8采用实施例1中的步骤(1)-(3)制得。实施例7扫描电镜检测和分散性检测本实施例采用扫描电镜观察本发明制得的复合纳米微球及其裂解时的形态特征。对实施例1和2制得的peg修饰的包裹黑磷量子点和治疗药物dox的zif-8复合纳米微球进行扫描电镜观察，如图1和图3所示。图2为实施例4的金属有机框架zif-8纳米微球。由图1-3可知：制备得到的纳米球粒径为100-350nm左右，且在包载黑磷量子点和治疗药物后，通过peg进行表面修饰，其粒径与形态均未发生明显变化。各样品分散于pbs缓冲液，静置5h后观察。实验结果见图4，其中a为实施例4金属有机框架zif-8；b为治疗药物dox；c为黑磷量子点，d为实施例1制得的peg修饰的包裹黑磷量子点的zif-8复合纳米微球；e为实施例1制得的peg修饰的包裹黑磷量子点和治疗药物dox的zif-8复合纳米微球；由图4可知：在磷酸盐缓冲液中，所制备的复合纳米微球具有良好的分散性能，即便在高浓度下也不产生团聚。实施例8渗透粘液屏障的能力的检测体外模拟人体粘液屏障，检测所制备的复合纳米微球渗透粘液屏障的能力。其中，体外模拟人体粘液是将黏液、dna和蛋黄乳剂的成分混合在水溶液中制备出人工粘液，然后置于凝固的琼脂糖凝胶之上。同时，用考马斯亮蓝染料对所制备的样品进行染色，随后将样品分别小心加入人工黏液层表面，观察不同时间段纳米微球渗透粘液层的能力。实验组分别为：a：实施例4金属有机框架zif-8，b：实施例5peg修饰的金属有机框架zif-8，c：实施例6负载黑磷量子点和治疗药物的金属有机框架zif-8，d：实施例1peg修饰且负载黑磷量子点和治疗药物的金属有机框架zif-8。实验结果参见图5和图6，实验结果表明，peg修饰能降低纳米微球的表面电荷，避免纳米微球吸附粘液，都具有“粘液惰性”，明显提升纳米微球穿透粘液层的能力，可迅速地穿透粘液层。如图5所示，peg修饰的zif-8复合纳米微球以及均显示了更强的粘液层渗透能力。当纳米微球穿透粘液层后，可通过近红外光照射在短时间内将所装载药物释放出来。如图6所示，peg修饰的包裹黑磷量子点和治疗药物dox的zif-8复合纳米微球在pbs溶液中仅释放出少量的dox药物，当使用808纳米激光(1w/cm2)照射5分钟后，纳米微球中的黑磷量子点可迅速将近红外光转化为热能，破坏zif-8纳米微球结构，快速释放纳米微球中的治疗药物dox。由实验结果可知，仅单次短时间的激光照射即可将纳米微球中最高～88.2％的治疗药物dox释放出来，实现精准的药物控释。实施例9抗菌功效评价本实施例对本发明制备的黑磷金属有机框架zif-8复合纳米材料进行抗菌功效评价。实验组分别为：a为空白对照组；b为实施例4金属有机框架zif-8；c为实施例1peg修饰且负载黑磷量子点和治疗药物的金属有机框架zif-8；d为实施例1peg修饰且负载黑磷量子点和治疗药物的金属有机框架zif-8+近红外激光光照。近红外激光光照条件为使用808纳米激光(1w/cm2)照射10分钟。使用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为细菌模型，挑取少量细菌保菌液加到含有lb液体的细菌培养基中，置于摇菌管内于37℃，240rmp细菌恒温培养箱中振荡过夜培养，随后用冷冻离心机(5000rmp，2min)对细菌进行收集，并使用无菌生理盐水洗涤细菌后，用生理盐水调节细菌浓度，用多功能酶标仪进行检测，使细菌悬液的浓度达到od600为0.01(即(0.4-0.5)×106cfu/ml)。将100μl上述各样品与100μl活化的菌悬液共混后均匀涂布于培养皿表面，菌液均匀涂布于培养皿后，将培养皿置于细菌培养箱中37℃恒温恒湿培养18h，观察菌落个数。光照组用808nm(1w/cm2)近红外光激光器光照10min后，菌液均匀涂布于培养皿后，将培养皿置于细菌培养箱中37℃恒温恒湿培养18h，观察菌落个数。每个样品平行重复5次。空白对照组将样品溶液换为等体积的生理盐水。各组对大肠杆菌的抗菌结果如图7所示，各组对金黄色葡萄球菌的抗菌结果如图8所示，由图7和图8可知：参比空白对照组，金属有机框架zif-8纳米微球以及包裹有黑鳞量子点的金属有机框架zif-8纳米微球对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力较弱，但当使用近红外激光照射以后，其抗菌功效明显提升。说明通过红外激光照射后能够使金属有机框架zif-8释放其中的活性成分，实现定点释放的效果。实施例10生物相容性评价本实施例对所制备的peg修饰的包裹黑磷量子点的zif-8复合纳米微球进行生物相容性评价。实验组分别为：a为空白对照组、b为黑磷量子点、c金属有机框架zif-8、d为实施例1peg修饰且负载黑磷量子点和治疗药物的金属有机框架zif-8具体操作为：通过活/死细胞染色试剂盒(calceinam/pi)来检测纳米球的生物相容性，利用calceinam为活细胞优良的荧光染色剂，其能轻易穿透活细胞的特点，当其到达细胞内会被酯酶水解为钙黄绿素留在胞内，呈现强绿色荧光；试剂盒中的碘化丙啶(pi)不能穿过活细胞膜，但能穿过死细胞膜的无序区域到达细胞核，在嵌入细胞dna螺旋后产生红色荧光(激发波长为535nm，发射波长为617nm)从而使死细胞呈现红色荧光。分别取对数生长期的口腔癌细胞(cal-27)与上皮细胞(hok)以5×104/ml，每孔400μl加入48孔板内，于细胞培养箱中培养24h后轻轻吸去每孔中的细胞培养基，将含有不同待测组分(浓度均为100μg/ml的金属有机框架zif-8、黑磷量子点、包裹有黑磷量子点的金属有机框架zif-8)的细胞培养基400μl加入孔中继续培养24h，以无血清培养基作为空白对照。取出48孔细胞培养板，吸除孔内培养基，用pbs溶液小心清洗孔板3次后向每孔内加入钙黄绿素和碘化丙啶溶液，在培养箱中孵育20分钟后，吸除染料并用pbs溶液小心清洗3次后置于荧光显微镜下进行观察。实验结果如图9和图10所示，与空白对照组相比，所有样品孵育的细胞均呈现强绿色荧光，表明各样品具有良好的生物相容性，在100μg/ml的浓度下对口腔癌细胞(cal-27)孵育24h后仍未见检测到明显的细胞毒性，即便在100μg/ml的浓度下对上皮细胞(hok)孵育24h后也未见检测到明显的细胞毒性。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的具有快速粘液渗透与药物运载控释作用的复合纳米微球及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。当前第1页12当前第1页12