本发明涉及一种高cu(dtc)2载药量蛋白纳米药物的制备方法，特别涉及一种水相制备高cu(dtc)2载药量蛋白纳米药物的方法，属于药物制剂
技术领域：
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背景技术：
：：cu(dtc)2中文全称为n,n-二乙基二硫代氨基甲酸铜，英文名称为copperdiethyldithiocarbamate，亦缩写为cu(ddc)2、cuet等。cu(dtc)2是戒酒药物双硫仑(disulfiram)与cu2+反应生成的金属有机配合物，对多种癌症如黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌等均表现出优异的化疗效果(alcohol-abusedrugdisulfiramtargetscancerviap97segregaseadaptornpl4.nature2017,552(7684),194-199；highlystable,coordinatedpolymericnanoparticlesloadingcopper(ii)diethyldithiocarbamateforcombinationalchemo/chemodynamictherapyofcancer.biomacromolecules2019,20,2372-2383.)。但cu(dtc)2在水中不溶，通过纳米制剂增溶并提高其生物利用度是实现其化疗作用的关键。蛋白是一类生物大分子，具有良好的生物安全性，可用作疏水药物的天然纳米载体。中国发明专利(公开号cn201310151359.4)公开了一种注射用cu(dtc)2纳米粒制剂的制备方法，但该方法需要使用有机溶剂如甲醇、乙醇等溶解cu(dtc)2，且制得的蛋白纳米粒cu(dtc)2载药量仅为10％。技术实现要素：发明目的：针对现有的cu(dtc)2蛋白纳米制剂制备过程需使用有机溶剂、且制剂cu(dtc)2载药量低等问题，本发明提供一种不使用有机溶剂的水相制备高cu(dtc)2载药量蛋白纳米药物的方法。技术方案：本发明所述的一种水相制备高cu(dtc)2载药量蛋白纳米药物的方法，包括如下步骤：(1)将蛋白溶于去离子水中，搅拌下加入水溶性铜盐，并调节溶液ph至强碱性；(2)搅拌下在步骤(1)所得溶液中加入新制的nadtc水溶液，持续搅拌直至反应结束；(3)对步骤(2)反应后的溶液进行透析，透析结束后，过滤除去不溶物，然后冷冻干燥，即得cu(dtc)2蛋白纳米粒。上述步骤(1)中，蛋白可为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、转铁蛋白、辣根过氧化物酶等中的至少一种；蛋白溶于去离子水中的溶液浓度优选为10～100mg/ml。水溶性铜盐可为氯化铜、硫酸铜、醋酸铜、硝酸铜等中的至少一种；水溶性铜盐中cu2+的浓度优选为0.1～0.5mol/l。其中，蛋白与水溶性铜盐的用量满足如下关系：每250毫克蛋白中，加入0.02～0.4毫摩尔的铜离子。本步骤中，调节溶液ph至强碱性可保证较高的载药量，优选可调节溶液ph在至11～13。上述步骤(2)中，新制nadtc水溶液的浓度优选为0.1～0.5mol/l。nadtc水溶液的添加量满足如下比例：反应体系中，铜离子与dtc的摩尔比为1:0.5～1:20。通过调控蛋白与铜离子的比例可有效控制载药量，作为优选的，当蛋白与水溶性铜盐的用量满足如下关系铜离子与dtc的摩尔比为1:2～1:20，且反应体系中，铜离子与dtc的摩尔比为1:2～1:20时，可获得载药量较高的cu(dtc)2蛋白纳米粒。步骤(3)中，透析过程具体为：将步骤(2)反应后的溶液转移至透析袋中透析12～72小时，外部介质为超纯水。