负载生物血液制品的静电纺丝制备方法与流程

[0001]
本发明涉及生物复合材料领域，尤其涉及一种负载生物血液制品的静电纺丝制备方法。


背景技术：

[0002]
静电纺丝技术是一种制备纳米至微米级纤维的十分有效的方法，因为其设备简易，费用低廉，制备出的材料具有较高的比表面积，可控纤维的直径及孔隙率，以及可制备出接近天然细胞外基质尺度范围的纤维等优点，被广泛用于组织工程支架等的制备。
[0003]
静电纺丝制备出的材料多是絮状或网状纤维聚集体，并且通过一定的方式还能够使其内部纤维结构取向，因此静电纺丝技术制备纤维微结构成为一种生物材料设计方向。
[0004]
然而，多数静电纺丝产品都是一种聚合物高分子材料，缺乏生物活性而无法适用于例如引导组织再生等方面。因此，需要一种新的设计，以最大程度的发挥静电纺丝技术在生物医学方面的应用。


技术实现要素：

[0005]
本发明解决的问题是提供一种负载生物血液制品的静电纺丝制备方法，以制备具有生物活性的纳米纤维纺丝材料。
[0006]
为解决上述问题，本发明提供了一种负载生物血液制品的静电纺丝制备方法，包括：将血液进行离心；对离心后的所述血液进行静置；对静置后的血液进行分离，以分离出血液制品；将所述血液制品作为一部分纺丝成分，混合至静电纺丝组分中，进行静电纺丝，得到静电纺丝产品。
[0007]
可选的，在所述静电纺丝前，对所述血液制品进行冷冻处理，在所述冷冻处理后，再将所述冷冻处理后的所述血液制品作为一部分纺丝成分，混合至所述静电纺丝组分中，进行所述静电纺丝。
[0008]
可选的，所述冷冻处理的温度为零下80摄氏度的冻干处理。
[0009]
可选的，所述血液制品为富血小板血浆、富血小板纤维蛋白或浓缩生长因子。
[0010]
可选的，所述血液制品为富血小板纤维蛋白凝胶；所述方法还包括：将所述富血小板纤维蛋白凝胶加入到纺丝基础溶液里；对加入到所述纺丝基础溶液里的所述富血小板纤维蛋白凝胶进行溶解；在所述溶解后进行搅拌，制得纺丝混合溶液；利用所述纺丝混合溶液作为所述静电纺丝组分进行所述静电纺丝。
[0011]
可选的，加入到所述纺丝基础溶液里的所述富血小板纤维蛋白凝胶的质量为所述纺丝基础溶液质量的0.05％以上。
[0012]
可选的，所述纺丝基础溶液的成分包括聚乙烯醇和海藻酸钠，所述聚乙烯醇和所述海藻酸钠的比例为9:1至5:5。
[0013]
可选的，所述搅拌的时间为1h以上，所述搅拌的搅拌转速为600rpm/min。
[0014]
可选的，采用超声波进行所述溶解。
[0015]
可选的，对所述静电纺丝产品进行真空冷冻干燥处理。
[0016]
本发明技术方案的其中一个方面中，通过制备血液制品，再将血液制品增加至静电纺丝的组分中，制备出具有生物活性的纳米复合纤维材料(复合纳米纤维)，所述纳米复合纤维材料可以运用于各种生物修复场合。
[0017]
进一步，本发明技术方案对血液制品进行冷冻处理，在冷冻处理之后，再加入到静电纺丝的混合溶液中，进行静电纺丝，相应的纺丝产品生物活性提高。
附图说明
[0018]
图1是本发明负载生物血液制品的静电纺丝制备方法的实验原理示意图；
[0019]
图2是利用本发明制备的冻干血液制品进行细胞增殖实验测定得到的结果数据图；
[0020]
图3是利用本发明制备的冻干血液制品对成骨相关基因骨桥蛋白和骨钙素表达的影响数据图；
[0021]
图4是利用a组-空白的细胞增殖实验，b组-不添加负载血液制品的静电纺丝产品进行细胞增殖实验，以及c组-添加负载血液制品的静电纺丝产品进行细胞增殖实验，测定得到的结果数据图；
[0022]
图5是图4对应实验的a组与成骨细胞共培养后进行碱性磷酸酶染色显示钙化结节，实验结果的扫描电镜照片图；
[0023]
图6是图4对应实验的b组与成骨细胞共培养后进行碱性磷酸酶染色显示钙化结节，实验结果的扫描电镜照片图；
[0024]
图7是图4对应实验的c组与成骨细胞共培养后进行碱性磷酸酶染色显示钙化结节，实验结果的扫描电镜照片图。
具体实施方式
[0025]
