一种用于骨/软骨修复的仿生定向双层水凝胶的制备方法与流程

本发明涉及生物材料制备技术领域，具体涉及一种用于骨/软骨修复的仿生定向双层水凝胶的制备方法。

背景技术：

骨和软骨较弱的自修复与再生能力导致临床上的关节骨/软骨损伤修复还存在问题，而人工骨/软骨移植治疗方法由于其生物活性差、与骨组织的结合力弱等问题达不到理想的治疗效果。此外，上层软骨组织具有各项异性，下层骨组织具有高的力学强度，这就使得软骨与骨的组织界面具有明显区别，骨与软骨的不同特性使得很难找到一种材料能同时促进软骨和骨组织生长。因此，寻找到一种在能模仿软骨的定向生长结构同时又能具有骨的高强度性能的材料对于促进骨/软骨一体化修复具有重大意义。

水凝胶凭借其高含水量及力学可控的优势，能够模拟天然的生物组织，为细胞生长和组织长入提供了良好的环境。另外，还可通过一种或多种单体共聚，以及各种功能型纳米材料的填充，制备成多种多功能的水凝胶以满足不同组织修复的要求。纤维素纳米晶作为一种具有高力学强度和高生物相容性的天然高分子材料，其固有的剪切变稀性使其能够通过简单的挤压从而定向排列，同时纤维素纳米晶也可以作为载体负载生物活性材料。纤维素纳米晶的这些特性启发我们制备一种用于骨/软骨修复的仿生定向双层水凝胶，从而实现骨/软骨的一体化修复。

技术实现要素：

本发明针对现有技术存在的问题提供一种基于具有各向异性，良好生物相容性，可用于骨/软骨修复的仿生定向双层水凝胶的制备方法。

本发明采用的技术方案是：

一种用于骨/软骨修复的仿生定向双层水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：聚多巴胺修饰的纤维素纳米晶(pda-cnc)的制备：

通过酸解法制备纤维素纳米晶，再将纤维素纳米晶配成一定质量分数的溶液；然后向其中加入多巴胺，并保持溶液碱性，搅拌，使得多巴胺在纤维素纳米晶表面自聚合形成聚多巴胺涂层，反应结束后，反复离心、清洗，得到的沉淀物即为聚多巴胺修饰的纤维素纳米晶(pda-cnc)；

步骤2：软骨生长因子接枝的纤维素纳米晶的制备：

将步骤1制备的pda-cnc分散在水溶液中，形成一定浓度的纤维素纳米晶溶液，向其中加入一定浓度的转化生长因子，通过聚多巴胺的粘附性，将生长因子固定在纤维素纳米晶表面，搅拌一段时间后，得到诱导软骨再生因子接枝纤维素纳米晶溶液a；

步骤3：羟基磷灰石原位矿化的纤维素纳米晶的制备：

将步骤1制备的pda-cnc分散在水溶液中，形成一定浓度的纤维素纳米晶溶液，向其中加入一定浓度的磷酸盐和钙盐在碱性条件下反应一段时间后，离心，沉淀，通过聚多巴胺的原位诱导得到在纤维素纳米晶表面原位矿化的羟基磷灰石(cap-cnc)，并将其分散在去离子水中得到溶液b；

步骤4：添加相同质量的生物相容性良好的天然高分子到溶液a和溶液b中，搅拌一段时间后添加一定浓度的交联剂，搅拌均匀后，分别得到上层水凝胶预聚液和下层水凝胶预聚液；

步骤5：将下层高强度水凝胶预聚液置入模具中，然后将上层水凝胶预聚液缓慢挤压至下层高强度水凝胶预聚液表面，使得上层中软骨生长因子接枝的纤维素纳米晶在注射过程中定向，在一定温度静置一段时间后，即可制备出仿生定向双层水凝胶。

