一种缓解炎症的乙酰胆碱免疫调节剂及其制备方法和应用

技术领域：

本发明属医药技术领域，涉及缓解炎症的免疫调节剂，具体涉及一种缓解炎症的乙酰胆碱免疫调节剂的制备方法及其应用。

背景技术：
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现有技术记载了乙酰胆碱(acetylcholine，ach)是一种重要的神经递质，在中枢及外周神经系统中广泛分布。在神经系统中某些高表达乙酰胆碱转移酶的神经细胞被称为胆碱能神经元，这些神经细胞通过乙酰胆碱转移酶将合成乙酰胆碱。有研究发现，机体免疫系统中多种免疫细胞表面表达的乙酰胆碱受体(acetylcholinereceptor，achr)，说明乙酰胆碱作为重要的神经递质可能参与神经系统对免疫系统的调控。文献还记载了乙酰胆碱受体分为毒蕈硷型受体(muscarinicacetylcholinereceptors，machr)和烟碱型受体(nicotinicacetylcholinereceptors，nachr)，其中machr共有m1-m5五种亚型，通过两种不同的二级信号系统来在细胞发挥调控作用，m1、m3、m5型受体通过介导plc活性，增强细胞的ca2+内流；m2、m4型受体则通过介导腺苷酸环化酶的抑制，从而减少细胞内的环磷酸腺苷的形成。研究表明，在人体的外周血t细胞、b细胞及小鼠的单核淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞表面等均有m1-m5型受体的表达，提示乙酰胆碱可能对免疫细胞具有直接的调控作用。但，乙酰胆碱及其m型受体对免疫细胞的功能调控尚未完全阐明。

髓源性抑制细胞(myeloid-derivedsuppressorcells，mdscs)是近年来研究的具有强大免疫抑制功能的一类细胞群，其来源于未成熟髓系细胞，在炎症区域聚集活化，广泛参与免疫耐受、病理炎症等免疫过程。作为重要的负性调控细胞群体，mdsc在多种疾病中的作用正日益受到关注，将可能成为治疗的新靶点。已有研究证实，mdsc可通过多种直接及间接途径抑制炎性免疫细胞功能，从而重塑紊乱的局部免疫格局。

炎症性肠病(inflammatoryboweldisease，ibd)是一种以肠道免疫系统紊乱为特征，可累及消化道不同部位的炎症性疾病，具有反复发作的特点，迄今，其机制尚未完全明确；其主要分为两种不同的类型，溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，uc)和克罗恩病(crohndisease，cd)。近年来该疾病发病率有明显上升，且有逐渐年轻化的趋势。目前主要的治疗方式仍以营养疗法、药物治疗、单克隆抗体相关的生物治疗、免疫抑制剂疗法为主，实践显示，上述传统疗法均不能完全有效地控制炎症的发展，且常并发严重的不良反应，其中部分病人常发展至需要外科手术干预的阶段，严重影响患者的生活质量。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟基于研究新型免疫调节剂将有助于为临床治疗ibd等免疫紊乱疾病提供有效工具的基础，提供新的缓解炎症的免疫调节剂，具体涉及一种缓解炎症的乙酰胆碱免疫调节剂的制备方法及其应用。

技术实现要素：
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本发明的目的在于基于现有技术的现状，针对炎症性肠病等免疫紊乱性疾病治疗效果的缺陷，提供一种用乙酰胆碱制成用于抑制炎症的免疫调节剂。具体涉及一种缓解炎症的乙酰胆碱免疫调节剂的制备方法及其应用。

本发明所述缓解炎症的乙酰胆碱免疫调节剂为包括溶质和溶液，其中所述溶液为质量百分数为0.9％的氯化钠水溶液，溶剂为乙酰胆碱。该免疫抑制剂靶向作用于mdsc，可增强其免疫抑制功能。

