夹载角鲨化合物的磷脂包被铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统及SARS-CoV2亚单位疫苗的制作方法

本发明涉及生物药物技术领域，具体涉及夹载角鲨化合物的磷脂包被铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统及sars-cov2亚单位疫苗。

背景技术：

目前，sars-cov2(covid-19，2019新型冠状病毒)感染肺炎正在全球快速蔓延，成为严重威胁人类生命的传染病大流行。而全球由于防控covid-19疫情而造成的经济损失，也已无法估量。尽管研究人员正夜以继日发展能够sars-cov2疫苗，现在仍没有能够广泛接种的疫苗制剂。在这种紧迫的形势下，尽快开发安全、有效的sars-cov2疫苗用以保护易感人群，对于保障人类安全、维护社会稳定、以及恢复经济发展，都具有十分重要意义。

目前正在发展的sars-cov2疫苗主要包括如下类型。1)灭活sars-cov2疫苗：是采用物理或化学方法直接杀灭sars-cov2病原体直接作为疫苗制剂。2)减毒sars-cov2活疫苗：用人工定向诱变方法消除病原体致病性，或者将sars-cov2表面抗原spike蛋白基因整合无致病性病毒载体，如腺病毒等，作为疫苗制剂。减毒活疫苗的免疫诱导效果较好，但存在基因突变产生致病性的风险，以及载体病毒自身诱导产生的免疫负效应。3)核酸疫苗：包括rna、dna两种疫苗，是将蛋白抗原表达基因通过脂质纳米载体传递至细胞，表达抗原刺激机体产生免疫。4)亚单位疫苗(纯抗原组分疫苗)：将sars-cov2纯化抗原，与疫苗佐剂-传递系统结合，制备为疫苗制剂。

上述不同类型sars-cov2疫苗各具特点与优势，但也均存在自身缺陷，概括而言突出表现为以下两方面。发展安全、强效、易于构建的疫苗佐剂-传递系统(vads)，仍是制备sars-cov2亚单位疫苗的关键。

铝盐是常用的vads，应用于临床已经有90多年的历史。一些广泛应用的主要疫苗制剂仍含有铝盐vads，如百白破疫苗、流感嗜血杆菌疫苗等。然而，传统铝佐剂其颗粒聚集呈凝胶形式存在，虽然能激活th2细胞分泌il-4，进而促进th2型体液免疫应答产生抗体，但难以有效诱导细胞免疫应答，无法促进机体产生细胞毒性t细胞。此外，传统铝佐剂还有一个突出弱点是，具有较强局部刺激性，常导致接种部位出现炎症反应。

综上，铝盐作为疫苗佐剂，在安全性和免疫刺激效力方面都有待进一步研发优化。

技术实现要素：

为了应对目前正在全球快速蔓延的covid-19疫情，本发明构建了一种夹载角鲨化合物的磷脂包被铝纳米粒vads，以及基于该vads的sars-cov2亚单位疫苗。具体技术方案概括如下：

一种夹载角鲨化合物的磷脂包被铝纳米粒vads，其特征在于：以铝纳米粒(an)为载体，在铝纳米粒表面覆盖有磷脂(pl)双分子层，磷脂分子层之间夹载有角鲨化合物(sgualane)。

优选地，所述角鲨化合物指角鲨烯(squalene)或角鲨烷(squalane)。

优选地，所述磷脂含有由磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰甘油(pg)、磷脂酰丝氨酸(ps)和鞘磷脂(sp)中一种或多种组成的主成分；

优选地，还含有作为辅助成分以调节载体荷电性质的荷电脂质材料；

优选地，所述荷电脂质材料为硬脂胺(sa)或1，2-二油酰-3-三甲铵基丙烷(dotap)。

进一步优选地，所述磷脂含有磷脂酰胆碱以及荷电脂质材料1，2-二油酰-3-三甲铵基丙烷。

优选地，所述铝纳米粒为氧化铝、磷酸铝或氢氧化铝铝纳米粒；

优选铝纳米粒粒径为100纳米以下。

上述任一所述的vads的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取适量磷脂及角鲨化合物，置于烧瓶中，加入有机溶剂溶解，通过旋转蒸发去除溶剂，在容器内壁形成脂质薄膜；

