一种口服降糖肽在制备治疗或预防糖尿病并发心血管疾病药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种口服降糖肽在制备治疗或预防糖尿病性心肌病药物中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术：

糖尿病是一种在遗传易感基础上，由多种内外因素相互作用导致不同程度胰岛素分泌相对不足引起的、以高血糖和胰岛素抵抗为特征的慢性代谢疾病。截至2017年，全球糖尿病患者高达4.25亿，如果不采取任何措施，预计到2045年，患有糖尿病的人数可能会上升到6.29亿，所以糖尿病已经成为一个日益严重的全球健康问题。糖尿病患者大多死于糖尿病并发症，其中糖尿病患者并发心血管疾病具有很高的死亡风险，比一般人高2-4倍，占相关死亡率的65％。糖尿病心肌病(diabeticcardiomyopathy，dcm)是主要的心血管并发症，其独立于冠状动脉疾病或高血压等心血管疾病，是心肌结构和功能异常的心肌疾病。

糖尿病心肌病的发病机制十分复杂，尚未完全阐明，目前的研究显示主要包括糖脂代谢紊乱，胰岛素抵抗，炎症反应，氧化应激，内质网应激，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(raas)和交感神经系统的激活等。尽管研究者们对糖尿病心肌病复杂的病理生理过程已经有所研究，但在临床实践中还没有用于指导治疗的具体策略。目前，降低血糖水平仍是糖尿病心肌病治疗方案的基础，但是在糖尿病发展后期，由于多因素的共同作用，单纯控制血糖对大血管并发症的作用很有限，所以还需要辅以降压治疗，调脂治疗和抗血小板治疗等。

从2008年起，美国fda和欧洲药品管理局要求所有新申请上市的降糖药物强制进行心血管结局试验，以评估其对心血管的影响。研究结果表明，部分降糖药物可以改善心血管健康，超出了它们的血糖控制能力，其中就包括利拉鲁肽和索玛鲁肽等多肽类药物、以及恩格列净等钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂类药物。利拉鲁肽和索玛鲁肽均为诺和诺德公司开发的脂肪酸修饰的多肽产品，在临床研究中，利拉鲁肽显著降低了严重心血管事件的死亡风险，而索玛鲁肽治疗降低了合并的主要结局包括心血管死亡、非致死性心肌梗死和非致死性卒中。恩格列净是一种可以口服的化药，它主要通过抑制肾小管对葡萄糖的重吸收达到降糖效果，其临床试验结果显示，与安慰剂相比，恩格列净可降低心血管疾病的相对风险，并可减少因心力衰竭住院的风险，但是恩格列净可能使下肢截肢和糖尿病酮症酸中毒的风险增加2倍。与之相比，多肽类降糖药物的副作用较少，适合于长期用药的糖尿病患者，但由于多肽类药物体内稳定性差，需要频繁注射，这样不仅增加了患者的学习成本，而且长期重复注射也会给患者带来了诸多痛苦，即使是艾塞那肽周制剂，病人依从性也没有明显改善。因此，开发口服给药的降糖多肽一直以来都是研发的热点。

以艾塞那肽及其类似物为代表的多肽类降糖药物是近年来研发的热点。艾塞那肽注射液已于2005年经美国fda批准上市，在众多的研究中显示出有益的降血糖和心脏保护作用。临床研究表明，艾塞那肽有良好的降血糖以及减重效果，并且可以降低心力衰竭复发的风险；另外，艾塞那肽还可减少st段抬高心肌梗死患者的再灌注损伤。也有临床前研究发现，艾塞那肽可以通过抑制rock/pparα通路介导的心脏脂质堆积和脂质毒性改善糖尿病小鼠的结构和功能异常。

以艾塞那肽及其类似物为代表的这一类降糖药物，因具有低血糖风险小、延缓胃排空、降低体重、心血管和肾脏的保护作用等诸多优势，是极为理想的一类降糖药物。然而，这并不表示此类降糖药物中的每个具体药物都具有心肌保护作用。