静电纺丝是高分子流体非织造的特殊形式，聚合物微小射流在高压电场下运行一定距离后固化成纤维或微球。静电纺丝以其制造装置简单、纺丝成本低廉、可纺物质种类繁多、工艺可控等优点，利用本发明的方法，可以利用静电纺丝技术，有效制备纳米纤维材料及载活性物质。通过静电纺丝技术制备负载血液制品的纳米纤维的相应结构，是本发明解决现有不足的内容。
[0026]
为更加清楚的表示，下面结合附图对本发明做详细的说明。
[0027]
本发明实施例，提供一种具体的一种实验过程，即负载生物血液制品的静电纺丝制备方法，包括：
[0028]
将血液进行离心，离心过程包括取血液400g，在室温离心10分钟；
[0029]
对离心后的所述血液进行静置，静置可以为5分钟；
[0030]
对静置后的血液进行分离，以分离出血液制品；静置后的全血分为三层，中间层为富血小板纤维蛋白凝胶层，从而得到富血小板纤维蛋白凝胶，即完成了对富血小板纤维凝胶层的制备；其中，将中间富血小板纤维蛋白凝胶层取出，将底部的血凝块切除，保留淡黄色凝胶状物质，即得到富血小板纤维蛋白凝胶；
[0031]
将所述血液制品作为一部分纺丝成分，混合至静电纺丝组分中，进行静电纺丝，得
到静电纺丝产品。
[0032]
本实施例中，在得到富血小板纤维蛋白凝胶之后，且在将所述血液制品作为一部分纺丝成分，混合至静电纺丝组分中，进行静电纺丝之前，先对所述血液制品进行冷冻处理。在所述冷冻处理后，再将所述冷冻处理后的所述血液制品作为一部分纺丝成分，混合至所述静电纺丝组分中，进行所述静电纺丝。
[0033]
本实施例中，所述冷冻处理采用的温度为-80℃的冻干处理。冻干处理的时间可以为数个小时至数天等。具体可以是将前述制备的富血小板纤维蛋白凝胶，放入冻存管中，-80℃的冰箱保存。冷冻处理使得富血小板纤维蛋白凝胶后续的生物活性表现更佳，参考说明书后续内容。
[0034]
其它实施例中，所述血液制品也可以为富血小板血浆或浓缩生长因子。例如，对于富血小板血浆，它的制备过程可以为：抽血后，进行离心，离心方式可以是定速离心，并且可以多次进行，它含有生长因子、无纤维蛋白等成分。又例如，对于浓缩生长因子，它的制备过程可以为：抽血后进行低温恒温变速离心，得到高浓度浓缩生长因子的血纤蛋白，具体成分包括生长因子和纤维蛋白等。得到这些血液制品后，后续可以采用与前面相似的步骤，进行冷冻处理，并且，这些血液制品可以用于本实施例后续内容的静电纺丝。
[0035]
所述方法在进行静电纺丝的过程还包括：
[0036]
将经过冷冻处理后的所述富血小板纤维蛋白凝胶加入到纺丝基础溶液里；
[0037]
对加入到所述纺丝基础溶液里的所述富血小板纤维蛋白凝胶进行溶解；
[0038]
在所述溶解后进行搅拌，制得纺丝混合溶液；
[0039]
利用所述纺丝混合溶液作为所述静电纺丝组分进行所述静电纺丝。
[0040]
本实施例中，所述纺丝基础溶液的成分包括聚乙烯醇和海藻酸钠，所述聚乙烯醇和所述海藻酸钠的比例为9:1至5:5。具体的，本实施例将9g的聚乙烯醇(pva)和1g的海藻酸钠(sa)，加入90g去离子水中，可以采用600rpm/min的转速，均匀搅拌8h，从而配置成10％的聚乙烯醇和海藻酸钠的纺丝溶液。
[0041]
其它实施例中，聚乙烯醇和海藻酸钠的比例，以及去离子水的比例，都是可以变化的。不同比例纺出来的丝有不同的特性。随着聚乙烯醇含量的增加，聚乙烯醇和海藻酸钠共混溶液的粘度、表面张力、电导率降低和可存放性提高，而纤维直径随着聚乙烯醇含量的增加而增大。综合考虑，本实施例中两者比例为9:1。但是，本发明其它实施例中，两者比例可以在9:1-5:5，都是可以用于本发明的静电纺丝的。
[0042]
其它实施例中，聚乙烯醇(pva)和1g的海藻酸钠(sa)纺丝溶液也可以用聚己内酯(pcl)等替换。
[0043]
本发明中，加入到所述纺丝基础溶液里的所述富血小板纤维蛋白凝胶的质量，为所述纺丝基础溶液质量的0.05％以上。并且，加入的所述富血小板纤维蛋白凝胶，是经过前述冷冻处理(冻干处理)的。
[0044]
本实施例实验中，根据前面的纺丝基础溶液的质量，加入的血液制品(富血小板纤维蛋白凝胶)的质量是50mg(为所述纺丝基础溶液质量的0.05％)。其它实施例中，理论上，只要能够溶解在溶剂里的富血小板纤维蛋白凝胶质量，都可以进行加入。