优选所述有机溶剂为氯仿，磷脂与角鲨化合物质量比为10～40:1；

优选磷脂与角鲨化合物质量比为20～25:1；

(2)取含有铝纳米粒溶液，加入上述烧瓶中，充分搅拌至脂质分子水化，即形成splan；

优选铝纳米粒与磷脂质量比为2～10:1；

优选当磷脂相变温度高于室温，步骤(1)、(2)在高于磷脂相变温度5℃以上温度下进行；当磷脂相变温度低于室温，步骤(1)、(2)在室温下进行。

本发明还提供一种基于夹载角鲨化合物的磷脂包被铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统的亚单位疫苗，其特征在于：载体为上述的任一疫苗佐剂-传递系统，载体上连接或吸附有疫苗抗原。

本发明还提供一种基于夹载角鲨化合物的磷脂包被铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统的sars-cov2亚单位疫苗，其特征在于：载体为上述的任一vads，载体上连接或吸附有sars-cov2抗原。

所述sars-cov2抗原为scv2包膜蛋白scv2-ep，或sars-cov2刺突蛋白scv2-sp，或sars-cov2刺突蛋白受体结合域scv2-rbd；

优选sars-cov2刺突蛋白受体结合域scv2-rbd。

所述铝纳米粒与sars-cov2抗原的质量比为5～40:1；

优选铝纳米粒与sars-cov2抗原的质量比为10～20:1；

优选所述亚单位疫苗的剂型为液体制剂或冷冻干燥获得的冻干品制剂。

上述任一sars-cov2亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

先按照前述制备splan的方法制备splan，将制得的splan与sars-cov2抗原溶液混合搅拌均匀，即得；

优选所述splan和sars-cov2抗原溶液均为hepes水溶液。

角鲨化合物，如角鲨烯与角鲨烷，室温下为强亲脂性的液体油。角鲨化合物能够激活免疫系统，诱导机体产生th1/th2混合型免疫反应。

磷脂是组成生物膜的两性分子，含有磷酸极性基团及非极性的疏水烃链，因而在水溶液中由于疏水作用能够自排形成双分子层结构。磷脂具有良好的生物相容性，可以提高制剂生物安全性及促进细胞摄取作用。而磷脂双分子层中间的亲脂性质，为角鲨化合物提供了夹载空间。

铝具有强烈的亲磷性质，能够与含有磷酸基团的分子形成牢固的结合载体。本发明将铝盐及角鲨化合物的佐剂功能结合起来，发展得到更好的vads--splan；以splan为高能效疫苗佐剂-传递系统(vads)，结合sars-cov2抗原，构建了sars-cov2亚单位疫苗(以squalene和scv2-rbd为例，其结构如图1所示)。

本发明构建的疫苗佐剂-传递系统splan，生物相容性高，磷脂双分子层具有良好生物相容性，局部刺激性小，适于多途径接种，例如，可以通过腔道粘膜接种，也可以通过皮下、皮内、肌肉注射接种。本发明的基于splan的sars-cov2亚单位疫苗splan-scv2，安全性高，不存病毒载体疫苗可能引发的安全隐患，以及诱导偏离目标抗原的免疫应答。splan-scv2具有改善的铝盐佐剂功能，免疫诱导效力强，铝纳米粒激活免疫系统产生体液及细胞免疫；尤其是，splan-scv2制备工艺简单，适于大规模生产，有望应对covid-19疫情。

本申请涉及的词语缩写：

scv2，sars-cov2，thesevereacuterespiratorysyndromecoronavirus2(重急呼吸综合症冠病毒-2)；

scv2-sp，scv2spikeprotein(scv2刺突蛋白)；

scv2-rbd，scv2spikeproteinreceptor-bindingdomain(scv2刺突蛋白受体结合域)；

covid-19，coronavirusdisease2019(2019冠病毒感染疾病)；

splan,thesgualane-sandwichedphospholipidbilayer-coatedaluminumnanoparticles(夹载角鲨化合物的磷脂双分子层包被铝纳米粒)；

vads，vaccineadjuvant-deliverysystem(疫苗佐剂-传递系统)；

splan-scv2，(基于splan的scv2亚单位疫苗)；

spc,soyphosphatidylcholine(豆磷脂酰胆碱胆碱)；

dotap,1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane(1,2-二油酰基-三甲胺基丙烷)。