具体的，为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

1.葡聚糖硫酸钠(dss)造模及动物分组

c57bl/6雌性小鼠经两周适应性饲养后(六周龄)进行建模，并设对照组

实验采用的dss购自美国mpbiomedical公司，并用双蒸水配制成3％dss溶液；使用0.22μm滤器过滤除杂除菌，现配现用；

实验过程中观察记录各组小鼠一般情况、肛门带血情况及小鼠腹泻情况。

2.药物配制及给药方法

乙酰胆碱购自美国sigma公司，并用0.9％生理盐水配制成浓度为10mg/ml的溶液，使用0.22μm滤器过滤除杂除菌，现配现用；

3.肠道取样：

观察各组小鼠结肠的大体形态，测量结直肠长度(小肠与盲肠汇合端至肛门)，取部分病灶组织，h.e.染色行病理检查，余下液氮冻存以备后续抽提rna及蛋白质用。

4.肠道组织淋巴细胞分离：

5.细胞表面、胞核染色及流式细胞学分析：

6.酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)：

7.实时荧光定量pcr：

7.1小鼠结直肠组织rna提取；

7.2总rna浓度及纯度测定；

7.3rna逆转录7.3.1.1去除残留基因组dna7.3.1.2rna逆转录；

7.4实时定量荧光pcr。

实验结果显示：所述的乙酰胆碱免疫调节剂能够显著缓解小鼠肠炎表现，能够显著降低小鼠肠道组织促炎因子表达量，增加il-10表达量，能够显著降低肠炎小鼠肠道th17、m1型巨噬细胞比例，增加m-mdsc比例：乙酰胆碱处理显著升高m-mdsc细胞表面ccr2表达水平，升高其抑炎因子il-10的分泌水平：结果表明，本发明使用肠道局部给予乙酰胆碱制成免疫调节剂能显著改善由dss诱导的肠炎小鼠的粘膜炎症状态，通过靶向增强m-mdsc的趋化及抑制性功能，调节紊乱的肠道免疫格局。

进一步，本发明的缓解炎症的乙酰胆碱免疫调节剂可用于制备辅助治疗各类免疫紊乱性疾病的药物，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1.小鼠dss造模及ach免疫调节剂干预具体流程安排，其中，

control：对照组，dss+h2o：模型组，dss+ach：ach免疫调节剂干预组，h2o：水。

图2.ach免疫调节剂显著缓解小鼠肠道炎症程度，其中，

a.ach免疫调节剂可显著减缓模型小鼠体重下降情况，b.ach免疫调节剂可显著减缓模型小鼠肠道缩短情况，图左为小鼠肠道长度大体示意图，右图为各组数据统计分析结果，c.肠道组织h.e.切片染色结果，数据以平均值±标准误表示，h2o+h2o：空白对照组，dss+ach：模型组，dss+h2o：干预组，*p＜0.05，***p＜0.001。

图3.ach免疫调节剂显著降低小鼠肠道组织促炎因子水平，升高il-10水平，其中，a.ach免疫调节剂显著降低肠道组织炎症因子mrna水平，b.小鼠肠道组织各类炎症因子蛋白的elisa检测结果；

数据以平均值±标准误表示，dss+ach：模型组，dss+h2o：干预组，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

图4.ach免疫调节剂显著降低肠炎小鼠肠道th17、巨噬细胞比例，增加m-mdsc比例，其中，a.肠道局部髓系细胞比例变化，b.肠道局部各类t细胞比例变化，数据以平均值±标准误表示，dss+ach：模型组，dss+h2o：干预组，*p＜0.05。

图5.ach免疫调节剂显著升高m-mdsc细胞表面ccr2表达水平，升高其抑炎因子il-10的分泌水平，其中，

a.m-mdsc表面趋化因子受体ccr2表达水平，b.m-mdsc各类抑制因子的表达水平，c.ach处理及对照组m-mdsc培养液上清il-10的蛋白水平，数据以平均值±标准误表示，ach：乙酰胆碱处理组，ctrl：对照组，*p＜0.05。

具体实施方式

实施例1采用乙酰胆碱(acetylcholine，ach)制备用于缓解炎症的免疫调节剂，及进行动物实验

1.葡聚糖硫酸钠(dss)造模及动物分组

c57bl/6雌性小鼠经两周适应性饲养后(六周龄)进行建模。对照组：正常饮水，持续7天后处死；模型组：3％dss饮水，持续7天，喂水阶段每2-3天更换一次小鼠dss饮用水。ach干预组：3％dss饮水，持续7天，喂水阶段每2-3天更换一次小鼠dss饮用水，并于实验的第2、4、6日进行ach灌肠干预，具体流程如图1所示；

dss购自美国mpbiomedical公司，并用双蒸水配制成3％dss溶液。使用0.22μm滤器过滤除杂除菌，现配现用；

实验过程中观察记录各组小鼠一般情况、肛门带血情况及小鼠腹泻情况。

2.药物配制及给药方法

乙酰胆碱购自美国sigma公司，并用0.9％生理盐水配制成浓度为10mg/ml的溶液，使用0.22μm滤器过滤除杂除菌，现配现用；

给药操作方法：规范抓持小鼠后，暴露小鼠肛门部，用棉棒轻触肛门刺激小鼠排便，将直径2mm胃管接至1ml注射器，吸取灌肠溶液并用甘油润滑胃管；将胃管缓慢从小鼠肛门插入约4cm，一边缓慢退管一边注射溶液约100ul然后完全退出胃管，肛门口不应有液体流出。

