一种铁线莲中总皂苷的提取方法与流程

本发明涉及天然有机化学技术领域，尤其涉及一种铁线莲中总皂苷的提取方法。

背景技术：

铁线莲属(clematis)为毛茛目毛茛科多年生木质藤本植物，以其根及根茎入药，又名“威灵仙”，为我国常用大宗中药材，研究表明，其根茎提取物具有抗氧化、降血压、降血糖、通络止痛、免疫抑制、利胆、利尿、松弛平滑肌等功效，被誉为“藤本植物皇后”。铁线莲属植物全世界共有230余种，分布于北温带，我国有108种，主要在西南区和华中区西部分布。秦岭因其得天独厚的地理地貌，丰富多样的土壤环境以及独特的气候特征，成为众多药用植物的适生区，铁线莲属植物资源极其丰富。有研究表明：在秦岭山区发现了曲柄铁线莲，甘青铁线莲，大瓣铁线莲，陕西铁线莲等22种及变种铁线莲属植物资源的自然分布。

陕西铁线莲(clematisshensiensisw.t.wang)为毛茛科铁线莲属多年生落叶藤本植物。枝圆柱形，具疏毛，干后绿色，有明显的纵条纹，基部无鳞片。羽状复叶，长13-18cm；小叶5片，卵圆形，纸质，长3-7cm，宽2-4cm，叶端短渐尖，叶基心形或截形，全缘，表面被疏短毛，背面密被短柔毛。花白色，直径3-5cm，萼片通常4，开展，倒披针形或倒披针状线形，长1.5-2.5cm，外面除边缘具白色绒毛外，中间被短毛，内面无毛；3-7朵形成聚伞花序，顶生或腋生；总花梗长6-10cm，被短毛，具2片叶状总苞；花梗长3-4cm，密被绢毛，中部有2片线性或全裂的苞片；雄蕊长达1cm，花丝线形，具明显的中脉、无毛，花药线形，无毛，先端微具短尖头；雌蕊多数，密被柔毛；花柱具淡褐色的羽毛。花期六月，果期不详。产秦岭南北坡陕西的终南山、华山、太白山等；生于海拔1200米左右的山坡上。

作为我国特有种，陕西铁线莲以陕西为主要分布区域。除陕西外在湖北、河南和山西等地均有分布，常见于1200米海拔处的山坡，沟壑或石壁上生长。位于陕西东南部的商洛是一个横跨长江和黄河两大流域以中低山脉为主导的土石山区。地势西北高，东南低，平均海拔900米，有三种类型的地貌：河谷，低山和中山坡槽。由于秦岭对东南季风的阻挡作用，形成了秦岭北侧为暖温带半湿润气候，南侧为北亚热带湿润气候，正是这独特的气候土壤，复杂多变的地形地貌，加上森林覆盖率高，冬无严寒，夏无寒冷，四季分明，雨热同季，使商洛成为许多药用植物资源的主要适生区之一，其中铁线莲属植物就是一大类。

铁线莲属植物的化学成分研究表明，其根茎中含有皂苷类、黄酮类、生物碱类、香豆素类和木脂素类、挥发性成分以及多种微量元素。铁线莲属根茎中所含皂苷主要是五环三萜类皂苷，齐墩果酸和常春藤是其主要的皂苷元，少数为乌苏烷型、蒲公英赛烷型等，葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和核糖是其所结合的主要的糖类。fu等在2013年分离出了3个新的齐墩果烷型三萜皂苷化合物，从威灵仙干燥根茎的醇提物中。tian等从毛蕊铁线莲(c.lasiandra)全草中分离鉴定得到了7个三萜皂苷类化合物，其中有4个齐墩果烷型三萜皂苷是新的化合物。目前皂苷的提取工艺主要有水提法、醇提法、超声提取法、微波辅助提取法、co2超临界萃取技术和超高压提取技术，但是传统的水提、醇提法虽然方法简单，经济，对人员及设备要求低，但得率较低；而超临界co2萃取、超高压等提取方法虽然得率高，但方法复杂，对人员及设备要求高，进行工厂化生产有一定难度。