进一步的，所述步骤1中纤维素纳米晶溶液浓度为20～50mg/ml。

进一步的，所述步骤1中加入多巴胺含量5～50mg/ml，溶液ph为7.5～11。

进一步的，所述步骤2中所加入的软骨生长因子为转化生长因子(tgf-β)，胰岛素样生长因子-1(igf-1)，碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、肝细胞生长因子(hgf)及血小板衍生生长因子(pdgf)中的一种或者几种的组合，其含量为5～50ng/ml。

进一步的，所述步骤3中磷酸盐的含量为50～200mg/ml，钙盐的含量为150～600mg/ml，其中磷酸盐与钙盐的比例为1：3。

进一步的，所述步骤4中生物相容性良好的天然高分子为明胶、透明质酸、海藻酸钠、硫酸软骨素、胶原、壳聚糖、丝素、琼脂中的一种或者几种的组合，其含量为10～100mg/ml。

本发明最终制备的仿生水凝胶为双层结构，其中上层仿生软骨定向水凝胶占比为50％，其中具有定向结构的带负电高分子(硫酸软骨素、透明质酸)修饰的纤维素纳米晶组分含量3wt.％～10wt.％；下层仿生高强度骨水凝胶占比为50％，其中原位矿化的羟基磷灰石修饰的纤维素纳米晶组分含量为7.5wt.％～30wt.％,整个双层水凝胶中明胶组分含量为5wt.％～40wt.％。

本发明的有益效果是：

1.本发明制备的上层定向水凝胶以天然高分子网络为基体，以生长因子接枝的纤维素纳米晶为纳米填充物。纤维素纳米晶固有的剪切变稀特性，使得水凝胶预聚液在注射的过程中，其中的纤维素纳米晶在水凝胶基体中发生定向排列定向。所制备的上层水凝胶从结构上模拟软骨组织，且在复合纤维纳米晶后具有良好的力学性。另外将具有软骨诱导活性的生长因子通过聚多巴胺锚定在纤维素纳米晶表面，从而使得生长因子能够从水凝胶基体中缓慢释放，实现诱导软骨再生的目的。

2.本发明制备的下层高强度水凝胶以羟基磷灰石原位矿化修饰的纤维素纳米晶复合材料作为网络填充物，复合材料的纳米填充增强效果能使水凝胶具有与骨组织类似的力学强度，而且羟基磷灰石能够诱导和促进骨生长。

3.本发明制备的仿生定向双层水凝胶，具有全生物降解性，并且通过不同的网络填充物能够同时调节同一种水凝胶内部结构、组分、与力学性能，从而同时满足促进软骨和骨组织的再生的需求，为实现关节骨和软骨缺损的一体化修复提供了一种可能。

附图说明

图1为本发明制备的用于骨/软骨修复的仿生定向双层水凝胶的结构示意图。

具体实施方式

参照图1及具体实施例对本发明做进一步说明：

在图1中，上层水凝胶1为仿生软骨定向结构，这是由纤维素纳米晶固有的剪切变稀性提供的可定向性，通过简单的注射挤压即可实现水凝胶内纤维素纳米晶的定向排列。下层水凝胶2为仿生高强度骨结构，这是通过聚多巴胺的桥接作用在纤维素纳米晶表面原位矿化形成羟基磷灰石制备出的用于骨修复的纳米颗粒填充的高强度骨。在混合时，上层仿生定向软骨修复预聚液中定向排列的纳米颗粒比下层仿生高强度骨修复预聚液中无序排列的纳米颗粒具有更小的质量，不同的结构排列和溶液密度导致上层预聚液中较轻纳米颗粒不能无限制往下扩散，而下层预聚液中较重纳米颗粒受自身重力影响也不能无限制往上扩散，最终形成能同时仿生定向软骨和高强度骨的双层水凝胶。

下面结具体实施例对本发明做进一步说明：

一种用于骨/软骨修复的仿生定向双层水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：聚多巴胺修饰的纤维素纳米晶(pda-cnc)的制备：

