Surf4蛋白及其基因作为降低血浆胆固醇药物靶点的应用的制作方法

本发明涉及生物技术和医药技术领域，具体涉及surf4蛋白及其基因作为降低血浆胆固醇药物靶点的应用。

背景技术：

胆固醇(cholesterol)是以环戊烷多氢菲为骨架的27碳化合物，广泛存在于动物体内，是哺乳动物体内含量最丰富的甾醇类分子，是人体的必需组成成分。胆固醇的基本生物学功能包括调节细胞膜的物理化学特性和膜蛋白的构象。胆固醇合成主要发生在肝脏，新产生的胆固醇与甘油三酯组装成极低密度脂蛋白(vldls)分泌到血液中。vldl在血液中转变为低密度脂蛋白(ldls)，与外周组织细胞表面的ldl受体结合并被内吞，发挥其生物学功能。过量的胆固醇能通过转运蛋白外排到细胞外载脂蛋白，形成高密度脂蛋白(hdls)，或者被胆固醇酯化酶酯化形成胆固醇酯储存在脂滴中。这些复杂的过程在多水平上受严密调控，并能感知并响应细胞和机体代谢状态以维持胆固醇代谢平衡。

血浆胆固醇水平与人体健康状况以及心脑血管疾病、神经退行性疾病及肿瘤等疾病的发生密切相关。随着人们生活水平的提高和饮食习惯的改变，由血浆胆固醇水平升高导致的疾病的发生率明显提高。因此，发现对于血浆胆固醇水平具有明显调控作用、可作为药物靶点的基因和蛋白对于降低血浆胆固醇药物的开发具有重要意义。

胆固醇是体内多种激素的合成原料和前体物质，例如：类固醇激素。肾上腺皮质激素(糖皮质激素、盐皮质激素、性激素)是一种重要的类固醇激素，是以胆固醇为原料合成的。肾上腺皮质激素由肾上腺皮质分泌，在糖、脂质和蛋白质代谢、水盐平衡及血压调节、免疫机能、第二性征的发育、多种组织和器官的功能调节等方面不可或缺，是维持生命活动所必需的激素。研究表明，合成类固醇激素的胆固醇约80％从血液中摄取(melmeds,polonskyks,reedlp,etal.williamstextbookofendocrinology[m].13rd,philadelphia:elsevier,2016:490-544；luoj，yangh，songbl.mechanismsandregulationofcholesterolhomeostasis[j].natrevmolcellbiol，2020；21(4):225-245)。在正常情况下类固醇生成细胞更倾向于使用循环中脂蛋白来源的胆固醇来合成类固醇激素，而不是从头合成的胆固醇，同时研究显示肾上腺皮质胆固醇合成关键酶的活性处于极低水平(plumpas，breslowjl，williamsdl.apolipoproteina-iisrequiredforcholesterylesteraccumulationinsteroidogeniccellsandfornormaladrenalsteroidproduction.[j].journalofclinicalinvestigation，1996,97(11):2660-2671.)。因此，开发能够在降低血浆胆固醇的同时，对肾上腺皮质激素合成和分泌的不产生明显影响的药物靶点对于提高药物的安全性、降低其副作用具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种降低血浆胆固醇水平的药物靶点，其为surf4蛋白或其基因。本发明还提供surf4蛋白或其基因作为降低血浆胆固醇药物靶点的应用。

本发明在胆固醇合成和代谢的研究过程中发现，敲除肝脏surf4基因可减少vldl的分泌，使血浆胆固醇水平显著下降，因此，surf4可作为一个有效降低血浆胆固醇水平的潜在药物靶点。而且，敲除surf4基因虽然也可导致肾上腺组织胆固醇总量的明显降低，肾上腺皮质内脂滴的大小及数量均显著下降，但是，肾上腺皮质ldl受体蛋白表达水平显著增加，血浆类固醇激素cort(皮质酮)、ald(醛固酮)、dht(双氢睾酮)的水平仍然维持正常，而且，敲除surf4基因对肾上腺皮质应激反应能力无明显影响。因此，以surf4为靶点的降低血浆胆固醇的药物的安全性较高，surf4可作为降低血浆胆固醇水平的安全药物靶点。

本发明所述的surf4，是货运受体surfeit4(人的surf4蛋白氨基酸序列如seqidno.1所示，小鼠的surf4蛋白氨基酸序列如seqidno.2所示)，是一种存在于内质网膜上的含有7个认定的跨膜结构域的多聚体跨膜蛋白，能促进底物分配入copii有被小泡中，可以介导蛋白质分泌。目前关于surf4的相关底物及其具体的生理功能尚不清楚。本领域技术人员可根据同源比对等方法获得其他动物中的surf4蛋白及其编码基因序列。