3.肠道取样：

颈椎脱臼处死小鼠，沿腹中线纵行剖开腹腔，游离结肠和远端回肠，取肛门至盲肠末端的全结直肠。观察各组小鼠结肠的大体形态，测量结直肠长度(小肠与盲肠汇合端至肛门)。沿结肠带纵行剖开结直肠，用预冷无菌生理盐水将结直肠冲洗干净，观察肠道内壁情况并拍照，将肠道沿长轴一分为二切开，取部分病灶组织4％多聚甲醛浸泡4℃过夜，石蜡包埋、切片用于h.e.染色行病理检查，余下液氮冻存以备后续抽提rna及蛋白质用。

4.肠道组织淋巴细胞分离：

1)小鼠处死后迅速消毒，逐层打开腹腔，尽快取下结肠置于预冷pbs+2％fbs液体中，切除肠系膜组织，沿纵轴剪开肠管，小心去除残留粪便并漂洗；

2)将肠道组织转移入新的离心管中，使用无菌剪刀剪碎，加入2-3ml消化液，230rpm/37℃水平震荡30min；

3)400g/4℃离心5min，弃上清，加入适量预冷pbs+2％fbs重悬组织，通过70μm无菌细胞滤器滤过去除杂质

4)400g/4℃离心5min，将组织用2.4mlrmpi1640培养基+2％fbs重悬，与1.6ml100％percoll混合制成40％percoll，缓慢加至70％percoll分离液上层，随后在40％percoll表面缓慢加入30％percoll，形成30％/40％/70％percoll分离体系，注意不要破坏液体平面；

5)2000rpm/室温离心20min，升降速梯度设为1；

6)收集40％/70％percoll中间层细胞，使用大量pbs清洗两遍后，重悬于1mlpbs+2％fbs中置于4℃备用；

5.细胞表面、胞核染色及流式细胞学分析：

1)小鼠肠道免疫细胞计数并计算细胞活力，不应低于90％；

2)将细胞转移入流式管中，400g/4℃离心5min，500μlpbs重悬；

3)各管中按说明书要求加入合适量的表面染色抗体，4℃下避光孵育30min；

4)加入2mlpbs洗涤细胞，400g/4℃离心5min；

5)重复步骤4；

6)加入1ml固定/破膜液，.室温固定30min；

7)加入2ml1×破膜液洗涤细胞，400g/4℃离心5min；

8)重复步骤7；

9)各管中按说明书要求加入合适量的胞核染色抗体，室温避光孵育30-40min；

10)加入2ml1×破膜液洗涤细胞，400g/4℃离心5min；

11)重复步骤7；

12)加入300μlpbs重悬，准备流式细胞仪检测；

13)使用flowjox进行数据分析。

6.酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)：

1)试剂盒内标准品按说明书用样品稀释液对比稀释，配制相应浓度的标准品；

2)用洗涤液洗2次，加入样品稀释液100μl/孔，加入标准品(每种浓度的标准品设一个副孔)及样品50μl/孔，空白孔加入校准品稀释液50μl/孔；加入酶标试剂50μl/孔，加盖室温孵育2h；

3)弃去液体，用洗涤液洗6次，加辣根过氧化物酶100μl/孔，加盖室温孵育1h；

4)弃去液体，用洗涤液洗6次，加入显色液100μl/孔，避光室温孵育30min，颜色逐渐变蓝；

5)加入终止液100μl/孔，颜色变黄，用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值，测定应在加终止液后15min内进行；

6)以od值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据样品的od值在标准曲线上查出其浓度，乘以稀释倍数，即为样品浓度。

7.实时荧光定量pcr：

7.1小鼠结直肠组织rna提取

1)实验前期准备：无菌剪刀、镊子及匀浆钢珠经0.1％depc水溶液浸泡过夜后，高压蒸汽灭菌15min；

2)组织匀浆：取出液氮中冻存的各个小鼠结直肠组织约200mg，放入提前装有适量液氮的玻璃研磨器中充分研磨成粉末，过程中不断添加液氮保持低温；将粉末组织转移入2.0mlep离心管中，加入1mltrizol试剂，放入匀浆仪中以120hz匀浆1min，取出后室温静置5min；