技术实现要素：

针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种铁线莲中总皂苷的提取方法，针对陕西铁线莲，可以提高总皂苷的提取率。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种铁线莲中总皂苷的提取方法，其特征在于，包括以下步骤，

s1：将新鲜的陕西铁线莲根茎进行预处理，得到脱脂药渣；

s2：对脱脂药渣进行醇+超声提取，得到总皂苷提取液；

s3：对总皂苷提取液中的总皂苷提取率进行测定。

进一步的，步骤s1的具体操作包括，

s11：将新鲜的陕西铁线莲根茎晒干、粉碎成药材粉末；

s12：在药材粉末中加入石油醚进行脱脂，所述药材粉末与石油醚的料液比为1:4～1:6，水浴加热回流；

s13：在步骤s12水浴加热回流得到的滤渣中再加入料液比为1:4～1:6的石油醚，进行二次水浴加热回流；

s14：将步骤s13中二次水浴加热回流后得到的滤渣过40目筛，得到脱脂药渣，干燥保存备用。

进一步的，步骤s12和步骤s13中的料液比均为1:5。

进一步的，所述水浴加热回流和二次水浴加热回流的水浴加热温度为80℃，加热回流的时间为2h。

进一步的，步骤s2具体操作包括，

s21：在脱脂药渣中加入浓度为70％的乙醇一次加热回流，得到一次提取液；脱脂药渣与70％乙醇的的料液比为1:45～1:55；

s22：将一次提取液进行一次超声提取，得到一次超声滤液和一次超声滤渣；

s23：在一次超声滤渣中加入浓度为70％的乙醇进行二次加热回流和二次超声提取，得到二次超声滤液和二次超声滤渣；一次超声滤渣与70％乙醇的的料液比为1:45～1:55；

s24：将一次超声滤液和二次超声滤液混合后离心，取上清液即为总皂苷提取液。

进一步的，步骤s21中脱脂药渣与70％乙醇的的料液比为1:50，步骤s23中一次超声滤渣与70％乙醇的的料液比也为1:50。

进一步的，所述一次加热回流和二次加热回流的温度均为65℃，回流时间均为2h。

进一步的，所述一次超声提取和二次超声提取的超声温度为65℃，超声提取时间为50min。

进一步的，步骤s3的具体操作为，

s31：取1mg齐墩果酸标准品，用无水乙醇配成1mg/ml母液；

s32：分别精密移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml母液，配制成0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml的溶液，加入七支干燥具塞磨口试管中，水浴挥干溶剂；

s33：在七支试管中分别加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.4ml，高氯酸1.6ml，于70℃恒温水浴加热20min；

s34：将水浴加热后的试管流水冷却3min，再加入冰醋酸5ml，摇匀，无水乙醇作为空白对照，于542nm处测定吸光度；

s35：以齐墩果酸的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程；

s36：配制总皂苷提取液溶液，在波长542nm处测定吸光度值，利用步骤s35中的回归方程求得皂苷提取液溶液中皂苷滤液稀释后浓度c；

s37：利用总皂苷的提取率公式计算陕西铁线莲中总皂苷的提取率；

其中，w：陕西铁线莲总皂苷的提取率(％)；

c：皂苷滤液稀释后浓度；

v：滤液的体积/ml；

n：稀释倍数；

m：陕西铁线莲粉末质量/g。

本发明的有益效果是：

1、本发明的铁线莲中总皂苷提取方法针对陕西铁线莲，先对陕西铁线莲进行了预处理，采用石油醚进行脱脂，然后利用醇+超声提取的方法，能够显著提高陕西铁线莲中总皂苷的提取得率。

2、本发明的铁线莲中总皂苷提取方法针对陕西铁线莲预处理和醇+超声提取过程中的具体工艺参数进行了优化，利用该提取工艺参数对陕西铁线莲中的总皂苷进行提取，可以提高铁线莲中总皂苷的提取率。