通过透析可除去体系中残留的水溶性无机小分子如naoh、nadtc等，确保纳米药物纯净，不含有oh-等有毒物质；透析时间可根据更换透析介质的时间频率确定。有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明将制备cu(dtc)2的水溶性原料预先溶于蛋白的水溶液中，然后利用cu2+与dtc在水中快速反应在蛋白表面原位生成cu(dtc)2，从而简单快速地获得了cu(dtc)2蛋白纳米粒子；与现有技术中通过将成品cu(dtc)2溶于有机溶剂中、使其与蛋白载体结合的制备工艺相比，本发明的制备过程中不需要使用有机溶剂，绿色环保，且操作简单，可大剂量重复生产；(2)本发明制备的纳米粒cu(dtc)2载药量高，接近25wt％，且载药量易于调控；同时，其体外细胞毒性高于自由药物cu(dtc)2，可提高自由药物的生物利用度；(3)本发明所使用的原料价格低廉，包封率接近100％，不会造成大量化疗药物cu(dtc)2的浪费。附图说明图1为实施例1制备的cu(dtc)2白蛋白纳米粒的透射电镜图；图2为实施例1制备的cu(dtc)2白蛋白纳米粒的紫外吸收谱图；图3为实施例1制备的cu(dtc)2白蛋白纳米粒的体外抑制b16癌细胞生长曲线。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。实施例1将250mg牛血清白蛋白(bsa)溶于10ml去离子水中，搅拌下依次加入1.0mlcucl2水溶液(0.2mol/l)、0.5mlnaoh溶液(1mol/l)。搅拌下加入新制4mlnadtc水溶液(0.2mol/l)，继续搅拌1小时后，转移至截留分子量为10000da的透析袋中透析24小时，外部介质为超纯水。透析结束后，过滤除去不溶物，冷冻干燥，制得cu(dtc)2牛血清白蛋白纳米粒，其透射电镜图如图1，粒径范围为25～43nm。将冷冻干燥后的cu(dtc)2牛血清白蛋白纳米粒子按照纳米粒子浓度0.5mg/ml重新溶于水，其在水中的紫外吸收如图2，表明cu(dtc)2成功负载。进一步测试cu(dtc)2牛血清白蛋白纳米粒子的载药量：测定纳米粒子在乙腈中的紫外吸光度，并根据cu(dtc)2在乙腈中的标准曲线计算得载药量为24.3％。纳米粒的体外抑制4t1小鼠乳腺癌细胞的结果如图3，可以看到，cu(dtc)2牛血清白蛋白纳米粒子中药物利用度更高，较自由药物cu(dtc)2具有增强的抑癌活性。实施例2将250mg牛血清白蛋白(bsa)溶于10ml去离子水中，搅拌下依次加入1.0mlcucl2水溶液(0.02mol/l)、0.5mlnaoh溶液(1mol/l)。搅拌下加入新制4mlnadtc水溶液(0.02mol/l)，继续搅拌1小时后，转移至截留分子量为10000da的透析袋中透析24小时，外部介质为超纯水。透析结束后，过滤除去不溶物，冷冻干燥，制得cu(dtc)2牛血清白蛋白纳米粒，其粒径范围为20～45nm，载药量为2.8％。实施例3将250mg牛血清白蛋白(bsa)溶于10ml去离子水中，搅拌下依次加入1.0mlcucl2水溶液(0.1mol/l)、0.5mlnaoh溶液(1mol/l)。搅拌下加入新制4mlnadtc水溶液(0.1mol/l)，继续搅拌1小时后，转移至截留分子量为10000da的透析袋中透析24小时，外部介质为超纯水。透析结束后，过滤除去不溶物，冷冻干燥，制得cu(dtc)2牛血清白蛋白纳米粒的粒径为25～40nm，载药量为11.2％。实施例4将250mg牛血清白蛋白(bsa)溶于10ml去离子水中，搅拌下依次加入1.0mlcucl2水溶液(0.4mol/l)、0.5mlnaoh溶液(1mol/l)。搅拌下加入新制4mlnadtc水溶液(0.2mol/l)，继续搅拌1小时后，转移至截留分子量为10000da的透析袋中透析24小时，外部介质为超纯水。