具体地，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供surf4蛋白或其编码基因在作为药物靶点中的应用，所述药物具有如下(1)～(4)中至少一种的功能：(1)降低血浆胆固醇含量；(2)降低血脂含量；(3)降低血液粘稠度；(4)预防或治疗动脉粥样硬化、心血管疾病、脑血管疾病、糖尿病、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病、充血性心力衰竭、全身性红斑狼疮、黄斑变性。

第二方面，本发明提供surf4蛋白或其编码基因的如下任一种应用：(1)降低血浆胆固醇含量；(2)降低血脂含量；(3)降低血液粘稠度；(4)预防或治疗动脉粥样硬化、心血管疾病、脑血管疾病、糖尿病、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病、充血性心力衰竭、全身性红斑狼疮、黄斑变性。

第三方面，本发明提供surf4蛋白或其编码基因在制备药物中的应用，所述药物具有如下(1)～(4)中至少一种的功能：(1)降低血浆胆固醇含量；(2)降低血脂含量；(3)降低血液粘稠度；(4)预防或治疗动脉粥样硬化、心血管疾病、脑血管疾病、糖尿病、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病、充血性心力衰竭、全身性红斑狼疮、黄斑变性。

以上所述的药物是通过抑制surf4蛋白的活性或降低其编码基因的转录或表达，来降低血浆胆固醇含量。

优选地，以上所述的药物通过抑制surf4蛋白的活性或降低其编码基因的转录或表达，降低血浆胆固醇含量同时不影响肾上腺皮质激素分泌。

第四方面，本发明提供surf4蛋白或其编码基因的负调控剂的如下任一种应用：(1)降低血浆胆固醇含量；(2)降低血脂含量；(3)降低血液粘稠度；(4)预防或治疗动脉粥样硬化、心血管疾病、脑血管疾病、糖尿病、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病、充血性心力衰竭、全身性红斑狼疮、黄斑变性。

第五方面，本发明提供surf4蛋白或其编码基因的负调控剂在制备药物中的应用所述药物具有如下(1)～(4)中至少一种的功能：(1)降低血浆胆固醇含量；(2)降低血脂含量；(3)降低血液粘稠度；(4)预防或治疗动脉粥样硬化、心血管疾病、脑血管疾病、糖尿病、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病、充血性心力衰竭、全身性红斑狼疮、黄斑变性。

第六方面，本发明提供surf4蛋白或其编码基因作为药物靶点在筛选药物中的应用，所述药物具有如下(1)～(4)中至少一种的功能：(1)降低血浆胆固醇含量；(2)降低血脂含量；(3)降低血液粘稠度；(4)预防或治疗动脉粥样硬化、心血管疾病、脑血管疾病、糖尿病、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病、充血性心力衰竭、全身性红斑狼疮、黄斑变性。

第七方面，本发明提供一种体外筛选药物的方法，包括：以surf4蛋白或其编码基因作为药物的靶点，筛选surf4蛋白或其编码基因的负调控剂作为候选药物；所述药物具有如下(1)～(4)中至少一种的功能：(1)降低血浆胆固醇含量；(2)降低血脂含量；(3)降低血液粘稠度；(4)预防或治疗动脉粥样硬化、心血管疾病、脑血管疾病、糖尿病、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病、充血性心力衰竭、全身性红斑狼疮、黄斑变性。

本发明所述的surf4蛋白或其编码基因的负调控剂为能够抑制surf4蛋白的活性或降低其编码基因的转录或表达的物质。

优选地，所述surf4蛋白或其编码基因的负调控剂包括靶向surf4蛋白或其编码基因的干扰rna、grna、核酸适配体、蛋白类抑制剂、化合物抑制剂或组合物类抑制剂。

本发明采用crispr/cas9技术实现了小鼠surf4基因的肝脏特异性敲除，crispr/cas9技术中使用的grna可作为surf4蛋白或其编码基因的负调控剂。

以上体外筛选药物的方法中，判断药物是否可抑制surf4蛋白活性或surf4基因转录或表达水平可采用现有技术进行，例如提供正常表达surf4基因的细胞，在待测药物或携带待测药物的载体存在的情况下培养所述细胞，检测surf4基因的转录或表达水平是否发生变化。