[0045]
本实施例中，采用超声波振动进行所述溶解，即将血液制品(富血小板纤维蛋白凝胶)溶解在所述纺丝基础溶液中。并且本实施例中，采用一个小时的超声波振动作用，以实
现良好的溶解。超声波振动的目的是促进富血小板纤维蛋白凝胶溶解在相应溶剂里。原理就是利用超声波，通过物理方法将富血小板纤维蛋白凝胶打散，使富血小板纤维蛋白凝胶的表面积，呈几何倍数增大。此外，这个过程还可以达到去除气泡的作用。超声波的进行时间，也是以它能促进溶解为目的而定，通常时间并不限制，根据实验的用量和状况，可以采取不同的时间。
[0046]
本实施例在上述超声波振动进行所述溶解之后，还在所述溶解后进行搅拌，制得纺丝混合溶液。本实施例此步骤的搅拌，目的是为了使溶解后的溶液更加均匀，成为通够用于良好静电纺丝的纺丝混合溶液。其中，搅拌时间可以为1h以上。例如，在室温下搅拌4h，可以以600rpm/min的速度搅拌。这些搅拌时间，是因为，前述聚乙烯醇和海藻酸钠混合液作为纺丝基础溶液，它是水凝胶质地的，在血液制品(富血小板纤维蛋白凝胶)溶解在所述纺丝基础溶液中之后，只有充分搅拌混合后，溶质才能均匀分散在水凝胶中，所以需要相对较长的一定搅拌时间，以充分混匀。
[0047]
在静电纺丝过程中，可以将配置好的最终纺丝液(纺丝混合溶液)，装入带有21号针头(针头型号可以根据需要改变)的注射器中，然后，可以采用以铝箔纸覆盖的接收装置(如接收盘)进行接收。
[0048]
本实施例中，可以利用实验室自组装的静电纺丝装置，实现相应制备。所述静电纺丝装置设置高压电源电压为20kv，设置微量注射泵的注射速度为0.1ml/h，并调整好针头与接收盘的距离，制备由前面富血小板纤维蛋白、聚乙烯醇和海藻酸钠形成的纳米纤维丝(膜)。
[0049]
其它实施例中，静电纺丝的电压可以在1-30kv，甚至可以在50kv。
[0050]
上述过程中，注射速度和接受距离，影响纺成的纤维丝(膜)的性质，接收距离太远，可能纺不成丝(膜)。同时，接受距离的要求又和电压有关系。另外，注射速度太快，可能纺的丝会堆积在一起，无法实现良好收集。所以，注射速度、电压和接受距离三个参数中，任何一个参数变化，其他参数也会跟着变化。
[0051]
对所述静电纺丝产品，可以进行真空冷冻干燥处理，具体可以是将产品置于真空冷冻干燥机内干燥24h，存储备用。
[0052]
对所述静电纺丝产品，可以进行相应的测定，即可以对富血小板纤维蛋白、聚乙烯醇和海藻酸钠形成的纳米纤维丝进行直径测定等性能测定。
[0053]
上述制备过程，请结合参考图1，实验室自制的静电纺丝装置，装置可以包括搅拌容器10、搅拌容器20、注射泵(未示出)、注射器30、电动搅拌器(未示出)、接收盘40和高压直流电源(未示出)等部件组成。注射泵通过塑料软管与注射器30连接(未示出)，并可以按照设置的速率(注射速度)挤压纺丝混合溶液(此时为一种聚合物溶液)，实现静电纺丝。在静电纺丝过程中，数字显示搅拌器(未示出)与接收盘40相连，数字显示搅拌器(未示出)带动接收盘40移动，以动态收集电纺纳米纤维。动态的接收方法，使纺出的纳米纤维在接收盘40上分布的更加均匀，得到的静电纺丝产品的性质更加良好稳定。为了避免在纺丝过程中外界的环境对其产生影响，整个过程可以在有机玻璃板罩(未示出)内进行实验，人手可以通过密封伸入设置在有机玻璃板罩上(并且手掌部分伸入有机玻璃板罩内)的橡胶手套，实行必要的操作。
[0054]
测定负载血液制品的静电纺丝产品生物活性的实验结果
[0055]
对本实施例制备的具有生物活性的纳米纤维材料(即负载血液制品的静电纺丝产品)，进行实验，得到的结果如图2至图7所示。
[0056]
图2显示的是采用本实施例得到的冻干血液制品，利用cck8试剂进行骨细胞增殖测定实验，得到的相对吸光度(relative od)测试结果。
[0057]
其中，本实验的过程如下：在96孔板中配置100μl的骨细胞悬液；将培养板在培养箱预培养24小时(37℃，5％co2)；一组实验作为空白对照，另一组实验加入冻干后的血液制品；将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(本实验以天数为时间，图2中横坐标数字表示天数，以d表示)；向每孔加入10μl的cck8溶液；将培养板在培养箱内孵育相应的时间；用酶标仪测定在450nm处的相应吸光度(od)。