3)分相：每管加入200μl三氯乙醇，涡旋振荡15s后室温静置5min，12000rpm/4℃离心10min；

4)沉淀rna：取400μl上层水相转移至新1.5mlrnase-freeep离心管中，加入等体积异丙醇，充分颠倒混匀后室温静置15min，12000rpm/4℃离心10min；

5)洗涤rna：除去上清，可观察ep管底部rna沉淀。向管中加入1ml预冷depc水稀释的75％乙醇，轻轻颠倒洗涤沉淀，12000rpm/4℃离心10min；

6)除去上清，室温晾干沉淀，待沉淀稍变透明时加入适量depc水充分溶解沉淀。

7.2总rna浓度及纯度测定；

按照nanodrop操作说明书检测提取的总rna的浓度和纯度；根据od260/od280的比值可以估计rna的纯度，1.8-2.0为理想的数值范围，测定浓度且质量合格的总rna用于后续实验，长时间保存置于-80℃冰箱。

7.3rna逆转录7.3.1.1去除残留基因组dna7.3.1.2rna逆转录

7.4实时定量荧光pcr

实验结果显示：

1.乙酰胆碱免疫调节剂能够显著缓解小鼠肠炎表现：

干预组(3％dss+ach组)小鼠一般情况明显优于模型组小鼠，便血、体重降低等症状模型组(3％dss+h2o)小鼠更加严重且持续更久，干预组小鼠与模型组小鼠相比，体重降低程度明显减轻，疾病活动指数显著下降，结直肠缩短也明显较少(图2a-b)，干预组小鼠结直肠平均长度为7.41±0.37cm，模型小鼠结直肠平均长度为5.87±0.34cm，具有显著性差异(p＜0.01，图2b)，h.e.切片染色显示模型组小鼠肠道出现黏膜糜烂、炎性细胞富集、腺窝形态改变及黏膜肌层断裂，干预组小鼠肠道完整性较好，未出现黏膜肌层断裂等肠道严重受损表现(图2c)，对照组小鼠无肠道炎症表现。

2.乙酰胆碱免疫调节剂能够显著降低小鼠肠道组织促炎因子表达量，增加il-10表达量：

对小鼠结肠组织进行了炎症因子mrna及蛋白含量定量检测，结果显示，模型组小鼠结肠组织中tnfα，il1β，il6，il10，ifng，il17amrna与对照组相比显著增高，而干预组与模型组相比显著降低(图3a)，对结肠组织上述个基因的蛋白水平进行了elisa检测，结果显示，与模型组相比，ach免疫调节剂可显著降低肠道组织各促炎蛋白表达水平，其中il-17a水平相差10倍以上(图3b)，结果表明ach免疫调节剂可能通过降低上述炎症因子表达量降低结肠组织中炎症程度。

3.乙酰胆碱免疫调节剂能够显著降低肠炎小鼠肠道th17、m1型巨噬细胞比例，增加m-mdsc比例：

各组小鼠的肠道组织提取免疫细胞后，使用流式细胞术分析肠道局部免疫格局变化，结果显示，干预组对比模型组，抑炎细胞群m-mdsc的数量显著增加(图4a)，而g-mdsc数量无显著差异(图4a)；巨噬细胞显著减少(图4a)，而dc细胞无显著差异(图4a)；m1型巨噬细胞显著减少(图4a)，而非m1型巨噬细胞并未受ach免疫调节剂的影响(图4a)；在dss模型中起到关键促炎作用的th17细胞显著减少(图4b)，cd8+t细胞、cd4+t细胞、th1、th2、treg细胞均无显著改变(图4b)。

4.乙酰胆碱处理显著升高m-mdsc细胞表面ccr2表达水平，升高其抑炎因子il-10的分泌水平：

从dss处理炎症小鼠分选m-mdsc进行体外培养，与此同时进行ach干预，使用流式细胞术分析m-mdsc趋化因子受体及经典抑制因子变化，结果显示，干预组对比对照组，m-mdsc的关键趋化因子受体ccr2显著增高(图4a)；m-mdsc关键抑制因子il-10显著增加，而其他抑制因子如arg1及nos2无明显变化(图4b)；与之相符的是，取该类细胞培养上清行elisa检测，il-10蛋白的表达量也有显著增高。

结果表明，本发明使用肠道局部给予乙酰胆碱制成免疫调节剂能显著改善由dss诱导的肠炎小鼠的粘膜炎症状态，通过靶向增强m-mdsc的趋化及抑制性功能，调节紊乱的肠道免疫格局。因此本发明的缓解炎症的乙酰胆碱免疫调节剂可用于制备辅助治疗各类免疫紊乱性疾病的药物，具有良好的开发应用前景。