技术领域：
本发明涉及鸡球虫病治疗技术领域，尤其涉及一种防治鸡耐药性球虫病的组合物及其制备方法和应用。
背景技术：
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鸡球虫病是由一种或多种艾美耳属单细胞球虫寄生于鸡肠道不同部位的黏膜上皮细胞内所引起的，其临床表现是以腹泻、血便、生长迟缓、饲料转化率降低、发病率及死亡率均较高为特征的寄生虫性疾病。其中以毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的致病性最强。在高温、湿润的夏季气候条件下多见和易发，集约化养殖常年可见发病。鸡球虫主要危害3月龄以内的雏鸡，以10-60日龄的雏鸡发病率和死亡率较高，病死率最高可达30-80％以上，呈世界性分布。据报道，每年全世界因该病造成的损失高达几十亿美元。因球虫在鸡体内发育的复杂性和特殊性，使得球虫的免疫性较其他生物的免疫性更为复杂，在养鸡生产中球虫疫苗因其稳定性差，弱毒返强等原因而受到限制，因此防治鸡球虫病当前仍是以化学药物为主，但因抗球虫药物的长期使用，不可避免地导致耐药虫株的产生。迄今为止，几平所有的抗球虫药均有耐药虫株的出现，且表现出对与该药同类或作用机理相同的其他药物产生一定程度的交叉耐药性。据统计，我国每年用于鸡抗球虫的药费高达6-8亿元，这无疑是养鸡业的一大损失。因此，当前迫切需要研发一种抗鸡球虫耐药性药物，用于养鸡生产防治球虫病显得极为必要，并且意义重大。
技术实现要素：
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本发明的目的在于克服上述缺点，针对鸡球虫容易产生抗药性耐药性问题，提供一种可用于防治鸡耐药性球虫病的组合物及其制备方法，用于养鸡生产防治球虫病，具有很重要的现实意义。防治鸡耐药性球虫病的组合物除用于防治鸡球虫感染外，还可用于在畜禽球虫与病毒、细菌、霉菌和其它原虫疾病的混合感染治疗中的应用。
为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：
本发明的防治鸡耐药性球虫病的组合物，其包括异噻唑啉酮类化合物100～900份，以及乙二胺四乙酸二钠100～900份和植物单宁100～900份二者中的至少一种；产品异噻唑啉酮类化合物含量：以有效成分异噻唑啉酮计，包括10～90％各种含量规格。
以上组份可以按照重量份、质量份或是体积份进行配制。
以上组方在制备过程中，根据工艺可以不加入或加入适宜制药辅料。
本发明的防治鸡耐药性球虫病的组合物主要有效成分含量均以异噻唑啉酮计。其中：
(1)异噻唑啉酮类化合物是指含有异噻唑啉酮环的一系列衍生物的总称。异噻唑啉酮属于杂环有机化合物，其基本结构式为：
异噻唑啉酮类衍生物是指2位、4位及5位上被其他物质取代所形成的一系列化合物。
(2)植物单宁(包括植物单宁酸、植物鞣质和植物鞣酸及鞣料植物提取物)是指从各种鞣料植物资源和中药材(如五倍子、诃子、乌梅等)中采用各种技术方法提取的一种多酚类混合类单宁物质。
(3)乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)又称依地酸二钠，其分子式为c10h14n2nao3·2h2o，分子量是336.1。本品为白色结晶颗粒或粉末，无臭、无味。易容于水，极难溶于乙醇。其结构式为：
本发明的防治鸡耐药性球虫病的组合物的进一步优化为：所述的异噻唑啉酮类化合物为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(mit)，5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(cmit)，苯并异噻唑啉酮(bit)，4，5-二氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3酮(dcmit)，2-甲基-4-异噻唑啉-3酮(mit)，辛基异噻唑啉酮(oit)，4，5-二氯-n-辛基-4-异噻唑啉-3酮(dcoit)，丁基苯并异噻唑啉酮(bbit)，n-甲基-1，2-苯并异噻唑啉-3-酮(mbit)，n-正辛基-1，2-苯并异噻唑啉-3-酮(obit)10种衍生物化合物中的至少一种。
本发明的防治鸡耐药性球虫病的组合物的进一步优化为：其用量为：以有效成分异噻唑啉酮计，同时考虑到本发明组合物药理作用的综合效应，经研究按体重用量为：每kg体重的鸡，防治鸡耐药性球虫病的组合物的使用量为5mg最优；兑水或者拌料适量饲喂。
本发明的防治鸡耐药性球虫病的组合物的进一步优化为：所述的防治鸡耐药性球虫病的组合物的剂型包括：固态粉散剂和液态制剂2大类，其中液态制剂包含溶液、合剂、乳化剂和混悬液。产品异噻唑啉酮类化合物含量：以有效成分异噻唑啉酮计，包括10～90％各种含量规格。
本发明还涉及一种根据前面所述的防治鸡耐药性球虫病的组合物或优化组合物的制备方法：