通过酸解法制备纤维素纳米晶，再将纤维素纳米晶配成一定质量分数的溶液；然后向其中加入多巴胺，并保持溶液碱性，搅拌，使得多巴胺在纤维素纳米晶表面自聚合形成聚多巴胺涂层，反应结束后，反复离心、清洗，得到的沉淀物即为聚多巴胺修饰的纤维素纳米晶(pda-cnc)；

步骤2：软骨生长因子接枝的纤维素纳米晶的制备：

将步骤1制备的pda-cnc分散在水溶液中，形成一定浓度的纤维素纳米晶溶液，向其中加入一定浓度的转化生长因子，通过聚多巴胺的粘附性，将生长因子固定在纤维素纳米晶表面，搅拌一段时间后，得到诱导软骨再生因子接枝纤维素纳米晶溶液a；

步骤3：羟基磷灰石原位矿化的纤维素纳米晶的制备：

将步骤1制备的pda-cnc分散在水溶液中，形成一定浓度的纤维素纳米晶溶液，向其中加入一定浓度的磷酸盐和钙盐在碱性条件下反应一段时间后，离心，沉淀，通过聚多巴胺的原位诱导得到在纤维素纳米晶表面原位矿化的羟基磷灰石(cap-cnc)，并将其分散在去离子水中得到溶液b；

步骤4：添加相同质量的生物相容性良好的天然高分子到溶液a和溶液b中，搅拌一段时间后添加一定浓度的交联剂，搅拌均匀后，分别得到上层水凝胶预聚液和下层水凝胶预聚液；

步骤5：将下层高强度水凝胶预聚液置入模具中，然后将上层水凝胶预聚液缓慢挤压至下层高强度水凝胶预聚液表面，使得上层中软骨生长因子接枝的纤维素纳米晶在注射过程中定向，在一定温度静置一段时间后即可制备出仿生定向双层水凝胶。

实施例1

一种用于骨/软骨修复的仿生定向双层水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：配置55wt.％的硫酸溶液200ml，在5℃下加入4g纤维素纳米晶粉末搅拌均匀后50℃水浴锅中密封搅拌2h，将所得溶液抽滤至ph为7后冰浴超声1h，离心保留上清液即为纤维素纳米晶溶液，根据实验需要配成2wt.％的纤维素纳米晶溶液，取20ml纤维素纳米晶溶液加入0.2g多巴胺、1gnaoh,室温搅拌30min待溶液变为黑色后反复离心、清洗得到下层沉淀物即为聚多巴胺修饰的纤维素纳米晶(pda-cnc)；

步骤2:将步骤1制备的pda-cnc取一半分散在10ml离子水中，向其中加入150ng转化生长因子(tgf-β)，搅拌一段时间后，得到诱导软骨再生因子(tgf-β)接枝纤维素纳米晶溶液a,

步骤3：将步骤1制备的pda-cnc取一半分散在10ml离子水中，向其中加入1.5g(nh4)2hpo4和4.5gca(no3)2·4h2o、0.5gnaoh反应1h，反复离心、清洗得到下层沉淀，再将其分散于10ml去离子水中得到在纤维素纳米晶表面原位矿化的羟基磷灰石(cap-cnc)水溶液b。

步骤4：同时添加2g明胶、500ul聚乙二醇二缩水甘油醚、400ul聚乙二醇二丙烯酸酯、200ul浓度为10wt.％的氢氧化钠溶液到溶液a和溶液b中，搅拌10min后制备出上层水凝胶预聚液和下层水凝胶预聚液。

步骤5：将下层高强度水凝胶预聚液置入模具中，然后将上层水凝胶预聚液缓慢挤压至下层高强度水凝胶预聚液表面，使得上层中软骨生长因子接枝的纤维素纳米晶在注射过程中定向，在37℃静置10分钟得到仿生定向双层水凝胶。