第八方面，本发明提供一种药物，其包含surf4蛋白或其编码基因的负调控剂；所述药物具有如下(1)～(4)中至少一种的功能：(1)降低血浆胆固醇含量；(2)降低血脂含量；(3)降低血液粘稠度；(4)预防或治疗动脉粥样硬化、心血管疾病、脑血管疾病、糖尿病、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病、充血性心力衰竭、全身性红斑狼疮、黄斑变性。

本发明所述的动脉粥样硬化、心血管疾病、脑血管疾病、糖尿病、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病、充血性心力衰竭、全身性红斑狼疮、黄斑变性优选是由血浆胆固醇水平升高引起的疾病。

本发明的有益效果在于：

本发明发现敲除surf4基因可减少vldl的分泌，使血浆胆固醇水平显著下降，在小鼠模型验证中，与对照小鼠相比，surf4基因肝脏特异性敲除小鼠的血浆胆固醇水平下降了80％以上。因此，surf4可作为一个有效降低血浆胆固醇水平的潜在药物靶点。

而且，敲除surf4基因后肾上腺皮质通过其代偿能力(包括肾上腺皮质胆固醇摄取能力增强和肾上腺皮质脂滴体积及数量降低)使其维持正常的生理功能和应激反应能力。在小鼠模型验证中，与对照小鼠相比，surf4基因肝脏特异性敲除小鼠的肾上腺皮质内脂滴的体积及数量显著降低，肾上腺皮质ldl受体蛋白表达水平显著增加，肾上腺类固醇激素合成相关基因的mrna相对表达量无显著差异，hmgcr、srebp2的表达量无显著差异，血浆类固醇激素cort(皮质酮)、ald(醛固酮)、dht(双氢睾酮)水平也无显著差异。因此，surf4可作为降低血浆胆固醇的安全药物靶点，用于降低血浆胆固醇的药物的筛选，为降低血浆胆固醇的药物和血浆胆固醇水平升高引起疾病的预防和治疗提供新思路。

附图说明

图1为本发明实施例1中surf4基因肝脏特异性敲除的基因结构示意图和敲除小鼠的鉴定结果图，其中，a为surf4基因肝脏特异性敲除的基因结构示意图；b为westernblot检测surf4lko小鼠肝细胞的surf4；c为westernblot检测surf4lko小鼠肝细胞和其他组织的surf4。

图2为本发明实施例2中surf4基因肝脏特异性敲除对小鼠血浆胆固醇含量的影响检测结果，其中，a为血浆tc的检测结果；b为血浆tg的检测结果。

图3为本发明实施例2中人肝癌衍生细胞系hepg2和huh7细胞中的surf4基因、apob100蛋白和apoa-i蛋白的表达水平检测；其中，a为敲低surf4基因在人源肝肿瘤细胞系中的表达后，细胞中surf4、转铁蛋白受体(tfr)、载脂蛋白b和a-i的蛋白表达水平；b为敲低surf4基因在人源肝肿瘤细胞系中的表达后，培养基中白蛋白(alb)、载脂蛋白b和a-i等的蛋白表达水平；scram代表未敲除的对照细胞，surf4-1和surf4-2分别代表敲除细胞，tfr代表转铁蛋白受体，alb代表白蛋白。

图4为本发明实施例3中surf4基因肝脏特异性敲除对小鼠肾上腺组织形态的影响，其中，a为肾上腺的宏观观察图；b为肾上腺组织的h&e染色观察结果；c为肾上腺组织的油红o染色观察结果；flox代表surf4^flox小鼠，lko代表surf4^lk小鼠，×200、×400分别代表放大倍数。

图5为本发明实施例4中surf4基因肝脏特异性敲除对小鼠类固醇激素水平的影响，其中，flox代表surf4^flox小鼠，lko代表surf4^lk小鼠，male代表雄性小鼠，female代表雌性小鼠，ns代表不具有统计学意义的显著性差异，cort和ald检测的n＝6，dht检测的n＝8。

图6为本发明实施例5中surf4基因肝脏特异性敲除对小鼠肾上腺皮质激素合成功能的影响，其中，a～e分别为star、cyp11a1、cyp11b1、cyp11b2、cyp21a1的mrna相对表达水平(n＝4)，flox代表surf4^flox小鼠，lko代表surf4^lk小鼠，ns代表不具有统计学意义的显著性差异。

图7为本发明实施例6中surf4基因肝脏特异性敲除对小鼠肾上腺组织tc、fc及ce水平的影响，其中，a、b、c分别为tc、fc及ce水平，flox代表surf4^flox小鼠，lko代表surf4^lk小鼠，****p<0.0001,**p<0.01。