根据组方配料，不添加或者添加适宜的辅料，然后搅拌混合均匀，填充包装、贴签即得固态粉散剂；或
根据组方配料，不添加或者添加适宜的辅料，然后在一定的条件下进行均质，搅拌混合均匀，最后填充装瓶、封口、贴签即得液态制剂；
其中所述的适宜的辅料是指根据产品制剂生产需要，所选用的适宜的必要辅助材料，包括载体、吸附剂、稀释剂、溶剂、分散剂、润湿剂、乳化剂、助溶剂和防冻剂以及表面活性剂中的一种或几种。
本发明还涉及防治鸡耐药性球虫病的组合物在畜禽球虫与病毒、细菌、霉菌和其它原虫疾病的的混合感染治疗中的应用。
本发明还涉及一种异噻唑啉酮类化合物在防治鸡耐药性球虫病的治疗中的应用，由异噻唑啉酮类化合物加入适宜制药辅料制成。
鸡球虫是一种结构和发育过程复杂的单细胞生物。据研究，每个鸡柔嫩艾美耳球虫感染性卵囊含有四个孢子囊，每个孢子囊中又含有两个子孢子。每个子孢子一般结构包括细胞核、核仁、线粒体、内质网、核糖体、高尔基体、淀粉颗粒、脂质体、蛋白颗粒、空泡等等，特殊结构包括顶复器(极环、棒状体、微线、微孔、微管、类锥体等)、折光体、表膜等，其中子孢子(包括裂殖子)的表膜由三层(内膜复合二层、外膜一层)单位膜组成，是一个包裹整个虫体的连续结构。因此球虫表膜对保持虫体的自身稳定和参与宿主的相互作用起着重要的作用，使子孢子能够耐受肠腔胰酶的消化作用，裂殖体能够抵抗透明质酸酶。据研究，鸡球虫整个生长发育过程基本是：感染性卵囊进入鸡消化道后，在各种因素作用下，首先是子孢子脱囊而出，然后进入宿主的肠黏膜上皮细胞内，子孢子发育成滋养体，经裂殖生殖则产生裂殖体，裂殖体发育成裂殖子，成熟后释放出裂殖子。当裂殖体经过几代的发育和繁殖到一定程度时，则释放出大量的裂殖子。据研究，鸡球虫1个孢子化卵囊可发育成250万个裂殖子。这时裂殖子释放时可破坏鸡肠道黏膜上皮细胞，引起肠道黏膜血管破裂出血、黏膜坏死、下痢、腹泻、拉稀、饲料粪等黏膜坏死和肠炎一系列病理变。经过一定的代数的无性生殖后，裂殖子不再发育成裂殖体，而发育成大小配子母细胞。最后，大小配子融合形成合子，这时虫体开始形成卵囊壁，待卵囊形成后即随粪便排出体外，再次形成感染性卵囊。
由于鸡球虫结构特性，使得卵囊抵抗力非常强，在土壤中可存活4-9个月，在树荫下可存活15-18个月，卵囊也不容易被普通消毒剂杀灭，在温暖潮湿的环境中极有利于卵囊形成具有感染性的孢子化结构，可引起鸡反复感染球虫病。
据发明人研究，初步认为异噻唑啉酮类化合物，其杀灭单细胞球虫的机理是：异噻唑啉酮衍生物穿过球虫子孢子表膜，杂环上的活性部分则与球虫细胞内蛋白质作用使其分子内含巯基的键断开，如异噻唑啉酮类化合物与谷胱甘肽(gsh)的反应，使蛋白质氨基酸链断裂，从而破坏球虫细胞；
另一面异噻唑啉酮类化合物也能与dna结合，阻断核酸的复制从而抑制球虫细胞的繁殖。异噻唑啉酮类化合物抗球虫作用的最大特点穿透力强，既可抑制核酸复制，又可破坏其蛋白质结构。因此，球虫不易产生抗药耐药性问题。据资料，异噻唑啉酮类化合物有很好的环境友好因素，在环境中能快速自然降解成低毒或无毒物，不会污染环境。毒性：因品种而异，大鼠急性经口服半致死剂量(ld50)110-2000mg/kg。兔急性经皮半致死剂量(ld50)600-2000mg/kg。原液对皮肤和黏膜具有较强的刺激性和致敏性。水生生物：虹鳟鱼半致死浓度(lc50)0.19mg/l(96h)。蓝腮鱼半致死浓度(lc50)10mg/l(96h)。异噻唑啉酮类化合物主要优点是体现在广谱、高效、低毒和易降解等。
据发明人研究，由于乙二胺四乙酸二钠是一种极性很强的化合物，可以一个分子与二价及三价金属离子以1:1比例形成螯合物，在溶液中极容易与球虫细胞膜的镁、锰、钙、钾等金属离子结合，形成稳定的螯合物，从而改变球虫细胞膜的渗透性，使得抗球虫药物进入细胞内的浓度有所提高，从而发挥其抑杀球虫的协同增强作用，尤其是对抗药耐药的球虫株作用效果更加显著。
植物单宁是指植物体内所含有的单宁物质(又称鞣质、鞣酸、单宁酸)。广泛存在于植物的根、茎、叶、果实及树皮等部位，是相对分子质量为500-3000u的多酚化合物。植物体内的单宁往往是多种多元酚衍生物组成的复杂混合物。天然单宁一般为有色非晶形固体，味苦涩、有收敛性，溶于水，以及乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶液剂；单宁可与蛋白质、酶反应，影响蛋白质、酶的构象，从而抑制酶的活性；单宁还可与铜、锌、铁等离子发生络合，使含有这些离子的金属酶活性受到抑制以及抗氧化性、吸收紫外线等生物活性。
根据单宁的化学组成和化学键的特征将单宁分为两类：水解类单宁和凝缩类单宁。
(1)水解类单宁。又称可水解单宁，分子内具有酯键，通常以一个碳水化合物(或与多元醇有关的物质)为核心，通过酯键与多元酚羧酸相连接而成，因此在酸、碱或酶作用下发生水解，产生糖或多元醇及多元酚羧酸。根据所得的多元酚羧酸的不同，又可将水解类单宁细分成没食子单宁(水解产生没食子酸)和鞣花单宁(水解产生鞣花酸或其衍生物)。如水解类单宁有五倍子单宁、橡腕单宁、化香果单宁等。