目前，糖尿病心肌病没有特定的治疗指南，以艾塞那肽为代表的兼具降糖与心脏保护作用的药物受到广泛关注，但是有研究发现有的艾塞那肽突变体并没有明显的心血管收益，利西拉来就是其中具有代表性的一个药物。

利西拉来是将艾塞那肽羧基端的脯氨酸去除并添加了六个赖氨酸，在与艾塞那肽的头对头研究中，其在降血糖和糖化血红蛋白方面与艾塞那肽相当，在临床中有良好的降糖效果，但在减重方面不如艾塞那肽。而在评价利西拉来心血管效应的临床试验中，利西拉来未能表现出良好的结果，与安慰剂相比，其在心血管事件或住院治疗方面没有显著差异。以上研究结果表明，并不是所有的艾塞那肽突变体都一定会具备与艾塞那肽相似的心肌保护作用，所以亟待开发具有心肌保护作用的艾塞那肽类似物。

发明人及其课题组在本领域已经获得了一些研究成果，先后于2013年12月17日申请了专利号cn201310694475.0、授权公告号cn103665148b的中国发明专利，于2017年09月11日申请了申请号cn201710810530.6、申请公布号cn109485720a的中国发明专利申请，并于2019年08月14日申请了申请号cn201910747519.9、申请公布号cn110437329a的中国发明专利申请。目前发明人已在进一步研究中获得了新的成果。

技术实现要素：

本发明的目的在于：根据发明人最新的研究成果，提出一种口服降糖肽在制备治疗或预防糖尿病并发心血管疾病药物中的应用。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

一种口服降糖肽的用途，其特征是，所述用途为用于制备治疗或预防糖尿病并发心血管疾病的药物或药物组合物；

所述口服降糖肽的氨基酸序列为：

his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-ser-gln-met-glu-glu-glu-ala-val-lys-glu-phe-ile-glu-trp-leu-val-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-cys。

优选地，所述糖尿病并发心血管疾病为糖尿病心肌病。

优选地，所述糖尿病心肌病为ⅰ型或ⅱ型糖尿病引发的心肌病。

优选地，所述药物或药物组合物的剂型为经胃肠道给药剂型。

优选地，所述药物或药物组合物包括载体，所述载体为药学上可接受的载体。

优选地，所述口服降糖肽经固相合成获得。

本发明涉及的口服降糖肽为申请号cn201910747519.9、申请公布号cn110437329a的中国发明专利申请中具体实施方式记载的多肽ohp2。本发明的发明人在对该多肽做进一步研究后发现，该多肽能有效改善糖尿病引起的心肌肥大以及纤维化损伤、降低相关心肌酶的含量，还能调节脂代谢水平、改善心肌细胞氧化应激和线粒体损伤，从而发挥保护心脏的作用，因此该多肽可作为治疗或预防糖尿病并发心血管疾病(尤其是糖尿病心肌病)的候选分子，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例2的血糖及体重变化监测结果图。

图2为本发明实施例3超声心动图检测的结果图。

图3为本发明实施例4的心肌肥大检测结果图。

图4为本发明实施例5的心肌纤维化检测结果图。

图5为本发明实施例6的血清中心肌酶检测结果图。

图6为本发明实施例7的心脏脂质沉积检测结果图。

图7为本发明实施例8的心脏氧化应激检测结果图。

图8为本发明实施例9的线粒体损伤检测结果图。

具体实施方式

下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。各实施例中，所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂和材料如无特别说明均为市售品。

实施例1

本实施例为糖尿病心肌病大鼠模型的建立及分组。

具体过程如下：

第一步：将56只雄性wistar大鼠适应性喂养一周后，随机选择8只作为control组且全程予以普通饲料喂养，其余大鼠作为造模组予以高脂饮食4周后，按照15mg/kg的剂量连续三周腹腔注射stz溶液(由链脲佐菌素stz溶于ph4.5、0.1mol/l的枸橼酸缓冲液中制得)，同时control组则给予相应体积的ph4.5、0.1mol/l枸橼酸缓冲液。一周后将造模组大鼠经断尾取血用血糖仪测量空腹血糖，以空腹血糖＞11.1mmol/l作为造模成功的标准，将不合格的大鼠剔除，合格的大鼠继续予以高脂饮食4周。