实施例2

一种用于骨/软骨修复的仿生定向双层水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：配置55wt.％的硫酸溶液200ml，在5℃下加入4g纤维素纳米晶粉末搅拌均匀后50℃水浴锅中密封搅拌2h，将所得溶液抽滤至ph为7后冰浴超声1h，离心保留上清液即为纤维素纳米晶溶液，根据实验需要配成4wt.％的纤维素纳米晶溶液，取20ml纤维素纳米晶溶液加入0.2g多巴胺、1gnaoh,室温搅拌30min待溶液变为黑色后反复离心、清洗得到下层沉淀物即为聚多巴胺修饰的纤维素纳米晶(pda-cnc)；

步骤2:将步骤1制备的pda-cnc取一半分散在10ml离子水中，向其中加入100ng转化生长因子(tgf-β)，搅拌一段时间后，得到诱导软骨再生因子(tgf-β)接枝纤维素纳米晶溶液a,

步骤3：将步骤1制备的pda-cnc取一半分散在10ml离子水中，向其中加入1g(nh4)2hpo4和3gca(no3)2·4h2o、1gnaoh反应1h，反复离心、清洗得到下层沉淀，再将其分散于10ml去离子水中得到在纤维素纳米晶表面原位矿化的羟基磷灰石(cap-cnc)水溶液b。

步骤4：同时添加1.5g明胶、300ul聚乙二醇二缩水甘油醚、300ul聚乙二醇二丙烯酸酯、200ul浓度为10wt.％的氢氧化钠溶液到溶液a和溶液b中，搅拌10min后制备出上层水凝胶预聚液和下层水凝胶预聚液。

步骤5：将下层高强度水凝胶预聚液置入模具中，然后将上层水凝胶预聚液缓慢挤压至下层高强度水凝胶预聚液表面，使得上层中软骨生长因子接枝的纤维素纳米晶在注射过程中定向，在37℃静置10分钟得到仿生定向双层水凝胶。

实施例3

一种用于骨/软骨修复的仿生定向双层水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：配置55wt.％的硫酸溶液200ml，在5℃下加入4g纤维素纳米晶粉末搅拌均匀后50℃水浴锅中密封搅拌2h，将所得溶液抽滤至ph为7后冰浴超声1h，离心保留上清液即为纤维素纳米晶溶液，根据实验需要配成2wt.％的纤维素纳米晶溶液，取20ml纤维素纳米晶溶液加入0.2g多巴胺、1gnaoh,室温搅拌30min待溶液变为黑色后反复离心、清洗得到下层沉淀物即为聚多巴胺修饰的纤维素纳米晶(pda-cnc)；

步骤2:将步骤1制备的pda-cnc取一半分散在10ml离子水中，向其中加入100ng转化生长因子(tgf-β)，搅拌一段时间后，得到诱导软骨再生因子(tgf-β)接枝纤维素纳米晶溶液a,

步骤3：将步骤1制备的pda-cnc取一半分散在10ml离子水中，向其中加入1.5g(nh4)2hpo4和4.5gca(no3)2·4h2o、1gnaoh反应1h，反复离心、清洗得到下层沉淀，再将其分散于10ml去离子水中得到在纤维素纳米晶表面原位矿化的羟基磷灰石(cap-cnc)水溶液b。

步骤4：同时添加2g明胶、400ul聚乙二醇二缩水甘油醚、300ul聚乙二醇二丙烯酸酯、到溶液a和溶液b中，搅拌10min后制备出上层水凝胶预聚液和下层水凝胶预聚液。

步骤5：将下层高强度水凝胶预聚液置入模具中，然后将上层水凝胶预聚液缓慢挤压至下层高强度水凝胶预聚液表面，使得上层中软骨生长因子接枝的纤维素纳米晶在注射过程中定向，在37℃静置10分钟得到仿生定向双层水凝胶。