图8为本发明实施例7中surf4基因肝脏特异性敲除对小鼠肾上腺皮质胆固醇代谢的影响，其中，a为ldlr,hmgcr和srebp2的mrna相对表达水平(n＝4)，b为ldlr,hmgcr和srebp2的蛋白相对表达水平(n＝4)，flox代表surf4^flox小鼠，lko代表surf4^lk小鼠，*p<0.05,***p<0.001，ns代表不具有统计学意义的显著性差异。

图9为本发明实施例8中surf4基因肝脏特异性敲除对小鼠肾上腺皮质应激反应能力的影响，在冷刺激后不同时间点检测cort的含量(n＝4)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，其中，he染色试剂盒、饱和油红o染色液购自北京索莱宝科技有限公司；mousecortelisakit、mousealdelisakit、mousedhtelisakit购自上海酶联生物科技有限公司；总胆固醇含量测定试剂盒、游离胆固醇含量测定试剂盒购自齐一生物科技有限公司；ldlr、hmgcr、srebp2抗体购自abcam公司；β-actin抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；辣根酶标记山羊抗兔igg购自北京中山金桥生物技术有限公司；rnapreppuretissuekit购自天根生化科技(北京)有限公司；easyquickrtmastermix购自康为世纪生物科技有限公司；topgreenqpcrsupermix购自北京全式金生物技术有限公司。pcr所用引物由上海生工生物工程股份有限公司根据设计合成。

以下实施例的实验结果数据采用graphpadprism软件(7.0版本)进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，采用student’st检验分析两组间差异。以p<0.05为差异有统计学意义。实验重复至少3次。

实施例1surf4基因肝脏特异性敲除小鼠的构建

委托百奥赛图(北京)公司采用flox-cre技术制备surf4基因肝脏特异性敲除小鼠(lko)，具体方法如下：

surf4基因的外显子2通过crispr-case9与loxp位点两侧相连(图1的a)。基因分型结果显示，纯合子surf4^flox小鼠的pcr产物大小大于野生型小鼠，而杂合子surf4^flox小鼠的pcr产物大小既有大的条带，也有小的条带进一步确认loxp位点的存在。鉴于pcsk9主要由肝细胞分泌，在肝细胞特异性白蛋白(alb)启动子的控制下，将表达cre重组酶的surf4^flox(surf4^{flox++/cre-/-})小鼠与表达cre重组酶的小鼠杂交，产生surf4肝脏特异性敲除小鼠(surf4lko/surf4^flox++/cre++)。cre介导的重组删除了整个外显子2，该外显子从phe17到leu78移除了氨基酸残基，并在thr79处引起了移码，这在gln16之后引入了6个氨基酸残基(lavfwc)以及1个终止密码子(图1的a)。

westernblot结果显示surf4蛋白在surf4lko小鼠的肝细胞中基本上无法检测到(图1的b)。surf4基因在surf4lko小鼠肝脏中也未检测到，但在surf4flox小鼠的肝脏中(图1的b)和surf4lko小鼠的其他组织(图1的c)可以检测到。

在肝细胞特异性白蛋白启动子的控制下，通过将surf4^flox小鼠与表达cre重组酶的小鼠杂交，产生surf4肝脏特异性敲除小鼠将其命名为surf4^lko小鼠。

surf4^lko小鼠和surf4^flox小鼠均于山东第一医科大学动脉粥样硬化研究所繁育，繁育至14～16周龄时取血并取材。小鼠实验动物均在12小时明/暗循环，温、湿度可控的环境中饲养。所有动物实验均已通过山东第一医科大学实验动物伦理委员会批准(编号2015009)，并遵循国家动物关怀和使用指南进行操作。

以下实施例中，以surf4^lko小鼠作为surf4基因敲除的动物模型，通过观察surf4^lko小鼠的血浆胆固醇水平、肾上腺皮质的组织形态、分泌功能、类固醇激素合成能力以及胆固醇代谢的变化，分析surf4在血浆胆固醇水平调控中的作用及其对肾上腺皮质功能的影响；进一步通过构建小鼠急性冷应激模型，探究surf4基因肝脏特异性敲除对小鼠肾上腺皮质应激反应能力的影响。

实施例2surf4基因肝脏特异性敲除对小鼠血浆胆固醇含量的影响

1、血浆胆固醇含量测定

用酶试剂盒分析血浆甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)、hdl-c和非hdl-c。

结果显示，在14周龄时，雄性和雌性纯合子surf4lko小鼠的血浆tc和tg水平显著降低，降低幅度分别达到80％和35％左右(图2)。结果表明，肝脏surf4在调节血浆胆固醇和甘油三酯水平方面起着重要作用。