附图说明

图1为本发明构建的sars-cov2亚单位疫苗的结构示意图。

图2为接种不同处方疫苗小鼠血清抗体igg水平(n＝5)。

图3为接种不同疫苗小鼠产生抗原特异性细胞毒性t细胞(anti-agctl)相对水平(n＝5)。

图4为接种不同处方疫苗小鼠脾细胞再次接受抗原刺激产生ifn-γ水平(n＝5)。

图5为接种不同处方疫苗小鼠血清抗体igg及肺灌洗液(balf)iga水平(n＝5)。

图6为接种不同疫苗小鼠产生抗原特异性细胞毒性t细胞(anti-agctl)相对水平(n＝5)。

图7为接种不同处方疫苗小鼠脾细胞再次接受抗原刺激产生ifn-γ水平(n＝5)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

试剂来源：

氧化铝纳米粒：采用铝氧化法，具体见参考文献(mchangmai,jpriyesh,mpurkait,al2o3nanoparticlessynthesizedusingvariousoxidizingagents:defluoridationperformance,jsci:advmaterdevice2017,volume2,issue4,december2017,pages483-492.)。

氢氧化铝纳米粒：采用酸碱中和法自制，具体见参考文献(lix,aldayela,cuiz.2014.aluminumhydroxidenanoparticlesshowastrongervaccineadjuvantactivitythantraditionalaluminumhydroxidemicroparticles.jcontrolrelease.173:148–157.)。

传统氢氧化铝佐剂购自invivogen(sandiego,ca,usa)，货号vac-alu-250。

豆磷脂酰胆碱(soyphosphatidylcholine,spc)：购自艾伟拓(上海)医药科技有限公司，cas号8030-76-0。

1，2-二油酰-3-三甲铵基丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane(chloride)，dotap，wm＝699)：购自艾伟拓(上海)医药科技有限公司，cas号132172-61-3。

角鲨烯(squalene)，购自merck(中国上海)货号s3626-100ml，cas号111-02-4。

角鲨烷(squalane)，购自merck(中国上海)货号s3626-100ml，cas号111-01-3。

本发明各实施例中选用sars-cov2刺突蛋白受体结合域scv2-rbd(sars-cov2spikeproteinreceptorbindingdomain)作为疫苗抗原，购自invivogen(sandiego,ca,usa)，货号his-sars2-rbd。

scv2-rbd-his氨基酸序列(scv2-sp全序列319-541部分，末端连接组氨酸)如seqidno:1所示：

rvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnf(gsghhhhhh)

scv2-rbd水溶液：上述scv2-rbd溶于hepes缓冲液中配制而得。

其余试剂如未表明，均为本领域常规试剂，可商购获得。

实施例1:以spc/dotap/squalene及氢氧化铝纳米粒构建splan及scv2亚单位疫苗

取脂质材料(spc和dotap)及squalene适量(spc/dotap/squalene质量比＝10:10:1)，置于梨形烧瓶，加氯仿(使用量为脂质材料重量的3倍量)溶解，室温，以90rpm(90转/分钟)旋转蒸发，除尽有机溶剂，形成spc/dotap/squalene薄膜。

按照an/脂质材料(spc和dotap)＝10:1(质量比)，向上述烧瓶加入含有平均粒径80纳米的氢氧化铝纳米粒(an，1％w/v)水溶液(10mmhepes缓冲液，ph＝7)，以120rpm旋转1小时，以充分水化spc/dotap/squalene薄膜形成splan。