第二步：将造模组大鼠分成6组：索玛鲁肽组(semaglutide)、恩格列净组(empagliflozin)、ohp2高剂量组、ohp2中剂量组、ohp2低剂量组、模型组(vehicle)，其中索玛鲁肽和恩格列净为阳性对照药。这6组大鼠与第一步的control组大鼠一共为7组大鼠。

具体而言，索玛鲁肽予以皮下注射给药，剂量为12μg/kg，一天一次；恩格列净为灌胃给药，剂量为10mg/kg，一天一次；ohp2为灌胃给药，高、中、低剂量分别为1.48mg/kg、0.74mg/kg和0.37mg/kg，一天两次；模型组予以空白溶媒，各组给药周期均为八周；control组为pbs溶液灌胃，一天两次。

ohp2即为本发明涉及的口服降糖肽，其氨基酸序列为：

his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-ser-gln-met-glu-glu-glu-ala-val-lys-glu-phe-ile-glu-trp-leu-val-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-cys。

实施例2

本实施例为ohp2在糖尿病大鼠治疗过程中血糖及体重变化监测。

动物分组及给药方案如实施例1所示。连续八周给药期间每周测量空腹血糖，每天记录大鼠体重变化，并进行统计学分析。

结果如图1所示。其中，空腹血糖变化如图1的a图所示，control组空腹血糖在给药期间均低于其他各组；给药八周结束后，相比vehicle模型组，ohp2高中剂量组、恩格列净组以及索玛鲁肽组的空腹血糖均有显著降低，该结果表明ohp2能够有效控制糖尿病大鼠的空腹血糖值。

大鼠体重变化如图1的b图所示，经过八周治疗后，相比vehicle模型组，ohp2高剂量组和索玛鲁肽组的大鼠体重有较为明显的降低，ohp2中低剂量组有抑制了体重增加的趋势，说明ohp2能够有效降低糖尿病引起的体重增加。

实施例3

本实施例为ohp2对糖尿病大鼠心脏功能的影响。

动物分组及给药方案如实施例1所示。在给药第八周末，利用超声心动图检测大鼠心脏功能，具体过程如下：

第一步：先将大鼠放入密封的麻醉箱，异氟烷吸入麻醉，仰卧位固定。

第二步：用棉签蘸取适量脱毛膏于大鼠前胸涂抹均匀，利用刮刀将胸前毛发脱掉。

第三步：大鼠四肢涂抹少量的导电液并固定在心电感应模块上，然后心前区涂抹适量超声耦合剂，调整位置结合探头手柄找到心脏图像，收集图像并处理数据。

心脏功能检测的结果如图2的a图所示，vehicle模型组大鼠左心室心功能存在异常，各给药组均有一定改善。

左心室射血分数(lvef)的测定结果如图2的b图所示，与control组相比，vehicle模型组大鼠左室射血分数出现明显下降，经过八周治疗，ohp2各剂量组以及阳性药组均能有效提高左室射血分数。

同样的，左心室短轴缩短分数(lvfs)的测定结果如图2的c图所示，与control组相比，vehicle模型组大鼠左室短轴缩短分数出现明显下降，经过八周治疗，ohp2各剂量组以及阳性药组均能有效提高左室短轴缩短分数。