[0058]
由图2可以看到，采用了本实施例的血液制品(冻干富血小板纤维蛋白凝胶)进行静电纺丝得到的纳米纤维产品，作为实验组(lyophilized prf，冻干富血小板纤维蛋白)，其相比于空白对照(control)组而言，所述实验组能够使成骨细胞增殖率明显提高。
[0059]
图3利用本发明制备的冻干血液制品对成骨相关基因骨桥蛋白(osteopontin,opn)和骨钙素(osteocalcin,ocn)表达(expression)的影响数据图，图3中的横坐标ocn和opn即表示两种不同表达，并且纵坐标数据以相对表达(relative expression)显示。
[0060]
图4进行了另一个实验，测定了本实例的冻干富血小板纤维蛋白(prf)静电纺丝产品和细胞共培养后，对细胞成骨相关基因表达的影响。三组实验分别为：a.空白对照组(control)；b.加入(普通)静电纺丝纤维组(pv/sa)；c.加入静电纺丝纤维组，所述静电纺丝纤维在制备过程中，加入了血液制品，并且所述血液制品(富血小板纤维蛋白)经过了冷冻处理(pv/sa/prf)。
[0061]
图4对应的实验包括：提取共培养细胞的mrna后，根据cdna合成试剂盒(thermo)的说明书，将mrna反转录成cdna。实时荧光定量pcr读取ct值，gapdh作为内参基因，采用δδct计算方法,得出rq(relative quantity)值。
[0062]
ocn，opn基因表达情况如图4所示(图4是以相对吸光度作为纵坐标数据，但结合图2和图3的内容可知，相对吸光度直观反映基因的相对表达，relative expression)，培养5天后，c组与a、b对照组相比，ocn、opn基因表达均显著增高，说明本实施例得到的负载冻干血液制品(具体负载血液为冻干富血小板纤维蛋白凝胶，即prf凝胶)的静电纺丝产品具有诱导成骨性的作用。
[0063]
同时，图4中还显示，a组的基因表达甚至略高于b组的基因表达。这是因为，普通的静电纺丝产品，其本身材料是不具有促进细胞增值的功能的，甚至于这种不具促进功能的异样物质的加入，还会产生对细胞增值的负面影响。而这也从侧面证明，本实施例的制备方法，通过在静电纺丝过程中，加入相应的血液制品进行静电纺丝，得到的静电纺丝产品不仅能够消除普通静电纺丝产品对细胞增值的负面影响，而且，达到了一种正面提高细胞增值作用的程度，更加说明本实施例的制备方法具有广泛而良好的运用价值。
[0064]
而图5至图7显示负载血液制品(具体负载血液为冻干富血小板纤维蛋白凝胶，即prf凝胶)的静电纺丝产品对成骨细胞钙化结节形成的影响。
[0065]
图5至图7的获得过程如下：各实验分组和细胞铺板共培养情况同图4对应实验，于实验的第14d(天)，吸去培养液，之后用4％多聚甲醛溶液固定，用1％茜素红溶液染色，显微镜拍照。
[0066]
从图5可见细胞培养14天后，对照组a组几乎无红色钙结节，图6的(普通)静电纺丝b组仅有少量钙结节形成，图7可见c组明显的钙结节形成。根据以上实验测定结果可知，最终静电纺丝纤维产品的生物活性性能，是由富血小板纤维蛋白等血液制品在静电纺丝过程中的加入带来的，这种具有生物活性的纳米纤维，能够带来促进骨细胞增长等生物活性。
[0067]
经过发明人分析发现，富血小板纤维蛋白经过冻干处理，更容易保存和运输，更加重要的是，更加适合于生物复合型纳米纤维材料的生产和制备，且制备出的最终产品生物活性还能够提高。
[0068]
综合上述内容可知，本发明提供的制备方法，所制备的生物复合静电纺丝纤维产品，至少能够使骨组织的再生功能得到提高。
[0069]
进一步的，相应的静电纺丝纤维产品的应用，可以为牙周病的治疗，或者为牙种植区骨量不足及其它骨缺损的修复等，提供更好的选择。
[0070]
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。