随后将烧瓶转置于恒温电磁搅拌器，加入电磁搅拌子，在室温、200rpm搅拌条件下，按照an/scv2-rbd＝10:1(质量比)，缓慢滴加0.1％(w/v)的scv2-rbd抗原(ag)水溶液(10mmhepes缓冲液，ph＝7)，滴加完毕，继续搅拌30分钟，即形成scv2-rbd-splan。

采用以下方法对样品进行参数表征(n＝3)。

以动态光散射(dls)技术以及电泳光散射技术(els)，利用zetasizernanozs90(malvernpanalytical公司)仪器，在25℃、水介质及90度角条件下，检测样品粒径及ζ电位。

以hplc法定量检测squalene，具体方法见参考文献(novaka,etal.,developmentandvalidationofasimplehigh-performanceliquidchromatographyanalyticalmethodforsimultaneousdeterminationofphytosterols,cholesterolandsqualeneinparenterallipidemulsions.biomedchromatogr.2018feb；32(2).doi:10.1002/bmc.4084)。

采用micro-bradfordprotocol方法，对于scv2-rbd进行定量测定，具体步骤见参考文献(szuo,plundahl,amicro-bradfordmembraneproteinassay,analbiochem284(1)(2000)162-4.)，以下列公式计算抗原载体结合率(ae)。

ae(％)＝(总ag–游离ag)/总ag×100％

结果表明：平均粒径为80nm、ζ为-48mv的氢氧化铝纳米粒(an)，采用上述方法制备得到的splan，平均粒径为93纳米、ζ为35mv；载运抗原后，得到的scv2-rbd-splan，平均粒径为98纳米，ζ为28mv；97％squalene被夹载入splan磷脂双分子层，抗原ae为94％。

动物接种实验(n＝5)：按照2.5μg/50μl抗原剂量，通过肌肉注射给小鼠接种，间隔3周接种2次。另设3对照组小鼠，按相同剂量及方式分别接种：(1)生理盐水(saline)；(2)scv2-rbd+商品传统氢氧化铝佐剂(scv2-rbd-am)；(3)scv2-rbd+氢氧化铝纳米粒(scv2-rbd-an)。

接种后各组小鼠体重、进食及活动行为均未见异常。

第二次接种3周后，检测实验组和对照组(saline、scv2-rbd-am、scv2-rbd-an)小鼠的免疫应答反应，包括elisa检测小鼠血清抗原特异性抗体(igg)水平，流式细胞分析检测细胞毒性t细胞(ctl,即荧光标记siinfeklh-i⁺cd8⁺tcell)水平，以及elisa检测抗原再刺激免疫鼠脾细胞分泌ifn-γ水平(各参数具体检测方法见参考文献(wangn,zheny,jiny,wangx,lin,jiangs,wangt.combiningdifferenttypesofmultifunctionalliposomesloadedwithammoniumbicarbonatetofabricatemicroneedlearraysasavaginalmucosalvaccineadjuvant-dualdeliverysystem(vadds).jcontrolrelease.2017jan28；246:12-29.)。检测结果如图2、3、4所显示，图中，am为传统氢氧化铝佐剂(aluminummicroparticles)，an为氢氧化铝纳米粒。

图2为接种不同处方疫苗小鼠血清抗体igg水平(n＝5)，检测时血清进行1:3200倍稀释(***p<0.01)。

图3为接种不同疫苗小鼠产生的抗原特异性细胞毒性t细胞(anti-agctl)相对水平(n＝5)(***p<0.01)。

图4为接种不同处方疫苗小鼠脾细胞再次接受抗原刺激产生ifn-γ水平(n＝5)(***p<0.01)。

结果表明，与scv2-rb-am、scv2-rbd-an对照组相比较，接种scv2-rbd-splan小鼠，产生抗原特异性抗体igg水平分别提高了2.2倍和1.6倍，产生细胞毒性t细胞(ctl)提高了8.1倍和1.9倍，免疫鼠脾细胞抗原再刺激分泌ifn-γ水平提高了4.6倍和2.5倍。