透析结束后，过滤除去不溶物，冷冻干燥，制得cu(dtc)2牛血清白蛋白纳米粒的粒径为27～38nm，载药量为25.0％。实施例5将250mg牛血清白蛋白(bsa)溶于10ml去离子水中，搅拌下依次加入1mlcucl2水溶液(0.2mol/l)、0.5mlnaoh溶液(1mol/l)。搅拌下加入新制0.5mlnadtc水溶液(0.2mol/l)，继续搅拌1小时后，转移至截留分子量为10000da的透析袋中透析24小时，外部介质为超纯水。透析结束后，过滤除去不溶物，冷冻干燥，制得cu(dtc)2牛血清白蛋白纳米粒的粒径为20～58nm，载药量为8.4％。实施例6将250mg牛血清白蛋白(bsa)溶于10ml去离子水中，搅拌下依次加入1.0mlcucl2水溶液(0.2mol/l)、0.5mlnaoh溶液(1mol/l)。搅拌下加入新制10mlnadtc水溶液(0.4mol/l)，继续搅拌1小时后，转移至截留分子量为10000da的透析袋中透析24小时，外部介质为超纯水。透析结束后，过滤除去不溶物，冷冻干燥，制得cu(dtc)2牛血清白蛋白纳米粒的粒径为24～56nm，载药量为23.7％。实施例7将250mg牛血清白蛋白(bsa)溶于10ml去离子水中，搅拌下依次加入1.0mlcucl2水溶液(0.2mol/l)、0.5mlnaoh溶液(1mol/l)。搅拌下加入新制4mlnadtc水溶液(0.2mol/l)，继续搅拌1小时后，转移至截留分子量为10000da的透析袋中透析12小时，外部介质为超纯水。透析结束后，过滤除去不溶物，冷冻干燥，制得cu(dtc)2牛血清白蛋白纳米粒的粒径为25～55nm，载药量为24.1％。实施例8将250mg牛血清白蛋白(bsa)溶于10ml去离子水中，搅拌下依次加入1.0mlcucl2水溶液(0.2mol/l)、0.5mlnaoh溶液(1mol/l)。搅拌下加入新制4mlnadtc水溶液(0.2mol/l)，继续搅拌1小时后，转移至截留分子量为10000da的透析袋中透析72小时，外部介质为超纯水。透析结束后，过滤除去不溶物，冷冻干燥，制得cu(dtc)2牛血清白蛋白纳米粒的粒径为25～48nm，载药量为23.8％。实施例9将250mg人血清白蛋白(hsa)溶于10ml去离子水中，搅拌下依次加入1.0mlcucl2水溶液(0.2mol/l)、0.5mlnaoh溶液(1mol/l)。搅拌下加入新制4mlnadtc水溶液(0.2mol/l)，继续搅拌1小时后，转移至截留分子量为10000da的透析袋中透析24小时，外部介质为超纯水。透析结束后，过滤除去不溶物，冷冻干燥，制得cu(dtc)2人血清白蛋白纳米粒，粒径为25～45nm，载药量为23.8％。实施例10将250mg转铁蛋白(trp)溶于10ml去离子水中，，搅拌下依次加入1.0mlcucl2水溶液(0.2mol/l)、0.5mlnaoh溶液(1mol/l)。搅拌下加入新制4mlnadtc水溶液(0.2mol/l)，继续搅拌1小时后，转移至截留分子量为10000da的透析袋中透析24小时，外部介质为超纯水。透析结束后，过滤除去不溶物，冷冻干燥，制得cu(dtc)2转铁蛋白纳米粒，粒径为27～51nm，载药量为22.5％。实施例11将250mg辣根过氧化物酶(hrp)溶于10ml去离子水中，，搅拌下依次加入1.0mlcucl2水溶液(0.2mol/l)、0.5mlnaoh溶液(1mol/l)。搅拌下加入新制4mlnadtc水溶液(0.2mol/l)，继续搅拌1小时后，转移至截留分子量为10000da的透析袋中透析24小时，外部介质为超纯水。透析结束后，过滤除去不溶物，冷冻干燥，制得cu(dtc)2转铁蛋白纳米粒，粒径为31～55nm，载药量为21.8％。当前第1页12当前第1页12