2、surf4影响血脂水平的机制

surf4是位于内质网出口位置13的货物接收器，但是，尚不知晓surf4如何影响血脂(血浆胆固醇和甘油三酯)水平。

为分析surf4影响血脂水平的机制，进一步敲除了人肝癌衍生细胞系hepg2和huh7细胞中的surf4基因。结果如图3所示，两个surf4sirnas有效地降低了surf4的水平，surf4的敲除降低了培养基中apob100的水平，但没有降低apoa-i或白蛋白的水平，这表明surf4促进了hepg2和huh7细胞中apob100的分泌，进而调节血浆胆固醇和甘油三酯水平。

实施例3surf4基因肝脏特异性敲除对小鼠肾上腺组织形态的影响

1、肉眼观察

对照组surf4^flox小鼠肾上腺呈类圆形，乳白色，直径约1mm，而surf4^lko小鼠肾上腺呈红色，大小、形态与正常肾上腺无明显区别(图4的a)

2、组织学染色

将新鲜肾上腺组织用oct包埋，切成8μm厚度用于h&e染色，10μm厚度用于油红o染色；将切片固定于10％福尔马林中10min；进行常规h&e染色和油红o染色。

h&e染色观察结果：对照组surf4^flox小鼠肾上腺皮质内有较多空泡状结构，而surf4^lko小鼠肾上腺皮质中空泡状结构显著减少(图4的b)。

油红o染色观察结果：对照组surf4^flox小鼠肾上腺皮质橘黄色脂质成分丰富，脂滴形状呈大小不一的球形，而surf4^lko小鼠肾上腺皮质脂质成分较少，脂滴形状较小，呈点状(图4的c)。

实施例4surf4基因肝脏特异性敲除对小鼠肾上腺皮质激素分泌水平的影响

采用elisa法检测surf4^lk小鼠和surf4^flox小鼠生理状态血浆类固醇激素cort、ald、dht水平：对14～16周龄小鼠取血，血液静置15min后，于室温以3000×g离心10min，收集血浆(上清)，按照上海酶联生物elisa试剂盒操作流程对血浆cort、ald、dht的水平进行检测，采用全自动酶标仪在450nm波长处测得各孔吸光度值(od值)，通过标准曲线计算血浆中各激素浓度。

结果如图5所示，surf4^lko小鼠血浆cort、ald及dht的水平与对照组surf4^flox小鼠相比无明显差别(p>0.05)。

实施例5surf4基因肝脏特异性敲除对小鼠肾上腺皮质激素合成功能基因表达的影响

以gapdh为内参，采用qrt-pcr检测surf4^lk小鼠和surf4^flox小鼠的类固醇激素合成相关酶mrna相对表达量。qrt-pcr的方法如下：

rnapreppuretissuekit提取雄性小鼠双侧肾上腺组织的总rna，采用分光光度测定提取的rna浓度。采用康为世纪easyquickrtmastermix，参照其说明书将rna逆转录成cdna。采用全式金topgreenqpcrsupermix，按照其说明书配制反应体系，所用引物的序列如表1所示。反应条件为：首先94℃3min；然后94℃30s，60℃15s，72℃10s(40个循环)；最后95℃1min，55℃30s，95℃30s。反应结束后，根据扩增曲线、ct值、熔解曲线等分析结果，通过2^-δδct法计算目的基因mrna的相对表达量。

表1引物序列

结果如图6所示，surf4^lko小鼠肾上腺皮质激素合成早期阶段限速酶star和cyp11a1的mrna相对表达量与对照组surf4^flox小鼠无明显变化(p>0.05)；皮质激素合成方向酶cyp21a1和cyp11b1的mrna相对表达量较对照组surf4^flox小鼠无明显变化(p>0.05)；醛固酮合成的关键酶cyp11b2的mrna相对表达量较对照组surf4^flox小鼠无明显变化(p>0.05)。

实施例6surf4基因肝脏特异性敲除对小鼠肾上腺组织tc、fc及ce水平的影响

利用试剂盒酶法对surf4^lk小鼠和surf4^flox小鼠肾上腺组织的tc和fc进行检测，具体方法如下：

在异丙醇中将雄性小鼠肾上腺组织研磨成匀浆液，以10000×g，4℃离心10min，取5μl上清液用于bca法蛋白定量，剩余上清液按照总胆固醇/游离胆固醇含量测定试剂盒说明书的要求，对提取液进行酶学测定。采用全自动酶标仪在500nm波长处测得各孔吸光度值(od值)，通过标准曲线计算血浆中各样品浓度，用蛋白的浓度来矫正tc或fc的含量，tc与fc的差值即为ce的含量。