实施例4

一种用于骨/软骨修复的仿生定向双层水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：配置55wt.％的硫酸溶液200ml，在5℃下加入4g纤维素纳米晶粉末搅拌均匀后50℃水浴锅中密封搅拌2h，将所得溶液抽滤至ph为7后冰浴超声1h，离心保留上清液即为纤维素纳米晶溶液，根据实验需要配成2wt.％的纤维素纳米晶溶液，取20ml纤维素纳米晶溶液加入0.2g多巴胺、1gnaoh,室温搅拌30min待溶液变为黑色后反复离心、清洗得到下层沉淀物即为聚多巴胺修饰的纤维素纳米晶(pda-cnc)；

步骤2:将步骤1制备的pda-cnc取一半分散在10ml离子水中，向其中加入100ng转化生长因子(tgf-β)，搅拌一段时间后，得到诱导软骨再生因子(tgf-β)接枝纤维素纳米晶溶液a,

步骤3：将步骤1制备的pda-cnc取一半分散在10ml离子水中，向其中加入1.5g(nh4)2hpo4和4.5gca(no3)2·4h2o、1gnaoh反应1h，反复离心、清洗得到下层沉淀，再将其分散于10ml去离子水中得到在纤维素纳米晶表面原位矿化的羟基磷灰石(cap-cnc)水溶液b。

步骤4：同时添加2g明胶、600ul聚乙二醇二缩水甘油醚、600ul聚乙二醇二丙烯酸酯、200ul浓度为10wt.％的氢氧化钠溶液到溶液a和溶液b中，搅拌10min后制备出上层水凝胶预聚液和下层水凝胶预聚液。

步骤5：将下层高强度水凝胶预聚液置入模具中，然后将上层水凝胶预聚液缓慢挤压至下层高强度水凝胶预聚液表面，使得上层中软骨生长因子接枝的纤维素纳米晶在注射过程中定向，在37℃静置10分钟得到仿生定向双层水凝胶。

实施例5

一种用于骨/软骨修复的仿生定向双层水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：配置55wt.％的硫酸溶液200ml，在5℃下加入4g纤维素纳米晶粉末搅拌均匀后50℃水浴锅中密封搅拌2h，将所得溶液抽滤至ph为7后冰浴超声1h，离心保留上清液即为纤维素纳米晶溶液，根据实验需要配成2wt.％的纤维素纳米晶溶液，取20ml纤维素纳米晶溶液加入0.2g多巴胺、1gnaoh,室温搅拌30min待溶液变为黑色后反复离心、清洗得到下层沉淀物即为聚多巴胺修饰的纤维素纳米晶(pda-cnc)；

步骤2:将步骤1制备的pda-cnc取一半分散在10ml离子水中，向其中加入300ng转化生长因子(tgf-β)，搅拌一段时间后，得到诱导软骨再生因子(tgf-β)接枝纤维素纳米晶溶液a,

步骤3：将步骤1制备的pda-cnc取一半分散在10ml离子水中，向其中加入2g(nh4)2hpo4和6gca(no3)2·4h2o、1gnaoh反应1h，反复离心、清洗得到下层沉淀，再将其分散于10ml去离子水中得到在纤维素纳米晶表面原位矿化的羟基磷灰石(cap-cnc)水溶液b。

步骤4：同时添加2g明胶、500ul聚乙二醇二缩水甘油醚、500ul聚乙二醇二丙烯酸酯200ul浓度为10wt.％的氢氧化钠溶液到溶液a和溶液b中，搅拌10min后制备出上层水凝胶预聚液和下层水凝胶预聚液。

步骤5：将下层高强度水凝胶预聚液置入模具中，然后将上层水凝胶预聚液缓慢挤压至下层高强度水凝胶预聚液表面，使得上层中软骨生长因子接枝的纤维素纳米晶在注射过程中定向，在37℃静置10分钟得到仿生定向双层水凝胶。

在本发明的具体实施方式中，采用针筒注射器吸取上层水凝胶预聚液，推动注射器注射到下层水凝胶上，然后待其成胶形成双层水凝胶。但不限于采用上述的针筒注射器，凡是具备相同功能或能实现相同目的装置均可适用于本发明。