(2)凝缩类单宁。又称缩合单宁或不可水解单宁。此类单宁分子中的芳香环均以碳碳相连，不以糖构成分子的整体结构，因此难以水解。多数凝缩类单宁是黄烷醇的聚缩物。混合类单宁兼有水解类单宁和凝缩类单宁的特征。
本发明所指的植物单宁(包括植物单宁酸、植物鞣质和植物鞣酸及鞣料植物提取物)是指从各种鞣料植物资源和中药材(如五倍子、诃子、乌梅等)中采用各种技术方法提取与纯化的一种多酚类混合类单宁物质。当前植物单宁的提取与纯化的方法有：①溶剂泡浸提取法；②超声波辅助提取法；③微波辅助提取法；④酶转化提取法；⑤超临界流体co2萃取技术；⑥膜技术提取法；⑦超高压提取法；⑧半仿生提取法；⑨发酵提取法；⑩单宁粗提取物中含有大量的糖、蛋白质、脂类等杂质，需进一步分离纯化。初步分离可采取的方法有皮粉法、醋酸铅沉淀法、氯化钠盐析法、渗析法、超滤法和结晶法等等。
据发明人研究，植物单宁具有以下药理毒理作用：①收敛作用。内服可用于治疗肠胃出血，外用于治疗胃肠道出血，外用于创伤、灼伤的创面，单宁可使表面渗出物中的蛋白质凝固，形成痂膜，保护创面，防止感染；②抗菌、抗病毒作用。单宁能凝固微生物体内的原生质，故有一定的抑菌作用；③驱杀原虫作用。据研究，单宁能够穿透原虫细胞膜，凝固原虫体内的原生质，故对原虫有一定的抑杀作用；另外，植物单宁还具有抑制生物膜形成的作用，有助于抗原虫药直接作用于原虫体内减少耐药；④解毒作用。由于单宁可与重金属盐和生物碱产生不溶性沉淀，有些具有毒性的重金属或生物碱被动物机体吸收后，可用单宁作解毒剂，减少有毒物质被机体吸收；⑤其他作用。药理试验研究表明，有些单宁还具备清除体内的自由基，对神经系统具有抑制作用，可降低血清中脲素氢的含量，具有抗过敏变态反应和抗炎作用等等。⑥毒理作用。大白鼠以25g/kg体重口服煎剂时未见异常。
综上所述，本发明的防治鸡耐药性球虫病的组合物，由异噻唑啉酮类化合物和植物单宁两者组合而成或是由异噻唑啉酮类化合物、乙二胺四乙酸二钠和植物单宁三种物质组合而成。其中，异噻唑啉酮是本发明抗球虫药的主要成分有效成分；乙二胺四乙酸二钠是本发明抗球虫药的次要有效成分；植物单宁具有收敛、保护黏膜、抗过敏变态反应、止血和消炎等作用，是本发明抗球虫药的辅助成分。从药理作用分析可知，一方面异噻唑啉酮类化合物可进入球虫细胞内抑制核酸复制，同时又可破坏其蛋白质结构；另一面乙二胺四乙酸二钠又可与球虫细胞膜的镁、锰、钙、钾等金属离子结合，形成稳定的螯合物，从而改变球虫细胞膜的渗透性。因此，使得球虫不易产生抗药耐药性问题。所以，由异噻唑啉酮类化合物和植物单宁两者相互配伍用于防治鸡球虫病，特别是由异噻唑啉酮类化合物、乙二胺四乙酸二钠和植物单宁三者相互配伍用于防治鸡球虫病，具有显著的叠加和协同增强作用。
本发明的防治鸡耐药性球虫病的组合物具有以下特点：
1、本发明的防治鸡耐药性球虫病的组合物由异噻唑啉酮类化合物和乙二胺四乙酸二钠以及加入适宜制药辅料制成；或是由异噻唑啉酮类化合物和植物单宁以及加入适宜制药辅料制成；或是由异噻唑啉酮类化合物和乙二胺四乙酸二钠以及植物单宁三种物质，不加入辅料制成。其穿透力强，抗球虫作用机理独特。
2、本发明的防治鸡耐药性球虫病的组合物，用于防治鸡球虫病，不会产生耐药性，是抗鸡球虫药生产技术上的一项重要突破。
3、本发明的防治鸡耐药性球虫病的组合物，生产工艺过程虽然简单，易于操作。但是产品的对病原(包括病毒、细菌、霉菌和原虫)抑杀作用范围广泛，除用于防治球虫感染外，本品对病毒、细菌和霉菌以及其原虫感染均有一定的疗效。
4、产品质量稳定，毒副作用小。
5、植物单宁为一种植物提物，极为环保；异噻唑啉酮类化合物在环境中容易降解，不会造成生态环境污染。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
试验一：本发明防治鸡耐药性球虫病的组合物的制备方法和应用
实施例1-10：以生产制备含10％异噻唑啉酮类化合物固态粉散剂为例，具体说明本发明的防治鸡耐药性球虫病的组合物制备方法：
一、确定产品组方。
备注：若以上为液态原料时，则需加入适宜的吸附剂辅料。
二、配料。分别准确称取异噻唑啉酮类化合物100份和植物单宁900份。
三、混合、搅拌和填充包装。
将以上两种原辅料，倒入搅拌机内进行充分搅拌混合均匀，然后填充、装袋、封口、贴上标签即得。
使用方法：用于防治鸡球虫病。其用量是：以主要有效成分异噻唑啉酮计，每kg体重，鸡5mg。用法：混饮或者混饲：即兑水或拌料适量，并搅拌均匀饲喂，连用3-5天。
实施例11-20：以生产制备含20％异噻唑啉酮类化合物固态粉散剂为例，具体说明本发明的防治鸡耐药性球虫病的组合物制备方法：
一、确定产品组方。
备注：若以上为液态原料时，则需加入适宜的吸附剂辅料。
二、配料。分别准确称取异噻唑啉酮类化合物200份和乙二胺四乙酸二钠200份以及加入适宜辅料无水葡萄糖600份。
三、混合、搅拌和填充包装。
将以上两种原辅料，倒入搅拌机内进行充分搅拌混合均匀，然后填充、装袋、封口、贴上标签即得。