3、本发明针对陕西铁线莲中总皂苷的提取方法植根于商洛当地社会经济发展现状，前期投入小，对设备、人员要求较低，得率较高，具有绿色、经济、高效等特点，也比较容易进行工厂化生产，非常适合地方发展水平；对商洛药用植物资源的可持续发展、“药业兴市”战略实施以及国家精准扶贫战略的实施都有其重要的现实意义，对类似商洛的经济欠发达地区，尤其是老少边穷地区的产业发展都有一定借鉴价值。

附图说明

图1为本发明中将新鲜的陕西铁线莲根茎进行预处理的操作流程图；

图2为本发明中对脱脂药渣进行超声提取的操作流程图；

图3为本发明中齐墩果酸与吸光度关系的标准曲线；

图4为本发明实施例一中醇+超声提取过程中乙醇浓度对陕西铁线莲中皂苷提取率的影响；

图5为本发明实施例一中醇+超声提取过程中超声时间对陕西铁线莲皂苷提取率的影响；

图6为本发明实施例一中醇+超声提取过程中提取温度对陕西铁线莲皂苷提取率的影响；

图7为本发明实施例一中醇+超声提取过程中料液比对陕西铁线莲皂苷提取率的影响；

图8为本发明实施例三中预处理过程中料液比对陕西铁线莲皂苷提取率的影响；

图9为本发明实施例三中预处理过程中加热回流温度对陕西铁线莲皂苷提取率的影响；

图10为本发明实施例三中预处理过程中加热回流时间对陕西铁线莲皂苷提取率的影响。

具体实施方式

为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。

实施例一：

如附图1和附图2所示，以陕西商洛地区的陕西铁线莲为例，进行总皂苷的提取，包括以下步骤，

s1：将新鲜的陕西铁线莲根茎进行预处理，得到脱脂药渣；

具体的，s11：将新鲜的陕西铁线莲根茎晒干、粉碎成药材粉末；

s12：取干燥的药材粉末5g，在药材粉末中加入石油醚，所述药材粉末与石油醚的料液比为1:5，水浴加热回流；所述水浴加热回流的水浴加热温度为80℃，加热回流的时间为2h；

s13：将步骤s12中加热回流得到的滤渣进行二次水浴加热回流；所述二次水浴加热回流的水浴加热温度为80℃，加热回流的时间为2h；

s14：将步骤s13中二次水浴加热回流后得到的滤渣过40目筛，得到脱脂药渣，放置在玻璃瓶中进行干燥保存备用。

s2：对脱脂药渣进行醇+超声提取，得到总皂苷提取液；

具体的，s21：取2g脱脂药渣，在脱脂药渣中加入浓度为70％的乙醇一次加热回流，得到一次提取液；

所述一次加热回流的温度均为65℃，回流时间均为2h；

脱脂药渣与70％乙醇的的料液比为1:50；

s22：将一次提取液进行一次超声提取，得到一次超声滤液和一次超声滤渣；

所述一次超声提取的超声温度为65℃，超声提取时间为50min；

s23：在一次超声滤渣中加入浓度为70％的乙醇进行二次加热回流和二次超声提取，得到二次超声滤液和二次超声滤渣；

二次加热回流的的温度均为65℃，回流时间均为2h；

二次超声提取的超声温度为65℃，超声提取时间为50min；

s24：将一次超声滤液和二次超声滤液混合后离心，取上清液即为总皂苷提取液。

s3：对总皂苷提取液中的总皂苷提取率进行测定。

具体的，s31：取1mg齐墩果酸标准品，用无水乙醇配成1mg/ml母液；

s32：分别精密移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml母液，配制成0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml的溶液，加入七支干燥具塞磨口试管中，水浴挥干溶剂；

s33：在七支试管中分别加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.4ml，高氯酸1.6ml，于70℃恒温水浴加热20min；

s34：将水浴加热后的试管流水冷却3min，再加入冰醋酸5ml，摇匀，无水乙醇作为空白对照，于542nm处测定吸光度；

s35：以齐墩果酸的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，结果如附图3所示，求得回归方程为y＝0.1986x+0.0183，r²＝0.9890，其中y为吸光度，x齐墩果酸的浓度，单位为：mg/ml。