以上这些结果表明，ohp2对糖尿病引发的心功能异常有一定的改善作用。

实施例4

本实施例为ohp2对糖尿病大鼠心肌肥大的影响。

动物分组及给药方案如实施例1所示。

第一步：给药八周结束后用游标卡尺测量大鼠的胫骨长，结合超声心动图的分析结果计算左室心胫比。

第二步：随后将大鼠处死，分离心脏组织，冻存于液氮中，用于后续qrt-pcr检测心肌肥大相关基因。

第三步：剪刀取下约20mg心脏组织置于研钵中，用液氮充分研磨为细粉状，再利用全式金的rna提取试剂盒提取总rna，并测定rna浓度。

第四步：用逆转录试剂盒将rna逆转录为cdna，再根据下表所设计的引物序列进行qpcr检测，其中β-actin为内参。注：本实施例采用相应的市售试剂盒。

大鼠左室心胫比的结果如图3的a图所示，与control组相比，vehicle模型组大鼠左室心胫比有明显的提高，证明已经出现了心肌肥大的状况；经过八周治疗后，ohp2高中剂量组和阳性药组均能降低左室心胫比，几乎达到了正常水平。

qrt-pcr检测心脏心肌肥大相关基因anp和β-mhc的结果如图3的b图所示，ohp2高剂量和阳性药组的anp表达量均有所降低，ohp2各组及索玛鲁肽组的β-mhc表达量有所降低。

以上结果说明ohp2对糖尿病引发的心肌肥大有一定的改善作用。

实施例5

本实施例为ohp2对糖尿病大鼠心肌纤维化影响。

动物分组及给药方案如实施例1所示。

第一步：给药八周结束后，将大鼠处死，取心脏组织，置生理盐水中挤出多余血水，在4％的中性甲醛固定48h。经石蜡包埋切片后，进行masson三色法染色，用光学显微镜观察切片。

第二步：qrt-pcr的检测心肌纤维化相关基因的方法参照实施例4，引物序列如下表所示。

大鼠心脏masson染色的结果如图4的a图所示，与control组相比，vehicle模型组大鼠心肌纤维化明显，心肌间质胶原沉积多。经过治疗后，ohp2和阳性药组均能减少心脏组织masson阳性面积区域。

qrt-pcr检测心肌纤维化相关基因tgfβ和collagen1的结果如图4的b图所示，与control组相比，vehicle模型组tgfβ和collageni的mrna表达水平显著提高，证明了心肌纤维化的发生。经过治疗后，只有ohp2高剂量组可以降低tgfβ的表达量，但是ohp2各剂量组和恩格列净组collageni的mrna表达水平均有所下降。

以上结果说明，ohp2对糖尿病引发的心肌纤维化有改善作用。

实施例6

本实施例为ohp2对糖尿病大鼠血清中心肌酶影响。

动物分组及给药方案如实施例1所示。

第一步：在给药第八周末，大鼠禁食过夜，第二天眼眶静脉丛取血。

第二步：将血样在室温静置半小时后，3000rpm离心10min，将所得血清分装保存于-20℃冰箱。

第三步：参照试剂盒说明书分别测定血清中心肌酶ldh和ck-mb的活力。注：本实施例采用相应的市售试剂盒。

血清中ldh的检测结果如图5的a图所示，与vehicle模型组相比，ohp2高剂量以及阳性药组均能降低血清中ldh的活力；相似地，血清中ck-mb的检测结果如图5的b图所示，与vehicle模型组相比，ohp2高剂量以及索玛鲁肽组能降低血清中ck-mb的活力。

以上结果说明，ohp2对心肌损伤引起的心肌酶含量升高有一定的改善作用。

实施例7

本实施例为ohp2对糖尿病大鼠心脏脂质沉积的影响。

动物分组及给药方案如实施例1所示。

第一步：给药八周结束后，将大鼠处死，取心脏组织，置于液氮中冻存。随后进行新鲜冰冻切片固定，经油红和苏木素染色后用光学显微镜观察切片。

第二步：剪下部分冰冻的组织，按质量体积比1∶9加生理盐水，匀浆后12000rpm离心10min收集上清液。根据试剂盒中的说明分别测定上清液中甘油三酯、总胆固醇和游离脂肪酸的含量。注：本实施例采用相应的市售试剂盒。