使用方法：用于防治鸡球虫病。其用量是：以主要有效成分异噻唑啉酮计，每kg体重，鸡5mg。用法：混饮或者混饲：即兑水或拌料适量，并搅拌均匀饲喂，连用3-5天。
实施例21-30：以生产制备含30％异噻唑啉酮类化合物固态粉散剂为例，具体说明本发明的防治鸡耐药性球虫病的组合物制备方法：
一、确定产品组方。
备注：若以上为液态原料时，则需加入适宜的吸附剂辅料。
二、配料。分别准确称取异噻唑啉酮类化合物200份和乙二胺四乙酸二钠200份以及加入适宜辅料无水葡萄糖600份。
三、混合、搅拌和填充包装。
将以上两种原辅料，倒入搅拌机内进行充分搅拌混合均匀，然后填充、装袋、封口、贴上标签即得。
使用方法：用于防治鸡球虫病。其用量是：以主要有效成分异噻唑啉酮计，每kg体重，鸡5mg。用法：混饮或者混饲：即兑水或拌料适量，并搅拌均匀饲喂，连用3-5天。
实施例31-37：以生产制备含40～90％异噻唑啉酮类化合物固态粉散剂为例，具体说明本发明的防治鸡耐药性球虫病的组合物制备方法：
一、确定产品组方。
备注：若以上为液态原料时，则需加入适宜的吸附剂辅料。
二、配料。根据上述组分分别准确称取相关组分。
三、混合、搅拌和填充包装。
将以上两种原辅料，倒入搅拌机内进行充分搅拌混合均匀，然后填充、装袋、封口、贴上标签即得。
使用方法：用于防治鸡球虫病。其用量是：以主要有效成分异噻唑啉酮计，每kg体重，鸡5mg。用法：混饮或者混饲：即兑水或拌料适量，并搅拌均匀饲喂，连用3-5天。
实施例38：以生产制备含30％异噻唑啉酮类化合物液态制剂为例，具体说明本发明的防治鸡耐药性球虫病的组合物的制备方法：
一、确定产品组方。即异噻唑啉酮类化合物300份、乙二胺四乙酸二钠300份和植物单宁400份。
二、配料。分别准确称取异噻唑啉酮类化合物300kg、乙二胺四乙酸二钠300kg和植物单宁400kg。
三、加工制备工艺。在加工过程中，加入稀释剂、溶剂、乳化剂、助溶剂和防冻剂以及表面活性剂和制药用水等适宜辅助材料，至总体积1000公升为止。然后在一定的温度和压力条件下进行处理、均质、乳化，搅拌，混合均匀，最后填充装瓶、封口、贴上标签即得。
使用方法：用于防治鸡球虫病。其用量是：以主要有效成分异噻唑啉酮计，每kg体重，鸡5mg。用法：混饮即兑水适量，并搅拌均匀饲喂，连用3-5天。
实施例39：以生产制备含50％异噻唑啉酮类化合物固态粉散剂为例，具体说明本发明的防治鸡耐药性球虫病的组合物制备方法：
一、确定产品组方。苯并异噻唑啉酮(bit)500份和辅料500份。
二、配料。分别准确称取苯并异噻唑啉酮(bit)500份和辅料500份。
三、混合、搅拌和填充包装。
将以上两种原辅料，倒入搅拌机内进行充分搅拌混合均匀，然后填充、装袋、封口、贴上标签即得。
使用方法：用于防治鸡球虫病。其用量是：以主要有效成分异噻唑啉酮计，每kg体重，鸡5mg。用法：混饮或者混饲：即兑水或拌料适量，并搅拌均匀饲喂，连用3-5天。
根据以上实施例所制得的本发明抗耐药性球虫组合物，其药理毒理作用研究如下：
(1)急性毒理试验。异噻唑啉酮类化合物毒性因品种而异，大鼠急性经口ld50110-2000mg/kg。兔急性经皮ld50600-2000mg/kg。原液对皮肤和黏膜具有较强的刺激性和致敏性。
(2)其他毒理学资料。
皮肤刺激：对兔子有腐蚀性。
眼睛刺激：对兔子有腐蚀性。
致敏性：豚鼠引起过敏。
致癌性：在小鼠经皮和大鼠经口致癌研究中发现均不致癌。
致癌性：本品不是生殖有害品。动物试验中未见畸变的影响。
诱变性：为非诱导有机体突变的物质。
(3)家禽急性毒理试验。经发明人研究：如苯并异噻唑啉酮(bit)，鸡半致死剂量(ld50)，鸡500mg/kg体重。
试验二：本发明药物在鸡胚中对柔嫩艾美耳球虫的作用效力研究
一、目的和内容研究和测定异噻唑啉酮类化合物、乙二胺四乙酸二钠和植物单宁三种物质，单独或者相互之间配伍组合，在鸡胚中对柔嫩艾美耳球虫的作用效果。以供产品组合设计和优化提供依据。
二、材料和方法
1、卵囊。从养鸡场发病鸡分离提纯的柔嫩艾美耳属球虫株，试验株通过鸡胚预先复壮繁殖后，保存在4℃冰箱内。
2、子孢子混悬液的制备。取以上柔嫩艾美耳属球虫卵囊，按技术要求，制备子孢子混悬液，用血球计数板计数子孢子数，使用时根据所需接种剂量用林格氏液进行稀释。
3、受精种鸡蛋。由种鸡场提供，根据试验药物不同浓度和组合设组，每组20枚，并另设不感染不给药和感染不给药对照2组。在种蛋孵化到10日龄即注入药物，在接种药物24小时后，试验组每胚尿囊腔内接种0.1ml含1×104子孢子混悬液，针孔蜡封后继续置于孵化箱内孵育，接种后每天检查鸡胚一次，观察记录鸡胚死亡情况。4天内死亡的鸡胚则视为操作污染或者药物中毒引起；5-6天死亡并伴有出血症状的被认为球虫致死。
4、试验方案。本试验分别按单独一种物质即异噻唑啉酮类化合物、edta-2na和植物单宁设3组；以及二种物质组合即异噻唑啉酮类化合物+植物单宁、edta-2na+异噻唑啉酮类化合物设2组；三种物质组合物即异噻唑啉酮类化合物+edta-2na+植物单宁设1组，每组设3个给药剂量组。此外，还设不感染不给药健康阴性对照组和感染不给药阳性对照组。给药方式均以每枚鸡胚的剂量用注射用灭菌生理盐水稀释，每枚鸡胚注入0.2ml。具体设计方案如表1所示。