可见，splan是强效vads，基于splan发展的scv2疫苗能够高效诱导接种鼠产生th1/th2混合型免疫应答，有望能够成为防控scv2的疫苗制剂。

实施例2:以spc/dotap/squalane及氧化铝纳米粒构建splan及scv2亚单位疫苗

取脂质材料(spc和dotap)及squalene适量(spc/dotap/squalane＝15:10:1，w/w)，置于梨形烧瓶，加氯仿(脂质材料重量的3倍量)溶解，室温，以90rpm(90转/分钟)旋转蒸发，除尽有机溶剂，形成spc/dotap/squalane薄膜。

按照an/脂质材料(spc和dotap＝8:1(质量比)，向上述烧瓶中加入含有平均粒径50纳米的氧化铝纳米粒(an，1％w/v)水溶液(10mmhepes缓冲液，ph＝7)，以120rpm旋转1小时，以充分水化spc/dotap/squalane薄膜形成splan。

随后将烧瓶转置于恒温电磁搅拌器，加入电磁搅拌子，在室温、200rpm搅拌条件下，按照an/scv2-rbd＝20:1(质量比)，缓慢滴加0.1％(w/v)的scv2-rbd抗原水溶液(10mmhepes缓冲液，ph＝7)，滴加完毕，继续搅拌30分钟，即形成scv2-rbd-splan。

采用实施例1描述的方法对样品各参数进行表征(n＝3)。定量检测角鲨烷(squalane)方法，具体见参考文献(mberekaa,asteinbüchel,microbialdegradationofthemultiplybranchedalkane2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosane(squalane)bymycobacteriumfortuitumandmycobacteriumratisbonense,applenvironmicrobiol.2000oct；66(10):4462-7.doi:10.1128/aem.66.10.4462-4467.2000)。

结果表明：平均粒径为50nm、ζ为-45mv的氧化铝纳米粒(an)，采用上述方法制备得到的splan，平均粒径为59纳米、ζ为32mv；载运抗原后，得到的scv2-rbd-splan，平均粒径为66纳米，ζ为23mv；96％squalane被夹载入splan磷脂双分子层，抗原ae为91％。

动物接种实验(n＝5)：按照5μg/50μl抗原剂量，通过吸入肺部对小鼠进行接种，间隔3周接种2次。另设3对照组小鼠，按相同剂量分别接种：(1)吸入等体积生理盐水(saline)；(2)肌肉注射scv2-rbd+商品传统氢氧化铝佐剂(scv2-rbd-am)(吸入氢氧化铝凝胶会导致小鼠窒息死亡)；(3)吸入接种scv2-rbd+氧化铝纳米粒(scv2-rbd-an)。

接种后各组小鼠体重、进食及活动行为均未见异常。

第二次接种3周后，按实施例1方法检测实验组和对照组小鼠的免疫应答反应，检测结果如图5、6、7所显示，图中，am为商品氢氧化铝佐剂(aluminummicroparticles)；an为氧化铝纳米粒。

图5为接种不同处方疫苗小鼠血清抗体igg及肺灌洗液(balf)iga水平(n＝5)；检测时血清igg进行1:3200倍稀释；检测肺冲洗液iga进行了1:400倍稀释(***p<0.01)。

图6为接种不同疫苗小鼠产生的抗原特异性细胞毒性t细胞(anti-agctl)相对水平(n＝5)(***p<0.01)。

图7为接种不同处方疫苗小鼠脾细胞再次接受抗原刺激产生ifn-γ水平(n＝5)(***p<0.01)。

结果表明，与scv2-rb-am、scv2-rbd-an对照组相比较，接种scv2-rbd-splan小鼠，产生血清抗原特异性抗体igg水平分别提高了2.9倍和1.9倍，肺冲洗液抗体iga分别提高了6.9倍和2.1倍；产生ctl分别提高了5.7倍和2.0倍；免疫鼠脾细胞再次受抗原刺激产生ifn-γ，分别提高了6.0倍和2.8倍。这表明小鼠既产生了th1/th2混合型系统免疫，也产生了很强的粘膜免疫。

因而，基于splan制备的scv2疫苗有望能够通过肺黏膜接种，有效防治入侵呼吸系统的scv2感染。

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