油红染色的结果如图6的a图所示，与control组相比，vehicle模型组大鼠心脏组织出现了明显的中性脂肪沉积，ohp2和阳性药组均有所改善；心脏组织中甘油三酯含量测定结果如图6的b图所示，ohp2与阳性药索玛鲁肽都能改善心脏组织中甘油三脂的沉积；总胆固醇的测定结果如图6的c图所示，相比vehicle模型组，ohp2能降低心脏组织中总胆固醇的含量，且接近正常水平，而两个阳性药作用并不明显；游离脂肪酸的测定结果如图6的d图所示，ohp2高中剂量对心脏组织中游离脂肪酸有一定的作用控制。

以上结果说明，ohp2对调节心肌细胞脂质代谢和减少心脏脂质沉积有一定的优势。

实施例8

本实施例为ohp2对糖尿病大鼠心脏氧化应激的影响。

第一步：参照实施例7中的第二步，根据试剂盒中的说明检测心脏组织匀浆上清液中氧化应激标志物丙二醛的含量。注：本实施例采用相应的市售试剂盒。

第二步：qrt-pcr的检测心脏相关抗氧化酶基因的方法参照实施例4，引物序列如下表所示。

心脏组织中丙二醛检测结果如图7的a图所示，与control组相比，vehicle模型组大鼠心脏组织中丙二醛含量有明显升高，说明了心脏组织处于高氧化应激水平的状态，经过八周治疗，ohp2和索玛鲁肽能够降低心脏中丙二醛的含量；qrt-pcr检测心脏相关抗氧化酶基因sod1、gpx1和ho-1的结果如图7的b图所示，ohp2高剂量和阳性药均能显著提高gpx1和ho-1的表达量，对sod1的表达量均没有影响。

以上结果说明，ohp2对心脏组织氧化应激水平有一定的控制作用，ohp2可能通过调节氧化应激通路保护心脏。

实施例9

本实施例为ohp2对糖尿病大鼠线粒体损伤的影响。

动物分组及给药方案如实施例1所示。

第一步：给药八周结束后处死大鼠，取出心脏组织，立刻剪下1-2mm³的组织块，置于2.5％戊二醛中，于4度保存。经锇酸固定、渗透包埋和铀铅双染色后，利用透射电镜进行观察并收集图像。

第二步：剪下一小块液氮中保持的心脏组织，按质量体积比1∶9加裂解液，匀浆后收集上清液，根据试剂盒中的说明检测上清液中atp的含量。注：本实施例采用相应的市售试剂盒。

透射电镜的结果如图8的a图所示，与control组相比，vehicle模型组大鼠心脏组织中线粒体排列紊乱，线粒体面积减小，说明线粒体发生分裂，而ohp2和阳性药组心脏组织中线粒体排列较为规律，而且平均面积有所增大。心脏组织中atp含量检测的结果如图8的b图所示，与vehicle模型组相比，ohp2高剂量和索玛鲁肽组都能提高心脏组织中atp含量，说明线粒体功能有所改善。

以上结果说明，ohp2对糖尿病大鼠心脏组织线粒体损伤有一定的改善作用。

综合以上各实施例的结果可知，口服降糖肽ohp2能有效改善糖尿病引起的心肌肥大以及纤维化损伤，降低相关心肌酶的含量，能调节脂代谢水平，能改善心肌细胞氧化应激和线粒体损伤，从而发挥保护心脏的作用；而且口服降糖肽ohp2能降低空腹血糖值以及体重。因此，口服降糖肽ohp2作为一种新型的可口服施用的艾塞那肽类似物，可用于制备治疗或预防糖尿病并发心血管疾病药物或药物组合物，具有良好的应用前景。其中，糖尿病并发心血管疾病可为糖尿病心肌病，例如ⅰ型或ⅱ型糖尿病引发的心肌病；药物或药物组合物的剂型为经胃肠道给药剂型；药物或药物组合物包括载体，且载体为药学上可接受的载体。此外，口服降糖肽ohp2可以经固相合成获得。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。