表1：本发明抗球虫药物效力的测定和优化试验设计方案
5、抗球虫效力判定。在感染后第7天，由鸡胚收集卵囊计数，以卵囊减少率作为抗球虫效力的判定标准。
三、试验结果。如以下表2所示。
表2：本发明不同组合在鸡胚中对柔嫩艾美耳属球虫的作用效果
由表2体外试验结果，初步分析可知：
(1)以异噻唑啉酮类化合物、乙二胺四乙酸二钠和植物单宁三种物质分别抑杀鸡胚中的球虫，其卵囊平均减少率分别是86.7％、34.47％和5.72％。三者以异噻唑啉酮类化合物效果最佳，其次是乙二胺四乙酸二钠。植物单宁抑杀球虫效果最差，但在组合物中药理作用是保护肠道粘膜、止血和消除异噻唑啉酮类化合物容易导致粘膜过敏变态反应，是本发明抗耐药球虫必不可少的必要组分之一。
(2)以异噻唑啉酮和edta与异噻唑啉酮和植物单宁二组合，分别抑杀鸡胚中的球虫，其卵囊平均减少率分别是94.74％和83.47％。前者组合对比后者组合提高11.27％。
(3)以异噻唑啉酮类化合物、乙二胺四乙酸二钠和植物单宁三种物质组合在鸡胚中抑杀球虫卵囊平均减少率为99.67％，效果最佳。
试验三：本发明药物对鸡胚中柔嫩艾美耳球虫卵囊发育的影响研究
一、目的和内容研究本发明药物不同剂量对鸡胚中柔嫩艾美耳球虫卵囊发育的影响，以供确定本发明药物使用剂量提供依据。
二、材料和方法
1、试验药物本发明的防治鸡耐药性球虫病的组合物，按实施例3制备方法制备。
2、试验材料及设备选择重量均为50g种蛋80枚，购自广东惠州某种鸡场。柔嫩艾美耳球虫卵囊自行采集提纯并保存于4℃条件下，备用。小型孵化机1台。
3、试验方法试验分成8组，每组鸡胚10枚。其中接种卵囊的6组，将分别注射0.1mg、0.2mg、0.4mg、0.6mg、0.8mg、1mg药物(以有效成分异噻唑啉酮类化合物计，以生理盐水稀释成0.2ml)；另两组：1组为接种球虫卵囊组对照组，1组为只注射药物对照组。方法：选择孵化发育正常的鸡胚，在第10日龄于鸡胚尿囊腔内接种球虫卵囊1万个，接种后第2天其中6组分别注入不同剂量的本发明药物0.2ml。随后，每日观察鸡胚死亡情况，并于接种后第8天取尿囊液中沉渣物进行卵囊检查。
三、试验结果。如以下表3所示。
表3：本发明药物对鸡胚中柔嫩艾美耳球虫卵囊发育的影响
试验结果表明：
(1)在药物对照鸡胚中，只有注射药物的10枚鸡胚，发育正常直至雏鸡出壳，说明对鸡胚未见有毒性反应。
(2)只接种卵囊的对照组鸡胚，在接种后第8天，从尿囊液中检出大量卵囊，表明柔嫩艾美耳球虫在鸡胚中，经过无性生殖和有性生殖阶段，再生成卵囊而完成其生活史。
(3)既接种卵囊又分别注射各剂量药物组，其结果表明，从剂量为0.1mg到1mg组全部未检到卵囊，说明药物对卵囊有抑杀作用，其中以剂量为0.4mg和0.6mg组为最佳，同时对配子体也有抑杀作用。若以碘检测尿囊液时，则呈紫色反应，以此推断可能是球虫裂殖体、裂殖子等表膜被破坏，虫体内支链淀粉颗粒被释放出来与碘发生反应。
据此推测，本发明产品的抗球虫作用机理可能是通过破坏虫体结构的完整性，抑制虫体物质代谢及能量代谢等生理机能，从而杀死球虫或者抑制球虫的生长和繁殖。
试验四：本发明药物与不同剂量抗球虫病的治疗试验效果研究
一、目的和内容研究本发明药物各种组合与不同剂量在实际临床应用中的抗球虫病的治疗试验效果。
二、材料和方法
1、接种虫株：柔嫩艾美耳球虫株来源于广东某养鸡场分离株。
2、实验动物：刚孵出的肉用公雏鸡，饲养于严格消毒的鸡舍中，分组笼养，分为11组，每组10只，饲料和饮水严格消毒，实验用药物均混入饮水投喂给雏鸡。
3、实验药物及给药方式：本发明的防治鸡耐药性球虫病的各种组合物(按实施例制备)及球快灵、地克珠利和磺胺氯吡嗪钠三种药物均混入饮水中饲喂。
4、接毒方法：每只鸡口服5万柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊。采用按每kg重量用量的给药方法，即本发明药物按每kg体重是10mg、8mg、6mg、4mg、2mg和1mg6种剂量混入饮水中。对照药物按说明书推荐用量给药，即地克珠利1m/l饮水、球快灵2.5g/l饮水和磺胺氯吡嗪钠lg/l饮水。地克珠利在感染前2天给药，其余药物感染后第三天给药。
5、试验分组：本发明药物设三种组合处理即异噻唑啉酮类化合物与植物单宁、异噻唑啉酮类化合物与乙二胺四乙酸二钠、异噻唑啉酮类化合物与乙二胺四乙酸二钠及植物单宁，每个处理按鸡胚用量10倍设剂量为10mg/kgw、8mg/kgw、6mg/kgw、4mg/kgw、2mg/kgw和1mg/kgw各1组；对比抗球虫药物球快灵、地克珠利和磺胺氯吡嗪钠各1组，另设感染不给药和不感染不给药各1组。
6、抗药性评价标准：(1)抗球虫指数aci大于等于180，判为敏感(有效药物)；(2)aci为160至179，判为部分抗药(部分有效药物)；(3)aci小于160，判为抗药(无效药物)。