s36：配制总皂苷提取液溶液，取皂苷提取液1ml于10ml容量瓶中(稀释10倍)，再从10ml容量瓶中取出1ml，加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.4ml，高氯酸1.6ml，于70℃恒温水浴加热20min；将水浴加热后的试管流水冷却3min，再加入冰醋酸5ml，摇匀，在波长542nm处测定吸光度值，利用步骤s35中的回归方程求出x，即为皂苷提取液溶液中皂苷滤液稀释后浓度c；

s37：利用总皂苷的提取率公式计算陕西铁线莲中总皂苷的提取率；

其中，w：陕西铁线莲总皂苷的提取率(％)；

c：皂苷滤液稀释后浓度；

v：滤液的体积/ml，该实施例中为步骤s2中提取的总皂苷提取液的体液；

n：稀释倍数，10；

m：陕西铁线莲粉末质量/g,该实施例中干燥药材粉末质量为5g。

进一步的，该实施例中还对醇+超声提取过程中的不同工艺参数进行了优化实验，具体为：

1.1控制一次加热回流和二次加热回流的料液比为1：10，超声提取温度70℃、超声提取时间40min，分别研究在乙醇浓度为55％、65％、75％、85％、95％对陕西铁线莲中皂苷提取率的影响，结果如表1和附图4所示。

表1不同乙醇浓度对总皂苷提取率的影响

由表1和图4可知，在乙醇质量分数为55％-75％之间，陕西铁线莲中皂苷提取率随着乙醇浓度的升高而增大，当乙醇质量分为75％时皂苷的提取率最高，可能是因为陕西铁线莲中皂苷极性比较接近质量分数为75％乙醇的极性；之后随着乙醇浓度逐渐增大，皂苷提取率反而降低，可能是陕西铁线莲中的一些杂质也溶于乙醇，从而导致皂苷提取率下降。故本实验选取乙醇质量分数70％、75％、80％进行正交试验分析。

1.2控制乙醇质量分数95％、提取温度70℃、料液比1：10，分别研究超声时间为20、30、40、50、60min条件下对陕西铁线莲中皂苷提取率的影响，结果如表2和附图5所示。

表2不同超声提取时间对总皂苷提取率的影响

由表2和图5可知，在20-50min范围内陕西铁线莲皂苷提取率明显增大，在50min时提取率最高，达到1.560％，但当提取的时间大于40min时，皂苷提取率升高相对平缓，这是因为陕西铁线莲中的皂苷已基本提出，延长超声时间非但对实验的提取率没有任何效果，反而使实验所需更多的时间。出于实验的可操作性，故选取超声时间45min、50min、55min进行正交试验分析。

1.3控制乙醇质量分数95％、料液比1：10、超声时间40min，分别研究在提取温度为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的条件下对陕西铁线莲中皂苷提取率的影响，结果如表3和图6所示。

表3不同超声提取温度对总皂苷提取率的影响

由表3和图6可知，在50℃～70℃之间陕西铁线莲中总皂苷的提取率随着提取温度的升高而逐渐增大，因为温度升高，分子运动加快，导致细胞破裂速度加快，进一步使陕西铁线莲中总皂苷的溶解及扩散速度加快，提取率升高。提取温度在70℃时，陕西铁线莲中总皂苷的提取率最高。之后随着温度的升高皂苷的提取率反而下降，可能是因为温度越高，陕西铁线莲中热敏成分受到了破坏，故选超声温度65℃、70℃、75℃进行正交试验分析。

1.4控制乙醇质量分数95％、超声时间40min、设置超声温度70℃，分别研究在料液比为1：10、1：30、1：50、1：70、1：90条件下对陕西铁线莲中皂苷提取率的影响，结果如表4和图7所示。

表4不同料液比对总皂苷提取率的影响

由表4和图7可知，料液比的选择以及溶剂的用量会直接影响皂苷类化合物的提取率，这也是在工业化生产过程不可低估的一项经济指标，以刚好能浸没原料的最少乙醇用量为基础，不同料液比的提取效果，结果表明皂苷提取率随溶剂量增加而增加，当料液比超过1：50后，提取率增加的幅度不大，甚至有下降的趋势，因此取料液比为1：50为标准进行正交试验分析。