结果如图7所示，surf4^lko小鼠肾上腺组织tc水平较对照组surf4^flox小鼠下降约85％(p<0.0001)，fc水平较对照组surf4^flox小鼠肾上腺下降90.3％(p<0.0001)，ce水平较对照组surf4^flox小鼠肾上腺降低约69.9％(p<0.05)。

实施例7surf4基因肝脏特异性敲除对小鼠肾上腺皮质胆固醇代谢基因表达的影响

采用qrt-pcr检测surf4^lk小鼠和surf4^flox小鼠的肾上腺皮质胆固醇代谢基因的表达量，具体方法参考实施例5，所用引物序列如表1所示。

结果如图8的a所示，surf4^lko小鼠hmgcr的mrna相对表达量较对照组surf4^flox小鼠增加(p<0.05)，ldlr及srebp2的mrna水平较对照组surf4^flox小鼠差异无统计学显著性差异(p>0.05)。

采用westernblot分析surf4^lk小鼠和surf4^flox小鼠的肾上腺皮质胆固醇代谢基因的表达量，具体方法如下：

采用ripa裂解液提取雄性小鼠肾上腺组织总蛋白，bca法蛋白定量，并加入5×上样缓冲液，98℃变性5min。等量的各组总蛋白经sds-page分离并电转至pvdf膜上，经10％脱脂奶粉封闭1h后，分别用兔多克隆抗体ldlr、hmgcr、srebp2、β-actin(1:1000)于4℃孵育过夜，1×tbs-t洗膜3次，每次10min，再与相应辣根过氧化物酶标记的ii抗室温孵育1h。以β-actin作为内参照。增强型化学发光法显色，应用tanon5200全自动化学发光图像分析系统进行图像采集。各蛋白条带积分吸光度(integralabsor-bance，ia)值采用image-proplus软件分析，并以靶蛋白ia值/β-actinia值的比值反映靶蛋白的相对水平，进行统计学分析。

westernblot检测结果如图8的b所示，surf4^lko小鼠肾上腺ldlr蛋白表达较对照组surf4^flox小鼠显著增加(p<0.001)，hmgcr及srebp2蛋白水平较对照组surf4^flox小鼠无明显变化(p>0.05)。

实施例8surf4基因肝脏特异性敲除对小鼠肾上腺皮质应激反应能力的影响

给予小鼠4℃的急性寒冷刺激建立小鼠的寒冷应激模型，检测surf4^lko小鼠肾上腺皮质的应激功能，具体方法如下：

将饲养于24℃的16周龄体重相近的surf4^flox小鼠和surf4^lko小鼠给予尾静脉取血约100μl，然后将其置于4℃层析柜中给予寒冷刺激3h。在此期间持续对比观察两组小鼠的一般情况、精神状态、活动状况，并于寒冷刺激的0.5h、1.5h、3h对小鼠取血，每次取血量约100μl。3000×g室温离心10min，分离血浆，采用上海酶联生物elisa试剂盒检测寒冷应激0h、0.5h、1.5h、3h的小鼠血浆cort水平。

结果显示，对照组surf4^flox小鼠受到寒冷刺激后血浆皮质激素cort水平开始迅速上升，于刺激的0.5-1.5小时到达高峰，而后逐渐下降，于刺激的2-3小时恢复至正常水平。以上血浆cort的变化为小鼠发生应激反应的正常表现，这提示4℃的寒冷刺激使对照组小鼠表现出了正常的应激反应能力。给予相同寒冷刺激条件的surf4^lko小鼠的血浆cort的变化趋势与对照组surf4^flox小鼠相比几乎完全一致(图9)。此外在寒冷刺激的过程中两组小鼠的表现相似，均表现为活动量较刺激前减少，大多数时间保持蜷缩静止状态，并伴有寒战，小鼠的精神状态随刺激时间的延长逐渐变差。

综合以上各实施例的实验结果可知，本发明通过构建surf4基因肝脏特异性敲除(surf4^lko)小鼠模型，发现抑制肝脏surf4基因可以减少vldl的分泌，使血浆胆固醇水平降低约80％。为探究surf4基因抑制所致的血浆胆固醇水平的显著降低是否会损害肾上腺皮质激素的分泌，对surf4^lko小鼠的肾上腺组织形态、类固醇激素分泌水平、肾上腺皮质激素合成能力及胆固醇代谢、肾上腺皮质的应激反应能力等进行了进一步分析。