7、检测指标：
(1)aci＝(相对增重率+成活率)-(病变分值+卵囊值)
其中，相对增重率(％)＝感染投药组的平均增重/不感染不投药组的平均增重×100；
(2)成活率(％)＝组内存活鸡数/组内总鸡数×100；
(3)病变分值＝平均病变记分×10。
表4：病变记分的评价标准
(4)卵囊比数和卵囊值：鸡只剖杀后，盲肠匀浆，吸取卵囊液，用血细胞计数板统计卵囊数，计算卵囊比数。
卵囊比数(％)＝健康组或实验组卵囊数/感染不给药组卵囊数×％
表5：卵囊比数和卵囊值的对应值表
三、试验结果。见表6和表7。
表6：本发明药物的aci结果
备注：①inc为阳性对照组及unc为阴性对照组。
②组合ⅰ为异噻唑啉酮类化合物+植物单宁。组合ⅱ为异噻唑啉酮类化合物+乙二胺四乙酸二钠。组合ⅲ为异噻唑啉酮类化合物+乙二胺四乙酸二钠+植物单宁。
表7：本发明药物和对照组药物的aci数值对比
备注：aci数值大于180，说明药物有效；aci数值在160-180之间，说明药物部分有效；aci数值小于160，说明药物无效。
由表6和表7可知，组合ⅰ、组合ⅱ和组合ⅲ三种组合物在剂量4-8mg/kgw范围之内均有显著效果，并且抗球虫aci数值与磺胺氯吡嗪钠、地克珠利和球快灵三种抗球虫药对比差异不显著。
试验五：本发明药物防治鸡球虫耐药虫株的试验研究
一、目的和内容用于防治球虫耐药虫株，验证本发明药物防治鸡球虫耐药虫株的实际效果。
二、材料与方法
1、实验动物。将1日龄雏鸡饲养于无球虫环境中至12日龄开始分组，饲养过程中每天更换垫料，保持环境清洁，实验动物自由采食饮水。
2、试验虫株。从广东粤东某鸡场分离野外虫株，经鉴定为柔嫩艾美耳球虫株即粤东株，保存在本公司实验室。
3、试验药品。本发明药物按实施例6方法制备；其他抗球虫药马度米星铵、二硝托胺、地克珠利、磺胺氯吡嗪、氯羟吡啶均为本公司按兽药典规范生产的合格产品。
4、球虫的耐药性检测。
(1)试验分组及给药。12日龄雏鸡平均体质量分为7组，每组14只，分别为马度米星铵、二硝托胺、地克珠利、磺胺氯吡嗪、氯羟吡啶、阳性(inc)及阴性(unc)对照组。除对照组外，各给药组均于感染前24h拌料给药。除阴性对照组外，各感染组于14日龄经口感染各地孢子化卵囊5万/羽。感染后每天观察鸡的精神状况及采食情况，感染后第8天称重后剖杀，取盲肠观察并进行病变记分和盲肠内容物的卵囊计数。试验过程中避免交叉污染,3株球虫的耐药性检测分别完成。
(2)耐药性判定
抗球虫指数(aci)：根据以下方法计算：
aci＝(相对增重率+存活率)-(病变值+卵囊值)。其中，抗球虫效力标准为：aci>180，高效；160-180，中效；120-160，低效；<120，无效。
增重率％＝(末均重一初均重)/初均重×100；
相对增重率％＝试验组增重率/阴性对照组增重率×100；
存活率％＝各试验组存活鸡只数/试验前各组鸡只数×100；
病变值＝各组平均病变记分×10。见表8所示。
表8：病变记分的评价标准
卵囊值：根据以下表9所列对应数据换算。
表9：柔嫩艾美耳球虫卵囊值对应表
5、本发明药物对耐药虫株疗效试验。
试验分组及给药，将12日龄的雏鸡按平均体质量分为4组，每组18只，分别为本发明药物1组为感染拌料给药、2组为感染饮水给药、3组为感染不给药组，另设阴性对照组。各给药组均于感染前24h拌料或饮水给药,14日龄经口感染各地孢子化卵囊5万/羽。
6、数据分析。试验数据用x士s表示，采用数理统计软件对试验结果进行是著性分析，比较组间差异性。
三、试验结果
1、柔嫩艾美耳球虫株的耐药性
表10：柔嫩艾美耳球虫株的耐药性检测结果
备注：inc为阳性对照组及unc为阴性对照组。
由表10可见，给药组aci值均低于160，为耐药阳性。其中二硝托胺组aci值为131，为低效抗球虫药，其余各组aci值均低于120，完全耐药。
2、aci判定结果
表11：本发明药物抗球虫指数(aci)
注：1组为感染拌料给药；2组为感染饮水给药：3组为感染不给药组与阴性对照组均为自由采食和饮水。
由表11可见，本发明的防治鸡耐药性球虫病的组合物试验1、2组中，aci值为197和182，大于180，说明按实施例5方法制备的组合物对5种球虫药耐药虫株显示高效。所以，本发明药物用于防治鸡耐药性球虫病疗效确切，效果明显。
综上所述，本发明产品与其他抗球虫药作用机理不同，该产品抗球虫效果好，连续用药3-5天即有效，尤其适合用于耐药虫株，同时具有促进生长作用，提高饲料转化率，可在放养鸡户以及集约化规模化养鸡场大力推广应用。
试验六：本发明药物的临床应用案例
案例1：鸡新城疫和球虫病混合感染症
【病情简况】广东清远某养鸡户共饲养40余日龄清远麻鸡7000多羽。因考虑采取山地放养模式，远离村庄，故存在侥幸心理，这批鸡没有做任何疫苗免疫，地面放养卫生条件也较差。2019年10月24日，鸡群突然发病，一夜之间就死亡170余羽；25日又死亡120余羽，次日又死亡90余羽。发病3天内，先后共死亡380余羽，发病率竟达60％，病死率为36％以上。