1.5基于3.1-3.4单因素的试验结果，确定以乙醇质量分数/％、超声时间/min、提取温度/℃三个对陕西铁线莲总皂苷提取工艺影响的因素作为考察对象，以皂苷得率作为考察指标，进行l9(3³)正交试验，因素与水平如表5所示。

表5单因素与水平

制备9份相同的脱脂药渣样品，分别按表5进行正交试验设计，以皂苷得率为考察指标进行直观分析，结果如表6。

表6正交试验设计直观分析表

注：k为因素某-水平结果之和平均值；r为各因素某-水平结果的极差。

陕西铁线莲提取总皂苷正交试验显著性分析结果如表7所示。

表7正交试验显著性分析结果

因变量：皂苷得率％

由正交试验数据分析可知，影响陕西铁线莲总皂苷提取效果的因素，按大小为超声时间、乙醇浓度、提取温度，最佳的提取条件为：a1b2c1，即乙醇浓度70％、超声时间50min、提取温度65℃、料液比1:50。经验证试验，此条件下得到的陕西铁线莲总皂苷得率为2.42％。

实施例二：

该实施例中铁线莲中总皂苷提取方法的操作步骤与实施例一的区别之处在于未对陕西铁线莲进行预处理，直接进行醇+超声提取，最终得到的总皂苷提取率的均值与实施例一中总皂苷提取率的均值对比情况如表8所示。

表8实施例二与实施例一中总皂苷提取得率均值情况对比

从表8中可以看出，将陕西铁线莲进行预处理后再进行醇+超声提取，其总皂苷提取的得率相对于直接进行醇+超声提取总皂苷提取的得率要高出0.76％，这是由于使用石油醚进行预处理可以脱去药材里面的脂类，有效去除杂质，提高皂苷的得率。

实施例三：

该实施例中铁线莲总皂苷提取方法的操作步骤与实施例一相同，不同之处在于步骤s1中对新鲜陕西铁线莲根茎进行预处理过程中水浴加热回流的料液比、回流温度和回流时间；具体为：

分别称取铁线莲干燥粉末5.00g，进行脱脂脱脂预处理，脱脂处理后，按实施例一中的具体操作进行醇+超声提取，设定乙醇浓度70％，料液比为1：10，提取温度70℃、超声提取时间40min，提取后，减压抽滤，滤液做皂苷含量测定，根据公式计算得率。

3.1控制预处理中加热回流时间为2h、加热回流温度为70℃，分别研究在料液比为1：3、1：4、1：5、1：6条件下对陕西铁线莲中皂苷提取率的影响，结果表9和附图8所示。

表9预处理过程中不同料液比对总皂苷提取率的影响

结合表9和附图8可以看出，当料液比为1：5时，提取率达到极值1.80，此后再增加料液比，提取率增加的幅度不大，甚至有下降的趋势，因此以1:5料液比较为合适。

3.2控制预处理中加热回流的料液比1:4，回流时间为2h，分别研究在加热回流温度在60℃、70℃、80℃、90℃时对陕西铁线莲中皂苷提取率的影响，结果如表10和附图9所示。

表10预处理过程中不同回流温度对总皂苷提取率的影响

结合表10和附图9可以看出，温度在80℃时，陕西铁线莲中总皂苷的提取率最高，之后随着温度的升高皂苷的提取率反而下降，因此选择80℃合适。

3.3预处理中加热回流的料液比1:4、回流温度为80℃，分别研究在加热回流时间为1h、2h、3h、4h时对陕西铁线莲中皂苷提取率的影响，结果如表11和附图10所示。

表11预处理过程中不同回流温度对总皂苷提取率的影响

结合表11和附图10可以看出，当加热回流时间达到2h时，提取率达到极值，此后再延长提取时间，总皂苷的提取率相对平缓，甚至有下降的趋势，本着经济的原则，选择2h最为合适。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。