对肾上腺组织的形态学研究发现，对照组小鼠肾上腺组织肉眼观呈现乳白色，he染色及油红o染色染色提示肾上腺皮质中分布有丰富的脂滴。该形态特征与肾上腺皮质活跃的类固醇激素分泌的生理功能密切相关。而surf4^lko小鼠肾上腺组织肉眼观呈现红色，he染色及油红o染色提示肾上腺皮质内脂滴的大小及数量均显著下降。作为肾上腺皮质胆固醇的主要来源，血液中的胆固醇的显著下降，造成了surf4^lko小鼠肾上腺组织胆固醇总量的明显降低，这些胆固醇一部分被用于合成类固醇激素满足基本的生命活动，而剩余的以胆固醇酯形式储存于脂滴中的胆固醇因此减少，从而解释了为何肾上腺组织形态学上脂滴减少及肉眼观颜色的改变。此外试剂盒法对肾上腺组织胆固醇含量的检测结果与形态学观察结果相一致，再次验证了surf4^lko小鼠肾上腺组织胆固醇含量显著降低。

虽然肾上腺皮质本身可以通过3-羟基3-甲基戊二酰辅酶a还原酶(hmg-coareductase，hmgcr)合成胆固醇，但是动物及人体的研究均显示脂蛋白来源的胆固醇是生理情况下类固醇合成的首选底物(millerwl.disordersintheinitialstepsofsteroidhormonesynthesis[j].steroidbiochemmolbiol.2017；165(pta):18-37；ouweneelab，vandsrj，nahonje,etal.simvastatintreatmentaggravatestheglucocorticoidinsufficiencyassociatedwithhypocholesterolemiainmice[j].atherosclerosis,2017；261:99-104；[10]plumpas,breslowjl,williamsdl.apolipoproteina-iisrequiredforcholesterylesteraccumulationinsteroidogeniccellsandfornormaladrenalsteroidproduction.[j].journalofclinicalinvestigation，1996，97(11):2660-2671；balasubramaniams，goldsteinjl，faustjr，etal.lipoprotein-mediatedregulationof3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeareductaseactivityandcholesterylestermetabolismintheadrenalglandoftherat.[j].journalofbiologicalchemistry,1977,252(5):1771-1779；gwynnejt.theroleoflipoproteinsinsteroidogenesisandcholesterolmetabolisminsteroidogenicglands[j].endocrinereviews,1982,3(3):299-329.)。因此血浆胆固醇水平过低理论上可能影响肾上腺皮质的分泌功能。并且已有关于血浆胆固醇来源不足(例如原发性低胆固醇血症和胆固醇受体缺陷疾病)造成肾上腺皮质分泌功能受损的报道(illingworthdr,kennyta,orwolles.adrenalfunctioninheterozygousandhomozygoushypobetalipoproteinemia[j].jclinendocrinolmetab.1982；54(1):27-33；hoekstram,vaneckm,korporaalsja.geneticstudiesinmiceandhumansrevealnewphysiologicalrolesforthehigh-densitylipoproteinreceptorscavengerreceptorclassbtypei[j].currentopinioninlipidology,2012,23(2):127-132.)。本发明发现，surf4^lko小鼠血浆类固醇激素cort、ald、dht水平均较正常小鼠无明显变化，提示surf4^lko小鼠肾上腺皮质激素的基础产量是正常的。本发明通过对肾上腺皮质激素合成相关酶的转录水平的检测，进一步证明了surf4^lko小鼠肾上腺皮质类固醇激素的合成功能是正常的。以上结果表明在生理状态下surf4^lko小鼠肾上腺皮质能够维持其正常的分泌功能。