【主要病状】鸡群突然发病，病鸡精神沉郁，羽毛逆立，蹲在地上不动，排白色水样粪或绿色稀粪，约有1/5病鸡排带血粪。
【剖检病变】先后共剖检病危鸡和病死鸡共20羽，病变基本一致，归纳主要是:
1、病死鸡的鸡冠呈紫黑色，肛门周羽毛粘有黄绿色的鸡粪，并散发腥臭味。
2、消化道。病死鸡的腺胃肿胀，乳头明显有出血点，在肌胃、腺胃交界处有一条明显出血带，十二指肠、盲肠扁桃体和直肠均有出血性病变，盲肠内充满血液。
3、实质器官。病死鸡的肝脏肿大，散布数量不等的出血点；脾脏肿大，呈大理石样。心包、心肌、冠状沟脂肪、心尖等处，有数量不等的点状出血。
【诊断】
1、涂片镜检。无菌操作，采取病死鸡的小肠黏膜刮取物涂片，加1-2滴生理盐水调匀，加盖玻片后，置显微镜下观察发现球虫裂殖体和球虫卵囊。
2、病毒分离。无菌操作，采取病死鸡的脑、肺、脾和气管，研磨后制成1:10悬浮液，加青霉素、链霉素处理后，接种于10胚龄鸡胚尿囊腔，每胚0.2毫升，置37℃温箱孵化120小时，弃去接种后24小时内死亡胚3枚，收集剩余7枚胚的尿囊液，测定其血凝反应(ha)效价在(1:64)-(1:256)。死胚的全身充血，在头、胸和背等部位均散布数量不等的出血点。
3、采用实时荧光rt-pcr方法检测新城疫病毒(ndv)，结果判定ndv呈现阳性。表明鸡群存在新城疫。
根据现场调查、病鸡临床表现和病死鸡剖检病变，以及上述实验室检验结果，该养鸡户的鸡病确诊为鸡新城疫和球虫病混合感染症。
【防治措施】
1、使用按实施例6制备的组合物，按每5mg/kg体重，进行群防群治拌料饲喂，连用3日，以快速控制鸡群的球虫病，同时对鸡新城疫也有防治作用，减少病鸡死亡。
2、配合疗法。给鸡群饮服补液盐、葡萄糖和维生素c，以缓解脱水，增强抗病力。
【效果】该养鸡场发生疫情并初步定性后，立即采取上述综合性应急防控措施，效果明显，不到3日，病鸡群逐渐康复，没再发生死亡，不到1周，鸡场生产恢复正常。治疗期间，累计死亡数量不到100羽，治愈率98.57％。
案例2：麻黄鸡大肠杆菌病和球虫病混合感染症
【病情简况】广西南宁某养鸡场饲养麻黄肉鸡存栏量为100万羽。其中，一幢12000羽饲养至20日龄时，即出现了疫情，而且比较严重，日死亡数高达120多羽。
【主要病状】病鸡精神沉郁，采食量下降，鸡冠苍白，羽毛松乱，闭目缩颈，排紫黑色粪；病鸡后期食欲废绝而死。
【剖检病变】先后共剖检病死鸡和病危鸡20羽，病变基本一致，今归纳如下：
(1)肠道：病死鸡的十二指肠散布脓性、出血性炎症，盲肠肿胀，充满暗红色血液；肠系膜附有干酪样渗出物。
(2)其他：病死鸡的胸肌和腿肌均苍白，无血色；胸腔气囊混浊；心包膜附有纤维素性渗出。
【诊断】
1、触片镜检。无菌操作，采取病死鸡的肝脏，革兰染色，镜检，发现革兰阴性、两端钝圆、中等大小的杆菌。
2、压片镜检。无菌操作，采取病鸡新鲜鸡粪10克，用饱和盐水稀释后，用滤网滤去粪渣，取悬浮液压片镜检，发现大量卵圆形球虫卵囊。
3、细菌分离。无菌操作，采取病死鸡的肝脏，分别接种于以下两种培养基，经37℃培养24小时后观察发现。(1)在普通营养琼脂培养基上：长成圆形、凸起、光滑、湿润边缘整齐、灰白色的菌落；(2)在麦康凯琼脂培养基上：长成直径2毫米左右、中央凹的红色菌落。无菌操作，挑取上述菌落涂片，革兰染色，镜检，发现分离菌的形态与病死鸡肝脏直接触片相同。
4、生化反应。结果均符合大肠杆菌生化反应的主要特征。
根据现场调查、病鸡临床表现和病死鸡剖检病变，以及上述实验室检查结果，该场麻黄鸡可确诊为大肠杆菌病和球虫病混合感染症。
【防治措施】
1、使用按实施例18制备的组合物，按每5mg/kg体重，进行群防群治拌料饲喂，连用5日，以快速控制鸡群的球虫病，同时对鸡新城疫也有防治作用，减少病鸡死亡。
2、给鸡群饮服补液盐和维生素c，以缓解脱水，增强抗病力。
【效果】该幢麻黄鸡发生病后，据初步临床诊断，立即采取上述综合性应急防控措施，效果非常明显，第二天鸡群就没再发生死亡。不到5天，病鸡群逐渐康复，不到1周，整幢就恢复正常。治愈率几乎达100％。
案例3：禽组织滴虫病和鸡球虫病混合感染症
【病情简况】四川某养鸡户于2017年6月份从外地购进10日龄罗曼鸡6000羽，饲养在用木板隔开的简易小间内，实行地面育雏。该批雏鸡已进行过马立克病疫苗、传染性法氏囊病疫苗和新城疫疫苗免疫。为了制细菌病，在饲料中加入了适量的土霉素。饲养至30日龄时，鸡群出现发病疫情，先后发病200余羽，并陆续死亡70多羽。
【主要病状】病鸡精神不振，食欲减退甚至废绝，饮水增加，不爱运动，缩颈呆立闭眼嗜眠，两翅下垂，羽毛无光泽，身体蜷缩，怕冷。常有下痢，排淡黄色稀粪；有的稀粪带血。病鸡迅速消瘦，龙骨隆起。病后期，部分病鸡头部发紫。最后，多死于衰竭。
【剖检病变】先后共剖检18羽病死鸡，病变基本一致，病变主要集中在肝脏和盲肠。归纳如下：
(1)肝脏：病死鸡的肝脏肿大，表面散布数量不等的圆形或不规则的溃疡坏死灶，大小如绿豆至豌豆大，坏死灶中间稍凹陷，边缘整齐或呈锯齿状而隆起如火山状，隆起部分呈灰白色或黄白色；严重的病灶融合成较大的坏死区。
(2)盲肠：病死鸡的盲肠病变发生于两侧，少数发生于一侧。盲肠肿大，指压盲肠坚实而有弹性，盲肠内充满一种干燥、坚硬的干酪样栓塞，表面呈灰白色；盲肠黏膜发炎、增厚，刮掉内容物，肠钻膜的多处出血、溃疡。
【诊断】
(1)涂片镜检。无菌操作，采取病死鸡的盲肠内容物直接涂片镜检，发现少量球虫卵囊和大量的卵圆形虫体。
(2)悬滴镜检。无菌操作，采取刚死病鸡盲肠内容物，用温的生理盐水稀释做成悬滴标本，于室温(25-30℃)在400倍显微镜下观察，发现多量圆形或卵圆形黑头组织滴虫体，呈急速旋转或钟摆运动。
根据现场调查、病鸡临床表现和病死鸡剖检病变，以及上述实验室检验结果，罗曼鸡群的病性确诊为球虫病和禽组织滴虫病混合感染症。
【防治措施】首先，在饲料中混入按实施例37制备的组合物，按5mg/kg体重计，并配合使用适量复合维生素b，连续饲喂5日。其次，对整个鸡群进行消毒，饲槽和饮水器经过热水或热碱水(2％)洗涤消毒。再次，及时清除鸡舍内的粪便，一定要保持地面的干燥。
【效果】罗曼鸡群发生疫情后，立即采取上述防控措施，效果明显。用药3-4日后，疫情基本被控制，鸡群整体状况良好，不再出现拉稀、精神不振和食欲减退等临床症状；不到1周，病鸡群不再出现死鸡，并逐渐康复，假定健康鸡群不再出现病鸡，生产恢复了正常。治愈率高达达99.7％。
案例4：鸡球虫病和霉菌病混合感染症
【病情简况】南方每年4-9月份气候高温潮湿，适宜于各种霉菌和球虫大量生长繁殖；当鸡群又处于卫生不良的环境条件下，最易发生霉菌和球虫病混合感染，常造成高死亡率，雏鸡生长受阻。广东河源某种鸡场，于2018年5月20日从外地购麻黄鸡苗4200羽。饲养至17日龄时，雏鸡发生以拉稀、下痢和血粪等为主的鸡病，发病率达30％，死亡率为17％。
【主要病状】大多数病雏精神沉郁，体温基本正常，食欲不振，饮水增加，绒毛松乱，两翼下垂，不愿走动，嗜眠，喜挤在一起。少数病雏发出阵发性鸣叫。多数病雏腹泻，下痢，排白色稀粪，有的粪中带血。病程多为3-5日，少数为5-7日。最后，病雏呼吸困难，抽搐或昏迷死亡。少数最急性型前晚或上午雏鸡还正常吃食，但在次晨或下午然发病，口吐鲜血，迅速倒毙。有些变为慢性型病雏症状较轻，并以腹泻为主，多能在耐过而获得免疫，但生长发育变慢。
【剖检病变】病死雏的心脏、肝脏、肾脏和腺胃黏膜散布较大出血点，有的胸肌也有出血点或间有几点新鲜出血小点和结节。病死雏的肝脏肿大，表面散布黄白色的坏死灶、结节；肠道浆膜上散布小结节，小肠肿胀，黏膜出血或呈弥漫性出血，有的间有灰白色小斑点；肾脏肿大，贫血，盲肠稍肿，内存留干酪样物，并混有小量血液，泄殖腔积满稀粪。
【诊断】
1、霉菌病。无菌操作，随机抽取病鸡群所食的混合料，定量接种在3个萨布罗琼脂平板上，置37℃培养72小时，观察记录计算结果，平均每克饲料含黄曲霉孢子5000个以上。据资料，若每克饲料含产毒黄曲霉孢子100个以上，即可引起雏禽发病。
2、球虫病。无菌操作，采取病死雏的损害小肠段的内容物和黏膜，高倍镜检查，检样发现大量小肠球虫，每个视野5个以上。
根据流行特点，鸡苗从外地购进，鸡舍卫生较差，气候潮湿，饲料发霉。以及病雏以下痢和肠道粘膜出血为主要临床特征和镜检；可以确诊为鸡感染球虫病和霉菌及霉毒素中毒症。
【防治措施】首先，给雏鸡群创造一个良好的饲养管理环境，搞好鸡舍卫生，严格隔离病雏，用10％石灰水消毒污染的地面，更换新鲜饲料，每天加喂一次多维和葡萄糖水解毒。其次，使用按实施例38制备的组合物，按每5mg/kg体重，进行群防群治，混饮，连用3日，以快速控制鸡群的球虫病，同时对鸡霉菌也有防治作用，减少病鸡死亡。
【效果】雏鸡群发生上述混合感染后，即按上述综合性防控措施，不到5日，病情基本得到控制，症状明显好转，病鸡不再死亡，假定健康鸡群不再发现病鸡；至第7日，鸡群的生产就恢复了正常。治愈率达98％以上。
综上所述，仅为本发明的较佳实例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，利用以所揭示的技术内容而做出的些许变更、修饰与演变的等同变化，均视为本发明的等效实例；同时，凡根据本发明的实质技术对以上实施例所作出的任何等同变化的变更、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
本发明中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
本发明中的各种优化技术方案，除非另外说明，否则各种优化的技术方案之间可以相互进行结合。
除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
说明书以及实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
本发明中使用各种原料、试剂、组分，除非另外说明，均为本领域内常用的相应原材料。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。