当血液中的胆固醇处在较低水平时，肾上腺皮质通过代偿的方式增加细胞内游离胆固醇的含量，以保证激素合成原料的充足。据文献报道类固醇合成原料游离胆固醇获取的可能途径有三条，其一是从血浆脂蛋白中获取，其二是从肾上腺皮质的从头合成途径中获得，其三是分解储存于脂滴中的胆固醇酯，其中血液中的脂蛋白是类固醇激素合成最主要的胆固醇来源(balasubramaniams,goldsteinjl,faustjr,etal.lipoprotein-mediatedregulationof3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeareductaseactivityandcholesterylestermetabolismintheadrenalglandoftherat.[j].journalofbiologicalchemistry,1977，252(5):1771-1779.)。本发明中surf4^lko小鼠的肾上腺皮质ldl受体蛋白表达水平显著增加，提示肾上腺皮质胆固醇摄取反应加强。surf4^lko小鼠肾上腺srebp2在mrna及蛋白水平均无明显变化，hmgcr的mrna表达升高而蛋白水平无变化，提示肾上腺皮质胆固醇合成反应在转录水平增加。此外surf4^lko小鼠肾上腺皮质内胆固醇酯含量的降低及形态学脂滴的减少，提示胆固醇酯水解利用率增加或剩余游离胆固醇减少导致其酯化储存率的下降的可能。总之，血浆胆固醇低水平的surf4^lko小鼠的肾上腺皮质可能通代偿性地增强其胆固醇的摄取能力、激活hmgcr、增加胆固醇酯的利用率或减少游离胆固醇酯化来满足激素合成对胆固醇原料的需求。

应激反应是机体在受到各种伤害性的躯体或神经刺激时的一种非特异性防御反应，应激刺激的种类很多，包括惊恐、创伤、急性感染、紧张、寒冷、高温等等，不同类型的刺激造成的神经内分泌反应效应不同，但是所有的应激反应均激活下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal，hpa)轴，引起肾上腺分泌类固醇激素。寒冷应激作为应激的一种，会改变动物机体的稳态，进而引起全身非特异性反应。研究表明动物受到寒冷刺激时，hpa轴激活，下丘脑室旁核的小细胞神经元促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropinreleasinghormone，crh)合成和分泌增加，crh经垂体门脉系统到达垂体，促使其分泌促肾上腺皮质激素(adreno-cortico-tropic-hormone，acth)，acth作用于肾上腺皮质，促进胆固醇的摄取及糖皮质激素的合成(shoream,karamitria,kempp,speakmanjr,grahamns,lomaxmacold-inducedchangesingeneexpressioninbrownadiposetissue,whiteadiposetissueandliver.plosone.2013jul22；8(7):e68933.doi:10.1371)。糖皮质激素在应激中既可以改变机体对应激刺激的反应还能还改变生物体对后续应激刺激的反应，有助于适应长期的应激刺激(sapolskyrm,romerolm,munckau.howdoglucocorticoidsinfluencestressresponsesintegratingpermissive,suppressive,stimulatory,andpreparativeactions[j].endocrrev,2000；21(1):55-89.)。小鼠对温度变化反应敏感，据报道相较他刺激，寒冷刺激能使小鼠产生相对较高的皮质酮(palmabd,sucheckid,tufiks.differentialeffectsofacutecoldandfootshockonthesleepofrats[j].brainresearch,2000,861(1):97-104.)。因此本发明通过给予小鼠4℃寒冷刺激来探究surf4^lko小鼠肾上腺皮质的应激反应能力。本发明发现surf4^flox小鼠及surf4^lko小鼠受到寒冷刺激后激素水平均在短时间内升高，说明两组肾上腺皮质对寒冷刺激均迅速产生反应。而且surf4^lko小鼠受到寒冷刺激的表现以及刺激后激素的产量及先升高后下降的趋势均较正常小鼠无明显差别。以上结果说明surf4^lko小鼠肾上腺皮质的应激反应能力与对照组小鼠无明显区别，surf4基因肝脏特异性敲除对小鼠肾上腺皮质的生理功能及应激反应能力无明显影响。

综上所述，本发明发现surf4基因肝脏特异性敲除使小鼠的血浆胆固醇含量锐减80％以上，同时，小鼠肾上腺皮质脂滴体积及数量降低，肾上腺组织胆固醇总量明显降低，但肾上腺皮质ldl受体蛋白表达水平显著增加，而肾上腺分泌到血浆中的类固醇激素水平维持正常。本发明实验结果证明，surf4基因肝脏特异性敲除可有效降低血浆胆固醇含量，并使得肾上腺组织的胆固醇储备下降，但肾上腺会通过增强摄取血浆胆固醇的能力，得到合成底物，并分泌类固醇激素，以维持血浆肾上腺激素在正常水平；即使在冷刺激状态下肾上腺组织也可以保持应激反应能力，分泌适量的激素到血浆，即surf4基因肝脏特异性敲除后，肾上腺皮质组织通过其强大的代偿能力使其维持正常生理功能。因此，surf4基因可作为降低血浆胆固醇水平的安全药物靶点。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>山东第一医科大学（山东省医学科学院）

<120>surf4蛋白及其基因作为降低血浆胆固醇药物靶点的应用

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65707580

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